细菌内毒素检查法讲稿课件

1,细菌内毒素检查法 2008年12月 郑州,中国药品生物制品检定所 蔡 彤,2,一、背景介绍,热原 细菌内毒素 细菌内毒素检查法反应机理,3,热原,热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质 细胞分裂素（ IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ） 内源性热原 产生细胞分裂素的物质 内毒素热原 外源性热原 非内毒素热原（病毒、细菌、真 菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素）,4,细菌内毒素,细菌内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的组分之一 化学结构 含有3个不同的区域 O-特异侧链 核心多糖 类脂A,5,细菌内毒素,致热性 内毒素作用于人体细胞，使之释放内原 性热原，再刺激下丘脑体温调节中枢， 引起发热反应 耐热性 分子极性 多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性 在水中呈不均匀分布 酸碱性与 强酸强碱水解反应 鲎反应性,6,C因子,活化的C因子,内毒素,活化的B因子,B因子,凝固酶,凝固酶原,凝固蛋白（凝胶）,凝固蛋白原,二价阳离子,(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM,活化的G因子,G因子,细菌内毒素检查法反应机理,能与鲎的血液提取物可发生发生多级酶促反应，形成凝胶,7,细菌内毒素检查法反应机理,在药品生产质量管理规范（GMP）条件下进行药品生产的质量控制，一般可以接受的观点是，不存在内毒素就意味着不存在热原 通过检测内毒素控制药品中的热原,8,Boc-leu-Gly-Arg-PNA （鲎三肽）,活化的C因子,C因子,内毒素,活化的B因子,B因子,显色法,凝胶法，浊度法,凝固酶,凝固酶原,凝固蛋白（凝胶）,凝固蛋白原,9,细菌内毒素检查法定义： 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。,二、细菌内毒素检查法介绍,10,细菌内毒素检查包括： 限量实验 凝胶法 半定量实验 可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。,浊度法 动态浊度法 光度测定法 终点浊度法 显色基质法 动态显色法 终点显色法,二、细菌内毒素检查法介绍,11,细菌内毒素检查 凝 胶 法,12,细菌内毒素检查-凝胶法,1、综述部分 实验原理 实验准备 限值（L）的确定 确定最大有效稀释倍数（MVD）,2、实验部分 鲎试剂灵敏度复核 干扰实验：预实验 正式干扰实验 检 查 法：限量试验 半定量试验,13,C因子,活化的C因子,内毒素,活化的B因子,B因子,凝固酶,凝固酶原,凝固蛋白原,凝固蛋白（凝胶）,二价阳离子,1、凝胶法实验原理,14,37 1下保温反应602分钟 当样品中细菌内毒素的浓度达到或超过鲎试剂的灵敏度时，凝集为坚实凝胶，为阳性，记为“+”。 当样品中细菌内毒素的浓度未达到鲎试剂的灵敏度时，不能凝集为坚实凝胶，为阴性，记为“”。,1、凝胶法实验原理,15,2、凝胶法实验的准备,实验所需物品 细菌内毒素标准物质 细菌内毒素检查用水 凝胶法鲎试剂 漩涡混合器 适宜的恒温器 37 1 电热干燥箱 250 实验器械等,16,细菌内毒素标准物质 国家标准品 以内毒素国际标准品为基准标定效价 150600-200707 10000EU/支 工作标准品 以内毒素国家标准品为基准标定效价 150601-200862 120EU/支,2、凝胶法实验的准备,17,细菌内毒素检查用水 用于复溶内毒素标准品、稀释内毒素及样品、溶解鲎试剂等 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。,2、凝胶法实验的准备,18,凝胶法鲎试剂 8个鲎试剂厂家 灵敏度0.50.03EU/ml 规格0.5ml、0.1ml等,2、凝胶法实验的准备,19,漩涡混合器,2、凝胶法实验的准备,20,适宜的恒温器 恒温水浴 恒温培养箱 干热恒温器,2、凝胶法实验的准备,21,试验器械的要求 移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（1075mm）、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、计时器、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。,2、凝胶法实验的准备,22,试验器械的要求 若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。 试验操作过程应防止微生物的污染。,2、凝胶法实验的准备,23,供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的pH值在6.08.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。 缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。,2、凝胶法实验的准备,24,3、限值（L）的确定,中国药典标准、国家药品标准 药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定： L=K/M,25,3、限值（L）的确定,L=K/M L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K2.5EU/kg/h；鞘内用药品，K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml/kg/h、mg/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅临床用药须知或药品使用说明书。 中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。,26,3、限值（L）的确定,计算举例： 注射用阿莫西林钠 根据国家药典委员会编纂的临床用药须知: “肌肉注射或稀释后静脉滴注，一次0.51g，一日34次；小儿按体重每日50100mg/kg，分34次静脉滴注。” M成人=1000mg/h60kg=16.67mg /(kgh) M儿童=100mg/(kgh)3=33.3mg /(kgh) L=K/M=5EU/(kgh) 33.3mg/(kgh) =0.150EU/mg,27,3、限值（L）的确定,限值计算时做必要调整的几种情况 从严原则 联合用药 特殊情况等,28,4、确定最大有效稀释倍数（MVD）,最大有效稀释倍数是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。 MVD=cL/,29,4、确定最大有效稀释倍数（MVD）,MVD=cL/ L：供试品的细菌内毒素限值 c：供试品溶液的浓度 ：在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（ EU/ml）,30,4、确定最大有效稀释倍数（MVD）,计算举例： a、当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml 适用于供试品为溶液状态，并且规定限值为应小于xx EU/ml。 例：替硝唑注射液 ，计算限值为0.5 EU/ml，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂进行检验，则 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,31,4、确定最大有效稀释倍数（MVD）,计算举例： b、当L以EU/mg或EU/U表示时，浓度c的单位需为mg/ml或U/ml 。 适用于供试品为固体状态，如粉针；或液体但是规定限值为应小于xx EU/mg或EU/U 。,32,4、确定最大有效稀释倍数（MVD）,例：注射用阿莫西林钠 计算限值为0.15 EU/mg，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂进行检验。 需先称取一定重量的注射用阿莫西林钠 ,在已除去外源性内毒素的容器中,用细菌内毒素检查用水配制成一定浓度的溶液。 如称取100mg注射用阿莫西林钠 ，用5ml内毒素检查用水溶解，即成为浓度为20mg/ml的阿莫西林钠溶液。 MVD=20mg/ml0.15 EU/mg0.125 EU/ml=24倍,33,4、确定最大有效稀释倍数（MVD）,如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，计算供试品的最小有效稀释浓度c=/L； 适用于供试品为固体的情况。计算得到的最小有效稀释浓度即为MVD下的该供试品的浓度。 例：注射用阿莫西林钠 计算限值为0.15 EU/mg，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂进行检验。 最小有效稀释浓度c= 0.125EU/ml0.15EU/mg=0.833mg/ml,34,细菌内毒素检查-凝胶法,2、实验部分 鲎试剂灵敏度复核 干扰实验：预实验 正式干扰实验 检 查 法：限量试验 半定量试验,35,鲎试剂灵敏度复核试验,目的：不仅是考察鲎试剂灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。 要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂前必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。,36,鲎试剂灵敏度复核试验,实验操作: 取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。 然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液,即2.0、1.0、0.5、0.25（为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。,37,鲎试剂灵敏度复核试验,38,鲎试剂灵敏度复核试验,放入371的恒温器中，保温60分钟2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形或从管壁滑脱者为阴性。 保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。,39,坚实凝胶 阳性“+”,40,未形成凝胶 凝胶不坚实 阴性“”,41,鲎试剂灵敏度复核试验,结果判断： 若最大浓度2管均为阳性，最低浓度0.25管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。 结果计算： 反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（c）。 c=lg-1（X/4） 式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。 反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。,42,鲎试剂灵敏度复核试验,+,0.5 ,0.5 ,c= lg-1（(lg +lg +lg0.5 +lg0.5 )/4)=0.707 ,+,+,+,+,+,+,+,+,+,43,鲎试剂灵敏度复核试验,当c在0.52（包括0.5和2）时，方可用于细菌内毒素检查。 以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。,44,凝胶法干扰试验,目的：是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。 未进行过内毒素检查法验证的样品 当供试品的配方和工艺有变化，或供试品阳性对照结果呈阴性时验证供试品是否存在干扰作用。,45,凝胶法干扰试验,试验操作： 在干扰试验中，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液。 解释：即与所使用的鲎试剂反应，不出现阳性的供试品溶液。,46,凝胶法干扰试验,试验操作： 预试验 正式干扰实验,47,凝胶法干扰试验,预试验 目的：初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU/mg或EU/u活性单位表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示），为正式干扰实验提供依据。 优点：减少摸索过程、节省成本,48,凝胶法干扰试验,预试验 将供试品溶液进行一系列倍数的稀释。 使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。 每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即含2.0浓度标准内毒素的该浓度的供试品稀释液）。 另做2支阴性对照，和2支阳性对照。,49,凝胶法干扰试验,预试验结果判断 当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效。 当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。 即可选择该稀释倍数进行正式干扰实验。,50,凝胶法干扰试验,预试验举例 供试品限值 硫酸庆大霉素，100ml/瓶，20000U/ml； 药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.5EU/1000U,51,凝胶法干扰试验,预试验举例 系列稀释倍数的确定 稀释倍数一般为MVD0.5MVD0.03，不大于MVD0.03。 MVD0.5 =cL/= 由此可计算出使用不同时所对应的MVD：,52,凝胶法干扰试验,如上结果可初步确定该批硫酸庆大霉素的最小不干 扰稀释倍数为80倍，可在此浓度下进行正式干扰实验。,53,凝胶法干扰试验,正式干扰试验 目的：检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。,54,凝胶法干扰试验,正式干扰试验 目的：检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。 通过比较鲎试剂与在水溶液中的内毒素和供试品溶液中的内毒素反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对内毒素检查有干扰。,55,凝胶法干扰试验,正式干扰试验 操作： 内毒素检查用水 同一支内毒素 标准品 供试品溶液 同时制备2支供试品阴性对照和2支阴性对照。,含2.0、0.5、0.25的内毒素标准溶液 含2.0、0.5、0.25的内毒素的供试品溶液,56,凝胶法干扰试验 正式干扰试验,结果判断： 当供试品阴性对照和阴性对照都为阴性 用检查用水稀释的标准内毒素系列的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时 试验方为有效,57,凝胶法干扰试验 正式干扰试验,分别计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（ES）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）。 Es=lg-1( Xs/4) Et=lg-1( Xt/4) 当Es在0.52（包括0.5和2）及Et在0.5Es2Es（包括0.5Es和2Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。,58,凝胶法干扰试验 正式干扰试验,试验举例 硫酸庆大霉素 根据干扰初筛试验的结果，供试品在80倍稀释时无干扰（对应鲎试剂灵敏度为0.125EU/ml） 选择将供试品稀释80倍进行干扰验证试验。 选用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂,59,凝胶法干扰试验 正式干扰试验,试验举例 制备含内毒素的供试品80倍稀释溶液 方法1： 标准品+1ml检查用水溶解 用硫酸庆大霉素80倍稀释溶液将内毒素稀释至2.0、0.5、0.25的浓度,60,凝胶法干扰试验 正式干扰试验,试验举例 制备含内毒素的供试品80倍稀释溶液 方法2：标准品+1ml检查用水溶解 用检查用水将内毒素稀释至4.0、2.0、0.5 0.5ml 4.0内毒素溶液 1ml含2.0内毒素的80倍 稀释溶液 0.5ml 40倍稀释溶液,61,62,Es=lg-1( Xs/4) = 0.125 Et=lg-1( Xt/4)=0.177,0.125 0.125 0.25 0.25,0.125 0.125 0.125 0.125,63,凝胶法干扰试验,导致干扰的因素： pH值 抗凝因子 螯合剂 葡聚糖 .,64,凝胶法干扰试验,排除干扰的方法： 稀释 中和 过滤 加热 ,65,凝胶法干扰试验,为确保所选择的处理方法能有效的排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。 即，先在供试品溶液中添加2浓度的标准内毒素，然后用所选择的方法处理溶液，而后再进行稀释、检测。,66,凝胶法干扰试验,由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关，因此在干扰实验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。 建议使用较低灵敏度（如0.5或0.25EU/ml）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰实验造成的阳性影响。,67,凝胶法干扰试验,当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。 须：三个批号以上的供试品，两个以上鲎试剂厂家的试剂。 当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。 如：内毒素检查时，供试品阳性对照为阴性时,68,凝胶法 -检查法 凝胶限量试验,检验供试品中的内毒素含量是否小于限值的定性方法。 每批供试品必须做 2支供试品管 2支供试品阳性对照 同时 每次实验须做2支阳性对照和2支阴性对照。,69,凝胶法 -检查法 凝胶限量试验,例：替硝唑注射液 ，计算限值为0.5 EU/ml，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂进行检验，计算 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,供试品溶液： 4倍替硝唑稀释液 供试品阳性对照为：含0.25EU/ml标准内毒素的4倍替硝唑稀释液 阳性对照为：浓度为0.25EU/ml的标准内毒素溶液,70,凝胶法 -检查法 凝胶限量试验,例：替硝唑注射液 ，计算限值为0.5 EU/ml，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂进行检验，计算 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,+,+,-,-,+,+,试验有效,71,凝胶法 -检查法 凝胶限量试验,例：替硝唑注射液 ，计算限值为0.5 EU/ml，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂进行检验，计算 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,+,+,-,-,+,+,-,-,此批替硝唑注射液的内毒素含量小于0.5 EU/ml， 符合规定。,72,凝胶法 -检查法 凝胶限量试验,例：替硝唑注射液 ，计算限值为0.5 EU/ml，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂进行检验，计算 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,此批替硝唑注射液的内毒素含量不小于0.5 EU/ml， 不符合规定。,+,+,+,+,+,+,-,-,73,凝胶法 -检查法 凝胶限量试验,例：替硝唑注射液 ，计算限值为0.5 EU/ml，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂进行检验，计算 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,须复试。,-,-,-,+,+,+,+,+,74,凝胶法 -检查法 凝胶限量试验,复试时，供试品溶液需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；否则判供试品不符合规定。,-,-,+,+,+,+,75,凝胶法 -检查法 凝胶半定量试验,半定量试验是使用凝胶法估测供试品中内毒素含量的方法。 系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。,76,凝胶法 -检查法 凝胶半定量试验,原理：通过供试品系列稀释液与鲎试剂反应，其反应终点浓度的稀释倍数与鲎试剂灵敏度的乘积即为供试品的内毒素含量 。 操作：用检查用水将供试品溶液从已确定的不干扰浓度或稀释倍数下开始进行对倍稀释，制备成2、4、8倍的稀释液，但最大稀释倍数不得超过所使用鲎试剂的MVD。,77,A：没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品系列稀释液。 B：供试品阳性对照。（为确证不存在干扰作用） C：标准内毒素系列。（为确证本次试验的操作和环境都符合要求。） D：阴性对照。,78,凝胶法 -检查法 凝胶半定量试验,结果判断： 当阴性对照溶液D的平行管均为阴 供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性 系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.52之间 试验有效,79,凝胶法 -检查法 凝胶半定量试验,结果计算：,80,凝胶法 -检查法 凝胶半定量试验,结果计算：,c=lg-1（X/2）= 0.707，在0.52之间 仍以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度 。,81,凝胶法 -检查法 凝胶半定量试验,结果计算：,CE=lg-1（X/2）= lg-1（lg4 +lg2 ） /2） = 2.83 ,82,凝胶法 -检查法 凝胶半定量试验,结果计算： 如果检验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数。,83,凝胶法 -检查法 凝胶半定量试验,结果计算： 例：右旋糖酐20葡萄糖注射液 ，限值为0.5EU/ml 。 通过使用3个鲎试剂厂家的鲎试剂对3个不同厂家的7批样品进行干扰试验证实：右旋糖酐20葡萄糖注射液稀释2倍后即不干扰内毒素检查。 使用灵敏度为0.03EU/ml的鲎试剂对一批右旋糖酐20葡萄糖注射液进行凝胶半定量试验。,84,凝胶法 -检查法 凝胶半定量试验,例： 计算MVD MVD=0.5EU/ml/0.03EU/ml =16.67倍 从已确定不干扰的稀释倍数2倍起，再进行1、2、4、8倍的稀释。（相当于又将供试品原液进行了4、8、16倍稀释，最终的稀释倍数没有超过MVD。）,85,凝胶法 -检查法 凝胶半定量试验,