重组子的筛选与鉴定ppt课件

第六节 重组体的筛选与鉴定,转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 重组子：含有重组DNA分子的转化细胞。,外源DNA,载体DNA,重组分子,原核细胞,真核细胞,扩增或表达,表达,连接,转化或转导,电穿孔或显微注射,受体细胞,DNA的体外重组,植物转化体报道基因筛选法,（1）大肠杆菌的-D-葡萄糖醛酸糖苷酶 （-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。,1. 报告基因（reporter gene),（4）其它,转入萤火虫的luciferase的烟草,一、遗传检测法 报告基因筛选、 抗性标志插入失活筛选、 半乳糖苷酶蓝白斑筛选、 插入基因遗传性状筛选、 二、分子检测法 PCR扩增检测 分子杂交检测 三、物理检测法 DNA电泳检测 限制酶酶切分析法 四、免疫化学检测法 五、核酸序列分析,平板筛选,重组子的筛选与鉴定,一、遗传学检测法,重组体的筛选与鉴定-筛,Ampr,插入失活筛选: 例1 在Tetr中插入目的基因,在质粒固有的功能基因内插入目的基因，则该基因不能表达有功能的蛋白质。,原理：,Amp,Tet,1 2 3,4 5 6,3和5 是阳性克隆,1 2 3,4 5 6,两种抗生素直接筛选（影印法）,无环丝氨酸培养基,环丝氨酸辅助筛选,（1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。,（2）氨苄青霉素抗性基因：产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸,pBR322抗菌素标记选择原理,（3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。,如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。,Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。,pUC18/19,插入失活筛选: 例2 在Lac Z中插入目的基因,载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，可编码-半乳糖苷酶氨基端即肽链， IPTG可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的-半乳糖苷酶羧基端互补(-互补)。 故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lacZ的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物X-gal的培养基上生长形成蓝色茵落。 将一连串克隆位点克隆入质粒的lacZ基因中，外源DNA插入质粒的多克隆位点后可使-半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，从而破坏了-互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。 利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从空载体中筛选出来。这种现象被称为是 -互补 X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷 IPTG:(异丙基-D-硫代半乳糖苷),-互补 (alpha-complementation),lacZ与蓝白斑筛选,-互补 (alpha-complementation),通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。,MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。,IPTG诱导的结果：,利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。,转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。,一、原理：,2、 根据插入基因的遗传表型筛选,弥补缺陷,his-,his+,受体菌：,外源基因：,在不含组氨酸的培养基中生长,利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,一、直接电泳检测法,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。,DNA电泳检测法,分子量 Marker,载体,重组克隆,三、物理检测法,根据重组DNA分子大小鉴定重组子 原理：有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载体DNA之间的大小差异。 基本方法：提取转化子的DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离，电泳迁移慢的带是重组DNA的带。 此法是对重组子进行分析鉴定的最基本、最简单的方法，只适用于重组子的初步鉴定。,二、酶切电泳筛选法,1. 原理：,根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。,或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。,二、分子检测法,PCR扩增检测 分子杂交检测,PCR扩增检测法,1. 原理,PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。,2. 过程,（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。,（2）用外源DNA插入片断作PCR引物。,（3）电泳PCR产物。,（4）检查是否有PCR产物。,（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。,补充,例 PCR检测,PCR检测外源基因的原理是根据被转移的外源基因（目的基因或选择标记基因）设计引物，扩增外源基因的片段。如果扩增出的片段与设计的一对引物之间的实际片段在长度上相吻合，说明基因已转入受体细胞。 在进行PCR检测时应设两个对照：阳性对照即质粒DNA和阴性对照即非转基因材料的DNA。 PCR扩增结果只能初步确定转基因材料的真实性，并不能完全确信。容易出现假阳性，通常需要进一步用Southern杂交才能证实。,转基因棉花选择标记基因NPTII编码区段的PCR扩增结果（M为分子量标准，C为非转基因植株，P为质粒对照，1-20为转基因植株）,具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列且已标记的DNA或RNA,称探针。 杂交有固一液相杂交和液相杂交。,核酸分子杂交的基本原理,四、核酸分子杂交技术,2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。,四、原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交,（1）菌落印记原位杂交筛选,特点：,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。,Southern blotting,从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。,只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。,Paper Towels,Southern Blotting,tissue,SDS,蛋白酶K,酚/氯仿,无水乙醇 离心,2. Northern blotting,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,主要检测插入片断是否被转录。,从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。,此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。,4.1 Southern 印迹杂交,带有DNA片段的凝胶,Southern 印迹杂交的技术流程,白瓷盘,玻璃板,滤纸,凝胶,尼龙膜,滤纸,吸水纸,玻璃板,重物,吸水纸转膜,。,真空转膜,利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。,根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：,一、放射性抗体检测法,第五节 免疫化学检测法,1. 抗体与产物的结合方式,对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交”,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,125I 标记的二 抗结合蛋白,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,125I标记的二抗,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,固相支持滤膜,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,125I 标记的二抗 结合蛋白,125I标记的二抗,2. 放射性抗体检测法过程,3. Broome-Gilbert双位点检测法,质粒基因A,插入基因B,表达,质粒蛋白A,外源蛋白B,融合蛋白,检测融合蛋白。,既检测外源基因产物又检测载体基因产物。,固相支 持滤膜,抗A抗体,125I标记的 抗B抗体,质粒蛋白A,外源蛋白B,质粒蛋白A,外源蛋白B,固相支 持滤膜,抗A抗体,发光，底片曝光,二、免疫沉淀检测法,把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。,1. 原理,抗原抗体凝集反应。,检测分泌型产物。,2. 方法,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。,三、酶联免疫吸附测定（ELISA）,Enzyme-linked immunosorbant assay,1. 原理：,一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,酶,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,无色的底物,有色的产物,比色观察,酶,19,2. ELISA检测的一般步骤,（1）固定样品,将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。,孔底,加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。,（2）一抗结合,一抗,加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。,二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。,（3）二抗结合,二抗,加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。,（4）显色反应,在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。,（5）比色,3.ELISA的局限性,有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。,最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）,临床检验常用的单抗,四、免疫印迹（western blotting）法,1.原理：,在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。,（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。, SDS:,（SDS-PAGE）：, 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：,（Polyacrylamide gel electrophoresis）,在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。,电泳buffer,电泳buffer,点样,电泳方向,蛋白质电泳的分子量标准,已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。,商品化供应,Da,道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。 一克约为61023道尔顿,Dalton,SDS PAGE,凝胶中的蛋白质染色：,考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可褪色回收。,硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。,2）转到膜上进行染色。,1）直接染色,直接染色电泳结果,（2）Western blotting,电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。, Western（转膜）,胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。,膜,胶,蛋白,Western装置, Blotting,原理与ELISA相同。,待测蛋白,硝酸纤 维素膜,一抗,二抗,辣根过氧 化物酶,底物,产物， 并发出光,PAGE胶,待测蛋白,底片曝光,辣根过氧化物酶：HRPO,1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。,2）洗去未结合的一抗。,3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。,4）清洗掉未结合的二抗。,5）用HRPO的底物浸泡膜。,6）暗室里曝光，冲洗胶片。, Blotting过程,Immuno Blotting,结果,多克隆抗体Blotting的结果,单抗blotting结果,一、无细胞翻译系统,第六节 转译筛选法,能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。,借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。,适用于mRNA转录丰度高的外源基因。,二、转译筛选,mRNA,无细胞翻译系统,35S标记的 甲硫氨酸,翻译,35S标记的肽链,PAGE电泳,放射自显影,比较放射性 带纹的位置,载体+外源DNA,转录,与预期的产物分子量相符？,三、杂交抑制转译法,mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。,单链mRNA,核糖体 小亚基,核糖体 大亚基,能翻译,mRNA,DNA,核糖体 小亚基,核糖体 大亚基,不能翻译,1. 原理,2. 过程,四、杂交释放转译法,1. 原理：,在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。,2. 过程,硝酸纤 维素滤膜,载体和插 入的cDNA,总mRNA,cDNA基因的 mRNA,杂交,洗脱,cDNA基因的 mRNA,体外翻译,cDNA编码的蛋白,电泳,凝胶放射自显影,cDNA编 码的蛋白,硝酸纤 维素滤膜,载体和插 入的cDNA,硝酸纤 维素滤膜,载体和插 入的cDNA,收集,35S标记的氨基酸,专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。,待测蛋白质,硝 酸 纤 维 素 滤 膜,能与蛋白质结 合的DNA序列,放射性标记,待测蛋白质,硝 酸 纤 维 素 滤 膜,能与蛋白质结 合的DNA序列,放射性标记,五、DNA-蛋白质相互作用筛选法,一般克隆与筛选策略,第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法,真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。,二氢叶酸,四氢叶酸,二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）,一、哺乳动物基因转移的选择标记,1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk）,（1）TK选择原理,四氢叶酸的必要性,DHFR,氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用,氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dCTP和dTTP的合成：,胸苷酸激酶的补救作用,TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（T）合成TTP，存活。,T,tk,次黄嘌呤的补救作用,细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和dCTP。, HAT培养基：,Tk- 细胞株。,TK基因。, 宿主细胞, 载体标记,（2）TK选择过程,含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）,只有转入TK基因的细胞才能生存。,20,真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。,2. 二氢叶酸还原酶基因（DHFR）,（1） 选择原理,二氢叶酸还原酶的必要性,dUMP,dATP,TTP,dCTP,四氢叶酸,四氢叶酸,DHFR+细胞,二氢叶酸,四氢叶酸,二氢叶酸还原酶,二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸,DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。,能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存,不需要补救！,DHFR- 细胞,DHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。,需要补救！,不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。, 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救,dUMP,dATP,TTP,dATP,次黄嘌呤,补救,胸苷,补救,无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻时，,胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救:,DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。, 宿主细胞,（2）选择过程,透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。, 无核苷酸的培养基,需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！, 氨甲喋呤“加压”,添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR的补救作用，可提高选择。,DHFR+基因。, 载体标记,只有转入DHFR+基因的细胞才能生存。,DHFR-,DHFR-,DHFR+,DHFR+,live,die,无核苷酸的培养基,是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但不影响真核生物。,3. 新霉素抗性基因（neor）,（1）选择原理, 新霉素（neomycin）,新霉素的类似物，是一种 氨基糖苷，对真核细胞和原核细胞都有毒性。, G418（geneticin）, 新霉素抗性基因-neor,细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种磷酸转移酶（APH），能使G418失活。,G418,真核细胞,死亡,G418,存活,neor,真核细胞,含致死剂量G418的完全培养基。, G418培养基,真核细胞株均可。,neor基因。,宿主细胞,载体标记,（2）选择过程,G418：（100-800g/mL）,CAT是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，催化氯霉素发生乙酰化失活。,氯霉素,cat,含氯霉素的完全培养基。,真核细胞株均可。,cat基因。,乙酰氯霉素,4. 氯霉素乙酰转移酶（CAT）,（1）选择原理,（2） 选择条件,（3） 宿主细胞,（4）载体标