《自动生化分析技术》PPT课件.ppt

自动生化分析技术,第 四 章,【案例导引】 有一次，某生化室新来的工作人员在工作中发现，自动生化分析仪显示总胆红素检测试剂不足。于是，他从存放试剂的冰箱里取出总胆红素试剂直接替下试剂盘内原有的试剂，然后进行病人标本检测，结果当天检测结果普遍偏高。 问题：1、为什么会出现结果偏高的现象？ 2、更换试剂应注意什么？,第一节 概述,自动生化分析：集自动化技术、光学、微电子技术和计算机科学为一体，自动加样、稀释、混匀、反应、比色、分析过程的监控、数据记录、计算、打印、传输等功能。,连续流动式生化分析仪 离心式生化分析仪 分立式生化分析仪 干片式生化分析仪,半自动生化分析仪 全自动生化分析仪,按结构和 原理的不同,分类,按自动化程度,半自动生化分析仪,指在分析过程中的部分操作（如加样、保温、吸入比色、结果记录等某一步骤）需手工完成，而另一部分操作则可由仪器自动完成。这类仪器的特点是体积小，结构简单，灵活性大，既可分开单独使用，又可与其他仪器配套使用，价格便宜，一般在分立式分析仪中多常见。,全自动生化分析仪,从加样至出结果的全过程完全由仪器自动完成。操作者只需把样品放在分析仪的特定位置上，选用程序开动仪器即可等取检验报告。由于分析中没有手工操作步骤，故主观误差很少，且由于该类仪器一般都具有自动报告异常情况，自动校正自身工作状态的功能，因此系统误差也较小。,Aeroset,i8000,i2000,i4000,ci8200,i2000sr,C8000,样品盘,试剂 1,试剂 2,搅拌器,清洗装置,ISE(选配),样品针,光学系统16个固定波长 压电搅拌效果可靠 8步清洗确保了清洗 效果,ICTTM技术ISE模块检测Na+、K+、Cl- 165个反应杯位 试剂R1/65,R2/56,加样系统 A.样品准备：样品管（杯）置于样品架上，样品架分圆盘状和传送条带状等类型 B.样品的吸取：由吸样针完成，通常装有液面传感装置，以防止空吸和吸入凝块 C.试剂分配:由试剂盘、试剂加样器，搅拌装置等部分组成,检测系统 A.光源：目前大多数用卤素灯，工作波长325800nm。少数用氙灯，工作波长在285750nm。 B.分光装置：采用干涉滤光片或光栅分光。 干涉滤光片价格便宜，但易受潮霉变 光栅前分光和后分光 C.比色杯：主要分为分立式和流动池式比色杯 分立式比色杯 数量与检测的速度有关 流动池式比色杯 1个,计算机系统 A.病人样品的识别 B.添加样本和试剂 C.混合 D.数据的处理，计算结果 E.恒温控制 F.结果显示和打印 G.数据管理存储、质控,样品盘,标配试剂、标本双条码扫描功能,第二节 生化分析仪的参数设置与校准,1真值：是采用一种最可靠的参考方法测得近似真值的数值。 2定值：标定的质控材料的已知值。 3靶值：排除离群值后所有观察值的平均值。 4标准物：具有一种或多种足够均匀的和很好确定的特性，用以校准测量装置、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质。 5校准物校准品：用于建立一个或多个定量值的物质。 6质控物质控品：专门用于质量控制目的的标本或溶液。,一、名词解释：,7偏倚：被评价方法的测定值与决定性方法、参考方法、指定对比方法的测定值之间的差异。 8重复性条件：指在尽量相同的条件下，以及在尽量短的时间内对同一被测对象相互独立进行的测试条件。 9重复性标准：在重复性条件下所测试结果的标准差。 10再现性条件：在不同实验室，由不同操作者使用不同的设备，按相同的测试方法，对同一被测对象相互独立进行的测试条件。 11再现性标准：在再现性条件下所得测试结果的标准差。,波长： 范围宽达 340-804 nm, 16个波长任意选用340、380、404、412、444、476、500、524、548、572、604、628、660、700、748、804nm。 温度：37 水浴恒温系统 加热迅速, 温控均匀 受环境温度变化影响小 水浴添加剂及流动活水循环防止细菌生长 分析法: 一点终点、两点终点、两点速率法、速率A法。,二、生化分析仪的参数设置,1、终点法 被测物质在反应过程中完全被转变为产物，到达反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法。该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。,分析方法分类,终点时间的确定,根据时间-吸光度曲线来确定， 根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定。,（1）一点法（终点法）,在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。 结果计算公式：待测物浓度CU =（待测吸光度AU试剂空白吸光度AB）K K为校准系数 适合蛋白、糖、胆固醇测定,图4-3 一点终点法反应曲线,A单试剂一点终点法 B双试剂一点终点法,（2）两点法,在反应过程中测定两个时间点的吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果。 计算公式为： CU=（待测吸光度A2待测吸光度A1）K。,图4-4 两点终点法反应曲线,A单试剂两点终点法 B双试剂两点终点法,该法能有效地消除溶血、黄疸和脂浊等样品本身光吸收造成的干扰。,图4-5 血红蛋白、胆红素和脂浊的 光吸收曲线,2、二点速率法,指在反应过程中选择适当两点（此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度）测定吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算。 计算公式 CU=(A2-A1)K。,图4-6 两点速率法反应曲线,该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。,3、速率A法,又称连续监测法（rate assay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期（各两点间吸光度差值相等）的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（A/min）计算结果。,图4-7 连续监测法反应曲线,A单试剂连续监测法 B双试剂连续监测法,酶促反应的线性段,1及5值偏小，而234，故A1点至A4点属线性段,连续监测法的优点,可以确定线性期并计算A/min，根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。 酶活性（U/L） A/min理论（或校准）K值。 代谢物浓度CU=A/min校准K值。,1理论K值,多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用。根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为： 酶活性 (U/L)=A/min 将此式中 以K来表示，即为理论K值 可作为分析参数输入到分析仪中。,采用理论K值的前提,应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差，温度的影响有时也非常大。,由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后来计算理论K值。,（1）NADH（NADPH） 摩尔吸光系数的测定,NADH（NADPH）没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用NADH 或NADPH标准液来校正仪器，须通过有NAD+(NADP+)参与的反应途径。,用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品。 根据公式A=bC，已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A后便可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数为 A/bC。,（2）“色素原”酶促产物 在405nm波长摩尔吸光系数的测定,有许多酶底物为人工合成的“色素原”底物，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物，在405nm波长具有吸收峰。 ALP底物磷酸对硝基苯酚 (4-NPP) 经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-NP)GGT底物-L-谷氨酰对硝基苯胺或-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(ANBA)。,4、透射比浊法(多点校准),抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行透射比浊（transmission turbidimetry）测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做多点校准，再经非线性回归，求出抗原或抗体的含量。,方法举例,常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。,1终点法检测,2二点速率法,苦味酸法测定肌酐采用此法。,3连续监测法,对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如：丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如：脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。,4透射比浊法,透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗“O”、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。,必选分析参数,1试验名称 2方法类型 3反应温度 4主波长 5次波长 双波长优点：减少噪音；减少杂散光；减少样品本身光吸收 噪音：从光源到比色杯、单色器及检测器的整个光路系统中，均存在着随时间发生变化的不稳定的检测信号，即噪音。,6. 反应方向 7 样品量常量、减量和增量。 8 第一试剂量 一般20-300l 9 第二试剂量同上。 10总反应容量 一般180-350l，个别仪器能减少至120l。 反应时间 11孵育时间 12延迟时间,13分析时间 ：参数设定中最重要的一部 14校准液（calibrator）个数及浓度 15校准K值（calibrate coefficient）或理论K值 16线性范围 17小数点位数,自动生化分析仪工作过程和操作方法,一、工作过程 在测定过程中所有机械步骤均由微处理器根据已设定的程序进行工作。,1取样加试剂和混匀,2保温反应和吸光度检测,3计算并显示或打印结果,二、操作方法,（一）操作前的各项检查 （1）正常开机以后，检查冲洗用水装置是否正常、各项分析试剂是否充足、各种清洗剂是否足够，以及样品针、试剂针和搅拌棒是否清洁。 （2）确认要进行校准的项目，确认要做的质控批号及项目，以及校准品、质控品是否足够。 （3）进行光度计自检来确认光路与检测系统是否处于正常工作状态。,（二）校准,分析仪在样品分析之前都要对该分析项目进行校准（也称定标），得出一个该项目的校准系数（K）。校准前首先必须在反应程序里设定有关校准的参数，如校准液的代码、位置及浓度值等。执行校准程序，检测得到该校准品的吸光度值，再根据校准浓度计算校准系数（K=校准品浓度/校准品吸光度）。,1校准方式,有单点校准、两点校准和多点校准 单点校准：校准曲线呈直线且通过原点，用单个浓度的校准液即可， 两点校准：若校准曲线呈直线但不通过原点，则需用两个浓度的校准液做两点校准； 多点校准：当校准曲线不呈直线而为真正的曲线时，应做多点校准，并按其线形选择不同的曲线方程进行拟和，如双曲线、抛物线、幂函数、指数函数、对数函数等方程等。,如有下列情况发生时，必须进行校准： 改变试剂的种类或批号； 仪器或者检验系统进行一次大的预防性维护 或者更换了重要部件； 质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出了 实验室规定的接受限。,（三）质控品测定,质控是保证检测结果可靠性的一个重要手段，因此每批样品的分析测定均应该有质控样品同时监测。关于分析仪的批测定，是指一批样品从开始测定到完成测定后停止的整个过程。其中如果进行了添加或更新试剂、进行了有可能改变吸光度的维护等操作，均应进行一次质控样品的检测，以便及时监测到分析系统的改变。,所有分析仪都已设定或固化了有关质控的分析程序： 设定有关质控参数，如每个质控品的批号、靶值和标准差； 选择质控图的方式，如均值标准差质控图； 质控结果的统计分析，分析仪会保存每次测定的质控结果，并对其进行统计，以列表及质控图的形式在屏幕上显示。,可根据质控结果在质控图上的位置判断其是否在控。如果判为失控则应从试剂、质控品、校准品和分析仪等几方面寻找原因。通过对质控结果的分析，可以了解某项目的分析精密度和准确度的改变。,（四）检测项目的输入与测定,1项目输入 （1）逐项输入：每份样品可以任选分析仪中已设置的且试剂室内已预置试剂的项目中的一项、几项或全部项目。,（2）项目组合输入：把与疾病相关的检验项目 组合在一起，进行组合检验，这有利于方便病人，有利于疾病的诊断和预后分析，同时也简化了分析操作，提高分析效率。 （3）批量输入：对于有连续相同测定项目的样品，可使用批量输入的方法。,多数全自动分析仪的操作非常方便，在开始测定画面，输入该批第一个样品的样品号，分析仪即会自动逐个地对样品进行测定。一般在开始画面还可选择： 是否需要对结果超过设定的线性范围、超过允许的吸光度上限等的样品自动进行重复测定； 测定结果是否需要按照已设定的打印格式自动打印与测定结果有关的选项。,2进行测定,3急诊检验,几乎所有全自动生化分析仪都具备“急诊优先”的功能，仪器留有急诊样品的分析位置或专用样品架以或急诊分析的专用编号。一旦在急诊样品位置上放置了样品，并设定了急诊检验的项目，分析仪就会在常规样品的测定过程中，优先安排对该样品进行分析测定。,分析仪性能指标,（一）准确度 吸样、加试剂、温控准确度，以及光路系统如波长、检测器准确度和波谱带宽等，都影响检测准确度，这些因素往往使相同项目的检测结果向同一方向偏离。有关这些准确度的指标通常无具体说明，但可以通过相应的实验来检测。应当说多数分析仪对有关这些部件的制作及其工作的准确度比手工操作及其所用的仪器好得多。,（二）精密度 以上影响准确度的因素同样可因其制作不精而使工作稳定性较差，造成精密度不佳，吸样精度以及样品针、试剂针、搅拌棒、反应杯的交叉污染是影响精密度的主要因素，有关分析仪的资料中通常会介绍防止和减少交叉污染的措施，主要是其冲洗系统各有特点，冲洗效果可能不同。,（三）检测能力 1检测方法 多数分析仪能做终点法、固定时间法、连续监测法和透射比浊法。 2检测时间 分析仪通常可检测最长10min的反应，个别最长能检测15-22min甚至更长。 3. 加试剂次数 能加1-4种试剂，多数为2种。,4. 检测范围 能检测吸光度的最高值及其准确度决定检测上限；检测灵敏度则为能辨别待测物最小浓度差的能力，有时与最低检出浓度一致，但后者主要取决于方法灵敏度。,（四）速度 影响分析速度的因素，包括本节一中所述的试剂瓶数、取样周期、反应杯数量、一次可容纳样品数量、试剂瓶容量和模块组合能力等。 （五）检测成本 反应杯类型和寿命决定其耗费，最小样品量影响试剂用量，最小反应杯液量可决定样品和试剂用量，以及保养维护消耗。,第五节 生化分析仪试剂盒的选择和评价,临床生化试剂盒 临床生化商品试剂与标准液按检测项目组合成一套放在一个包装盒内叫试剂盒（reagent kit），或叫试剂组合（reagent set ）。 与自动化分析仪匹配的试剂盒的研制、生产和供应走向产业化的道路，它无疑是临床生化发展史上一个巨大的技术进步。,试剂盒的分类和发展,临床生化诊断试剂种类繁多，有液体型、粉剂型、片剂型，有单一试剂、双试剂、干试剂、多试剂等。 纵观近20多年来的发展，临床生化体外诊断试剂盒的分类和发展历史可表示如下：,化学分析法,方法 物理性状 组合形式 操作方式,液体型自配试剂,液体多剂型试剂,手工法多步操作,酶法分析,干粉片型试剂,液体单剂型试剂,流动离心式分析仪,免疫学法,液体型商品试剂,液体双剂型试剂,任选分立式分析仪,干化学法,干式多层胶片型试剂,单剂型干片式试剂,干片式分析仪,（一）液体型试剂 优点是液体型试剂的试剂组分高度均一，瓶间差异小，测定重复性好和使用方便；它也无需加入任何辅助试剂及蒸馏水，避免了外源性水质对试剂的影响，性能较稳定，测定结果较为准确。 缺点是液体型试剂（尤其是酶试剂）保存时间较短，不便于运输。,一、液体型试剂和粉（片）剂型试剂,所谓液体单试剂就是将某种生化检验项目所用到的试剂科学地混合在一起，组成为一种试剂。应用时，只须将标本和试剂按一定比例混合，即可进行相应的生化反应，然后用适当的方法检测结果。,1液体单试剂,内源性甘油给甘油三酯测定的干扰。 内外源性NH4+对尿素酶法测定的干扰。 内源性丙酮酸对ALT、AST测定的干扰等。 维生素C和胆红素对Trinder反应的干扰。,单试剂存在抗干扰能力差的缺点，给测定结果带来相当大的分析误差。例如：,所谓液体双试剂就是将某些生化检测项目所用到的试剂，按用途科学地分成两类，分别配成两种试剂，通常第一试剂加入后可起到全部或部分消除某些内源性干扰的作用，第二试剂为启动被检测物质反应的试剂，两种试剂混合后才共同完成被检项目的生化反应。然后用适当的方法检测结果。,2液体双试剂,所谓粉剂型及片剂型试剂，即是将试剂的各组分用球磨技术粉碎成粉剂或混合后压成片剂，使用前再加入指定的溶液复溶成液体试剂。,（二）粉（片）剂型试剂,用固体原料研磨后制成粉剂或片剂，则存在许多问题： 要使试剂各组分混合得非常均匀，技术难度很大； 分装过程中的称量误差及复溶时加水量的准确性影响试剂的瓶间差； 水质优劣对试剂的稳定性和测定的可靠性有相当大的影响。,（一）检查包装是否完整 （二）试剂质量初评 （三）试剂性能特征的评估,二、试剂盒的选择和评价,（一）检查包装是否完整,商品试剂盒不仅应具有优质的试剂内容，而且应有完整牢固的包装和详尽明确的说明书。,1、外包装 外包装应完整牢固，封口严密。,2、内包装 内包装应有清晰完整的标签，牢固贴于容器表面。,3、说明书 内容包括试剂名称、用途、测定原理和技术要求、标本要求、卫生部批准的文号等。,1.说明书审查 说明书是用户了解和正确使用试剂盒的指南。审查内容包括： 试剂名称； 用途； 测定原理和技术要求； 试剂盒内的包装内容； 适用仪器；,1.说明书审查 标本要求； 测定步骤及注意事项； 贮存的条件及有效期； 性能特征，包括准确度、精确度、特异性、 受干扰的程度、线性范围、参考范围； 生产单位名称、地址、邮编及电话。,（二）试剂质量初评,通过观察试剂的颜色、性状及溶解度等对试剂质量进行初步评价。 粉剂型应均匀无凝块，不粘附瓶壁； 液体型试剂应无沉淀，无混浊，无渗漏。,（三）试剂性能特征的评估,1、准确度 2、精密度 3、干扰物试验 4、线性范围 5、稳定性,（一）测定准确度,1、通常用回收试验来衡量试剂盒的准确度。回收率越接近100%，准确率越高，一般以100%5%为合格。,2、也可以用对比试验来衡量 ：将被检试剂盒与公认的参考方法同时测定若干样本，计算两组结果的相关系数和直线回归方程。 相关系数在0.91.0之间，斜率b越