《细胞计数原理》PPT课件.ppt

微生物细胞计数及染色操作,一、目的要求,学会血球计数板的使用方法 了解革兰氏染色的原理 学习并掌握革兰氏染色的方法,二 酵母细胞计数原理 微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法和间接计数法。前者利用血球计数板在显微镜下直接计数，能立即得到数值，但死活细胞都计数在内。后者是在乎板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时太长。本实验是利用血球计数板进行直接计数。计数前需对样品做适当稀释，按照规定方法及计算公式运算后，即可得出实际数值。,细菌染色基本原理,革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。 它是1884年由丹麦医师Gram创立的。 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。,肽聚糖(peptidoglycan),革兰阳性菌肽聚糖聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥,革兰阴性菌肽聚糖聚糖骨架、四肽侧链,肽聚糖(peptidoglycan),革兰阳性菌细胞壁特殊组分,革兰阴性菌细胞壁特殊组分,革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较,革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。 碱性染料初染液结晶紫（crystal violet） 媒染剂碘（iodine） 脱色剂95的酒精（ethanol） 复染液番红,三、实验器材,大肠杆菌，枯草芽孢杆菌、未知菌； 草酸铵结晶紫，番水水溶液，碘液，95%乙醇，载玻片，显微镜等。 显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球计数 板、载玻片等。 麦芽汁培养基、酵母菌。 吸管、吸水纸等。,四、实验步骤,1涂片：将培养24小时的大肠杆菌和未知菌，培养12-18小时的枯草芽孢杆球菌、分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰12次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。,（一） 染色实验,2染色,（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 （3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030秒钟，立即用水冲净酒精。 （4）复染：用番红液染12分钟，水洗。,（5）干燥和镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 （6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。,大肠杆菌革兰氏染色,(二)酵母细胞数的测定操作方法 1.血球计数板的构造 血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面个刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微生物计数用。这一大方格的长和宽各为1m，深度为，其体积为0.1mm3。,计数室通常有两种规格。一种是大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造；它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由1625=2516=400个小方格组成，见图。 2.血球计数板的使用 (1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数。 (2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数，以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜，一般稀释10倍即可。,(3)将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室上加盖专用的厚玻片。 (4)将稀释后的酵母菌悬液，用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘，使菌液缓缓渗入，多余的菌液用吸水纸吸取，捎待片刻，使酵母菌全部沉降到血球计数室内。 (5)计数时，如果使用16格25格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即100个小格）的酵母菌数。如果规格为25格16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。,4.血球计数板的清洁 血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。,1结果 列表比较大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和未知菌的染色反应