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Bit1基因在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测 作者：滑玮，张伟，吕海鹏，辛晓燕【关键词】 凋亡；Bit1基因；酵母菌双杂交；报告基因Expression of Bit1 gene in a yeast twohybrid system and reporter gene activation assay【Abstract】 AIM: To construct a bait vector with Bit1 gene in yeast twohybrid system GAL4, and assay whether Bit1 gene expression product affects the growth of host yeast cells and activates the reporter genes in the yeast twohybrid system. METHODS: The Bit1 gene fragments were amplified by RTPCR from ovarian cell Caov3, and cloned into pUC19 for DNA sequencing. After verified by DNA sequencing, they were subcloned into the bait vector pGBKT7 of yeast twohybrid system GAL4, and the recombinant plasmids were subsequently transferred into yeast cell AH109, and its expression product was tested whether it could activate the reporter genes in the yeast twohybrid system. RESULTS: The Bit1 gene fragments were successfully amplified, and their expression product showed to be nontoxic to AH109 cells, and did not activate the reporter genes of the GAL4 system. CONCLUSION: Yeast twohybrid GAL4 system can be utilized to study Bit1interacting protein.【Keywords】 apoptosis; Bit1; yeast twohybrid system; reporter genes【摘要】 目的：用Bit1基因片段构建酵母双杂交诱饵载体，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法：运用RTPCR技术从卵巢癌细胞系Caov3中扩增出Bit1基因片段，克隆入pUC19质粒，经测序正确后，再克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中，将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果: 成功获得Bit1基因片段，Bit1基因表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性，对报告基因亦无激活作用. 结论：可以利用酵母双杂交Gal4系统来研究与Bit1相互作用的蛋白.【关键词】 凋亡；Bit1基因；酵母菌双杂交；报告基因【中图号】 R7370引言酵母双杂交系统是一种直接在真核细胞内检测蛋白相互作用的方法，具有灵敏度高和特异性好的优点.自1989年由Fields等1提出并初步建立以来，得到了不断的完善和改进，在细胞生物学，肿瘤学，蛋白质组学等诸多领域有着广泛的应用2-3. Jan等4在研究bcl2转录调控的实验中，发现了一种可下调bcl2表达的新基因，并因其功能而命名为Bit1（bcl2 inhibitor of transcription 1）.研究表明，胞浆内Bit1浓度的升高可以明显促进凋亡的发生，而其浓度的降低可以减少凋亡的发生.我们拟利用酵母双杂交GAL4系统，构建Bit1蛋白即诱饵蛋白，以期从人脑cDNA文库中钓取可与之结合的蛋白基因，为研究细胞凋亡的发生和调节提供新的思路和实验依据.1材料和方法1.1材料卵巢癌细胞系Caov3购自中国医科大学细胞生物研究所，表达载体pGBKT7及酵母菌种AH109购自Clontech公司.质粒pUC19由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室张伟博士惠赠. 逆转录酶购自Promega公司；PCR试剂盒，DNA重组所用的限制性内切酶购自Takara公司；T4 DNA连接酶购自Gibco公司；质粒提取试剂盒，DNA电泳胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司；酵母培养基购自Clontech公司.1.2方法1.2.1RTPCR扩增Bit1基因自行设计出克隆Bit1基因的引物.常规培养Caov3细胞，提取细胞总RNA, 加入下游引物和逆转录酶，45各作用30 min进行逆转录,反应条件为：70 10 min, 42 45 min, 95 5 min. 再取逆转录产物加入引物P1和P2扩增Bit1基因.PCR反应条件为：94 30 s, 61 45 s，72 50 s，共进行38个循环.1.2.2RTPCR产物克隆及鉴定纯化的RTPCR产物经EcoR和BamH双酶切，定向克隆入pUC19质粒，转化大肠杆菌DH5，进行蓝白筛选.酶切鉴定出含插入片段的阳性克隆，命名为pUC19Bit1，然后进行序列分析.1.2.3构建及鉴定诱饵载体用EcoR和BamH酶切pUC19Bit1和表达载体pGBKT7，回收Bit1基因及pGBKT7载体片段，载体片段与Bit1基因连接后转化大肠杆菌DH5.经限制性内切酶分析,含正确插入片段的克隆命名为pGBKT7Bit1.1.2.4制备酵母感受态细胞随机挑取几个酵母菌AH109克隆，接种于50 mL YPDA液体培养基中，振荡培养至A600=0.40.5.在室温下将培养液离心，弃上清，重悬沉淀，洗涤酵母细胞.再离心取沉淀，用1.5 mL 1TE/LiAc溶液重悬，即为酵母感受态细胞.1.2.5转化酵母感受态细胞将构建好的诱饵载体，鲱鱼精DNA和酵母感受态细胞，混匀后加入0.6 mL PEG/LiAc溶液.在30振荡培养, 加入DMSO后混匀, 在42水浴15 min, 冰浴2 min,离心, 去上清，以0.5 mL 1TE重悬细胞后，铺于SD/Trp平板.于30培养36 h左右，直至带有诱饵载体的酵母克隆长出.1.2.6HIS3和LacZ报告基因表达的检测用无菌牙签随机挑取酵母菌单个克隆，分别划线于有Trp，Ura，His，Leu营养缺陷的SD平板上，于30培养36 h，观察酵母菌的生长情况. 采用半乳糖苷酶印膜法检测lacZ报告基因的表达.用无菌牙签随机挑取酵母单个克隆，点样于硝酸纤维素滤膜上.将带有酵母克隆的滤膜在液氮中迅速冷冻5 s后，置于室温裂菌.将点有菌体的滤膜面朝上，放在另一张同样大小浸有Z buffer/Xgal的Whatman#1滤纸上，去气泡，于30孵育30 min8 h，观察颜色变化.2结果2.1Bit1基因的扩增采用优化的逆转录方法对人卵巢癌细胞系Caov3总RNA进行逆转录，然后在50 L反应体系中继续扩增反应.取RTPCR扩增产物10 L，在10 g/L琼脂糖凝胶中电泳，可见与预期大小一致的600 bp左右的DNA片段（图1）.2.2重组质粒pUC19Bit1的酶切鉴定及测序用EcoR和BamH双酶切pUC19质粒及PCR产物，回收pUC19载体片段及Bit1蛋白基因片段，连接后获得的重组质粒命名为pUC19Bit1.再用EcoR和BamH对pUC19Bit1质粒进行酶切鉴定（图2）.鉴定正确的pUC19Bit1重组质粒分别作正反向测序，测序结果经与Genbank中的Bit1序列（NM_016077）比较分析表明，扩增得到的Bit1蛋白基因片段与原序列完全相符.图1Bit1基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略）图2重组质粒pUC19bit1 的EcoR I，BamHI双酶切鉴定（略）2.3重组质粒pGBKT7Bit1的酶切分析再分别用EcoR和BamH将Bit1基因片段从质粒pUC19Bit1亚克隆入pGBKT7载体，重组质粒pGBKT7Bit1的酶切鉴定结果(图3).2.4HIS3报告基因表达的检测将含有单纯AH109和含有pGBKT7Bit1质粒的酵母菌AH109单个菌落挑出，分别划线接种于有Ura，Trp，Leu和His营养缺陷的SD平板上，于30培养36 h后, 可见单纯AH109酵母菌只在SD/Ura平板上生长，而含有pGBKT7 Bit1质粒的AH109酵母菌可以在SD/Ura和SD/Trp平板上生长，在SD/His和SD/Leu平板上不生长.2.5LacZ报告基因表达的检测将pCL1质粒转化入AH109作为阳性对照，将pGBKT7 Lams和pGADT7T质粒共转化入AH109作为阴性对照，用半乳糖苷酶印膜法来检测含pGBKT7Bit1质粒的AH109酵母细胞内LacZ报告基因的表达情况.结果显示LacZ报告基因不被Bit1激活.图3重组质粒pGBKT7bit1经EcoRI，BamHI双酶切鉴定（略）3讨论酵母双杂交技术是近十几年来发展起来的研究蛋白质蛋白质相互作用的一种方法，其基本原理是：一些转录激活因子（如酵母的Gal4蛋白和细菌的LexA蛋白），往往由两个在结构上可以分开而在功能上又相互独立的结构域构成，这两个结构域只要在同一细胞内能够彼此靠近，就可以激活下游报告基因的表达5.如果将诱饵蛋白融合到一个结构域上，而将表达文库构建到另一个结构域上，就可以筛选到与诱饵蛋白相互作用蛋白的基因.酵母双杂交Gal4系统3是在系统1和系统2基础上的改进，具有转化效率高，假阳性率低等优点.酵母双杂交技术是目前应用较多的钓取与已知蛋白直接相互作用分子的方法.对于未知功能的蛋白质，如能钓到与之相互作用的已知蛋白，将对其功能的研究具有明确的指导方向.将诱饵蛋白融合到Gal4蛋白的一个结构域上以后，利用此融合蛋白去筛选构建在另一个结构域上的表达文库之前，就必须要验证融合到一个结构域上的诱饵蛋白本身对下游的报告基因有无激活作用，否则便会在cDNA文库筛选时出现假阳性结果.张伟等6就报告用HBV Pres与Pres1构建的酵母系统即有自激活作用，这样便不能直接用于cDNA文库的筛选. 我们用含有Bit1基因的重组质粒转化酵母菌，通过不同方法对报告基因的表达进行检测，结果表明Bit1基因不具有自激活作用，这样我们就可以直接利用Bit1作为诱饵，从人cDNA文库中钓取与其相互作用的蛋白.凋亡是一种程序性细胞死亡，在胚胎发生与组织内环境稳定过程中发挥着重要的作用7. 脱落凋亡(Anoikis)8-9是指细胞与细胞外基质脱粘连而引起的凋亡.整合素与细胞外基质的结合并上调Bcl2基因的表达能够抑制这种凋亡的发生.为了探索细胞内是否存在其他分子参与了Bcl2基因的上调表达以及细胞成活，Jan等4构建了一个特殊的CHO细胞系.该细胞系的特点是，胞膜上的整合素51的胞内部分被截掉，从而阻断了整合素引起的Bcl2基因的上调表达.然后将cDNA文库质粒和bcl2基因启动子控制下的GFP表达质粒共转染该细胞系，以筛选能调节bcl2基因表达的细胞分子.经筛选后获得了5个细胞克隆，其中一个细胞克隆含有的就是bit1基因.Bit1蛋白存在于线粒体中，如果Bit1从线粒体中释放至胞浆，或者在细胞胞浆中表达Bit1蛋白，都可以引起相应细胞的凋亡.利用酵母双杂交技术可以精确有效的发现并研究与Bit1蛋白发生相互作用的分子，对脱落凋亡发生和调节机理的进一步探索有着重要的意义.【参考文献】1 Fields S, Song O. A novel genetic system to detect proteinprotein interactionsJ. Nature, 1989,340:245-246.2 White MA. The yeast twohybrid system: forward and reverseJ. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:10001-10003.3 Gietz RD, Woods RA. Screening for proteinprotein interactions in the yeast twohybrid systemJ. Methods Mol Biol, 2002,185:471-486.4 Jan Y, Matter M, Pai JT, et al. Mitochondrial protein, Bit1, mediates apoptosis regulated by integrins and Groucho/TLE corepressorsJ. Cell, 2004, 116:751-762.5 Luban J, Goff SP. The yeast twohybrid system for studying proteinprotein interactionJ. Curr Opinion Biotechnol, 1995, 6:59-64.6 张伟，刘新平，张，等. 乙型肝炎病毒前S区不同片段在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测J.