《疫学实验技术概述》PPT课件.ppt

第九章 免疫学实验技术概述,血清学反应：体外发生的抗原抗体反应。,第一节 体液免疫的检测 血清学反应,所有血清学反应类型的基本原理：抗原抗体反应的特异性。,二、血清学反应的一般规律 (一)特异性 Ab只能与相应Ag特异结合。 Ag表面常具有多个(多种)不同表位，所以免疫血清中也应含有相应多种特异性Ab。,抗原与抗体的结合的特异性,（二）交叉性 交叉抗原：不同的Ag物质之间存在相同的Ag表位时，称为交叉抗原。 交叉反应：又不同抗原制备的抗血清除与各自的相应Ag发生反应外，尚能与对方Ag发生反应。 通常两种Ag之间亲缘关系越近，交叉反应程度越高。,A,B,抗原与抗体的结合的交叉性,(三)用已知测未知 所有血清学反应都毫无例外地是用已知Ag测未知Ab或用已知Ab测未知Ag。 用已知测未知的依据：抗原抗体的反应是特异的。 正确理解实验原理或进行试验设计的关键是搞清楚什么是已知，什么是未知，谁是抗原身份，谁是抗体身份，谁是身兼两职的。,(四)试验与抑制试验 许多血清学试验可以被相应的AgAb所抑制，即抑制反应现象的出现，抑制试验可以验证反应的特异性；还可使一些不易被检测的Ag(如简单半Ag)或Ab(如单价Ab)，得以检出。,(五)结合力与离解力 Ag，Ab的结合为弱能量的非共价健结合，其结合力决定于Ag表位与Ab的结合点之间所形成的非共价健的数量，性质和距离，包括4种力的作用：,Ag-Ab结合的离解力 指Ag-Ab结合具有可逆性，因为Ag-Ab之间靠非共价结合，因此在一定条件下可使其解离。解离后的Ag-Ab仍保留其原有活性。,(六) 结合比例 Ag与Ab的结合常需适当比例才出现可见反 应，在最适比例时反应最明显； 这种现象可以用“格子学说”来解释：Ab(1gG) 为二价，Ag通常为多价，只有Ag，Ab结合形 成大的复合物，肉眼才可见；,带现象 只有当Ag与Ab比例适当时，才能形成大的复合物，比例不适当，就只能形成小的复合物而抑制反应现象的出现. 前带现象：Ab过剩，Ag过少；稀释Ab 后带现象：Ag过剩，Ab过少；稀释Ag。,(七) 血清学反应的影响因素 1电介质：生理盐水，缓冲盐水，少数动物(禽)血清用8.5NaCl； 2温度； 3pH：pH6.08.0,三、血清学技术的优越性 (一)检样量少，预处理简单： 一滴血清/血、一根羽毛、少许组织悬液、植物一片子叶等。 (二)种类多，可择优选用 (三) 方法简便快速 (四) 特异性、敏感性 (五) Ag/Ab定位、定量,四、血清学试验的制定原则 特定的或建立新的血清学方法时，应注意以下原则： (一) Ag准备和提纯 1购自试剂公司：如半Ag、激素、酶、 农药、抗生素、昂贵的天然Ag等。,2自制：一般天然Ag、动物血清、组织Ag等,(二) Ab制备提纯,(三)操作程序制定 (四)材料准备和滴定：工作浓度滴量 (五)试验条件选择： (六)特异性试验 1Ag、Ab验证：反复、重复验证 2交叉试验 3抑制试验(阻断),(七)敏感性试验 (八)重复性试验 (九)稳定性试验,五、血清学试验的应用 (一) 血清学诊断 (二) 生物活性物质超微定量 (三) Ag/Ab亚细胞、细胞水平定位 (四) Ag组分分析，如病毒结构蛋白可用免疫转印，免疫沉淀(琼扩、电泳、交叉免疫电泳等) (五) 物种鉴定分型 (六) 有机物提取纯化,六、血清学试验的类型 （一）沉淀反应： 环状沉淀试验 琼脂扩散： 免疫电泳 对流电泳 火箭电泳 双向电泳,补体结合试验,（二）凝集反应： 直接凝集：平板、试管 间接凝集：间接血凝、炭凝、乳胶凝集 协同凝集： 凝集抑制：（血凝抑制） （三）与补体有关的实验：活性、组分、补结、免疫粘附血凝等。 （四）中和试验,（五）标记技术： 同位素标记 荧光标记：化学发光免疫技术 酶标记：组化法、测定法（ELISA） ELISA：间接法、免疫酶斑点技术（dot- ELISA）、 竞争法、 夹心法、 桥联法 （六）免疫电镜组化技术 胶体金铁蛋白标记技术,B,B0,竞争酶联免疫吸附检测法(CiELISA)原理,0ng/ml，检测线为清晰红色条带； 1ng/ml，检测线与0标准品的