荧光分光光度法评价环肽类天然植物提取物对血管紧张素酶的抑制作用

毕 业 设 计（论 文）题 目：荧光分光光度法评价环肽类天然植物提取物对血管紧张素酶的抑制作用姓 名： 学 号： 所在学院： 食品与制药工程学院 专业班级： 制药工程 指导教师： 日 期： 毕业设计（论文）专用纸摘 要人工合成的降血压药物如卡托普利(captopril)，西拉普利(cilazapril)，依那普利(enalapril)，赖诺普利(1isinopri)等药物的临床应用表明，抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性能有效地降低血压，但长期使用，耐受性差，常见不良反应，限制了临床使用。中药来源于天然动植物，资源丰富，筛选能有效抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性的中药具有重要的现实意义。目的：本实验采用荧光分光光度法，研究天然植物提取物L5、L6、LA、LB对血管紧张素酶的抑制效果，旨在为开发降血压中药提供科学依据。方法：实验采用体外模型，用96孔板代替传统的比色皿，以马尿酰一组氨酰一亮氨酸(Hippuryl-Lhistidyl-Lleucine，HHL)为ACE反应底物，产物马尿酸(Hippufic acid，HA)为测定指标，卡托普利为阳性对照，通过检测加入前后物质荧光强度的差异，计算该物质对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制率，评价L5、L6、LA、LB对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制作用。结论：试验探究的浓度为10-3M、10-7M天然植物提取物L5、L6、LA、LB对血管紧张素转化酶(ACE)有抑制效果。关键词：血管紧张素酶；血管紧张素酶抑制剂；荧光分光光度法；酶活性IVAbstractClinical application of synthetic blood pressure lowering drugs such as captopril , cilazapril , enalapril , lisinopril and other drugs indicated that inhibition of angiotensin-converting enzyme (ACE) activity could effectively lower blood pressure, but long-term use can cause poor tolerance, common adverse reactions, limiting the clinical use.Chinese medicine is derived from natural flora and fauna, rich in resources, screening Chinese medicine which can effectively inhibit angiotensin converting enzyme (ACE) activity has important practical significance. Objectives:By fluorescence spectrophotometry, study on the angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of natural plant extracts L5, L6, LA, LB effect, designed to provide a scientific basis for the development of blood pressure medicine. Methods:In this study, the vitro experimental model and fluorescence spectrophotometry were used.In addition,instead of the traditional cuvette 96-well plates were used.When the Hippuryl-L-histidyl-L-leucine reacted with ACE, Hippufic acid was producted as the indicators for the determination.Captopril as a positive control,by detecting the fluorescence intensity difference before and after .Calculate inhibition rate and evaluate the inhibition of L5, L6, LA, LB .Conclusions: Natural plant extracts L5, L6, LA, LB can exert inhibitory effect on angiotensin converting enzyme (ACE) at the concentration of 10-3M and 10-7M.Keywords：angiotensin-converting enzyme；angiotensin-converting enzyme inhibitors；fluorescence spectrophotometry；activity目 录摘 要IAbstractII目 录III一 引 言11.1 血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶抑制剂11.1.1 肾素-血管紧张素系统及血管紧张素酶的概述11.1.2 血管紧张素转化酶的调血压机理21.2 酶活性31.2.1 酶活力的影响因素31.2.2 酶活性和质量测定方法及其评价41.2.3 ACEI活性的评价方法51.3 天然血管紧张素转化酶抑制剂的研究进展51.4 荧光分光光度计61.4.1 仪器原理61.4.2 影响荧光强度测定的因素7二 实 验82.1 实验材料与仪器82.1.1 实验仪器82.1.2 实验材料82.1.3 实验溶液92.2 实验方法102.3 实验操作112.3.1 ACE/HHL背景检测、ACE酶活检测112.3.2 卡托普利抑制效率测定112.3.3 样品（L5、L6、LA、LB）抑制活性测定12三 结果与讨论133.1 酶活性对荧光特性物质生成的影响133.2 卡托普利对ACE的抑制活性结果测定143.2.1 不同浓度的卡托普利对ACE的抑制活性测定143.2.2 10-3M卡托普利对ACE的抑制活性测定153.2.3 10-7M卡托普利对ACE的抑制活性测定173.3 样品对ACE的抑制活性结果测定173.3.1 L5、L6（10-3M）对ACE的抑制活性测定173.3.2 L5、L6（10-7M）对ACE的抑制活性测定193.3.3 LA、LB（10-7M）对ACE的抑制活性测定213.4 反应时间对抑制效果的影响233.5 反应体系物质对抑制效果的影响233.6 反应体系中抑制剂浓度的确定23四 结论与展望25致 谢26参考文献27一 引 言高血压是一种常见的心血管疾病，它不仅患病率高，而且常引起严重的心、脑、肾等其他疾病，是脑卒中、冠心病、心力衰竭和肾脏疾病主要危险因素1。高血压是现代社会严重威胁人类健康的“头号杀手”。2010年，中国高血压患者已超过2亿，每年还在以l千万人的速度继续增加2。因此，研究生产高效安全的降血压药物已经成为国内外科学家积极探索的一项重要课题。目前，临床治疗上主要采用合成类降血压药物，如人工合成的降血压药物如卡托普利(captopril)，西拉普利(cilazapril)，依那普利(enalapril)，赖诺普利(1isinopri)等药物的临床应用表明，其疗效虽好，但长期使用，耐受性差副作用较大，如引起降压过度、泌尿系统病变、持续性咳嗽、味觉失真和血管神经性水肿等3,4,5,6。自1965年Ferreira从南美蝮蛇毒液中发现天然ACE抑制剂以来，很多研究者在寻找天然ACE抑制剂方面进行了大量探索。近十多年来，我国在这方面的研究逐渐活跃并开始深入7。人们试图从自然界中找寻天然的ACE活性抑制剂。中药来源于天然动植物，资源丰富8，筛选能有效抑制ACE活性的中药具有重要的现实意义。1.1 血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶抑制剂1.1.1 肾素-血管紧张素系统及血管紧张素酶的概述肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，简称为RAS）或肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system,简称为RAAS）是一个激素系统。当大量失血或血压下降时，这个系统会被启动，用以协助调节体内的长期血压与细胞外液量（体液平衡）。血管紧张素转化酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）是一种二价二肽羧基金属肽酶9，在肾素-血管紧张素（RAS）系统中起着重要作用。当血压降低时，肾脏分泌肾素。肾素催化血管紧张素原水解产生血管紧张素I。血管紧张素I基本没有生物学活性，而是经血管紧张素转化酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）剪切C-末端两个氨基酸残基而形成血管紧张素II。血管紧张素II具有高效的收缩血管作用，从而使血压升高；血管紧张素II也能刺激肾上腺皮质分泌醛固酮。醛固酮能促进肾脏对水和钠离子的重吸收，继而增加体液容量，升高血压。过度激活的肾素-血管紧张素-醛固酮系统是产生高血压的原因之一。下面几类药物可用于抑制肾素-血管紧张素系统：血管紧张素转化酶抑制剂；血管紧张素II受体拮抗剂；肾素抑制剂。血管紧张素转化酶因催化血管紧张素I转化为血管紧张素II和使具有舒张血管或降低血压作用的舒缓激肽（BK，bradykinin)失活这两种功能而成为治疗高血压、心力衰竭、2型糖尿病和糖尿病肾病等疾病的理想靶点。血管紧张素转化酶抑制剂能减少血管紧张素II的生成，并增加缓激肽的活性。1.1.2 血管紧张素转化酶的调血压机理血管紧张素转化酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）广泛存在于肺、肾、脑、眼球、小肠、胎盘等组织的血管内皮细胞或上皮细胞及血浆、尿等体液中10。该酶由一条多肽链构成，N末端为苏氨酸，C末端为丙氨酸，需要阴离子激活，其中Cl-为最有效的激活剂，等电点在4.5左右11,12，人肺组织和血清中ACE分子量为140,000-150,00013。杨严俊等从兔肺提取ACE并进行特异性研究表明，酶活随温度升高而上升，至37达到最大，超过则开始下降。在37时，反应体系pH在7-9稳定性最高，其中最适pH为8.314。该酶具有广泛的底物专一性，除作用于血管紧张素I外，还与含不同C末端氨基酸的肽底物起反应，如舒缓激肽、脑啡肽、P物质等10，能被金属螯合剂、重金属盐和特定肽类所抑制。ACE在人体肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，简称为RAS）和激肽释放酶-激肽系统（Kallikerin-kinin system,简称为KKS）中，对血压调节起着重要作用，见图1-1。RAS和KKS是一对血压调节方面相互拮抗的体系，二者平衡才能维持血压正常。在RAS系统中，肾素能水解血管紧张素原释放出血管紧张素I，经ACE作用去掉其末端的二肽(Histidyl-Lleucine，His-Leu)生成血管紧张素II，它作用于血管壁上的受体使周围小动脉、血管平滑肌收缩，同时刺激醛固酮分泌，促进人体肾脏对Na+、K+的重吸收，引起钠储量和血容量的增加，从而导致血压升高。在KKS系统中，一些激肽如舒缓激肽能扩张毛细血管，增加其通透性，使血压下降。而ACE在该系统中能使舒缓激肽失去C末端的Phe-Arg或Ser-Pro，从而使激肽失活，引起血压升高7,10,11。由此可见，ACE活力升高则破坏了两个系统的平衡，使血压升高。因此，抑制ACE活性对降血压有着关键作用。血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)对实验性高血压动物及高血压患者有明显降压作用。在降压时不引起反射性心率增快，不出现水钠潴留现象，也不易产生耐药性。不同作用强度的ACEI，因其药物结构及药代动力学方面存在差异，在降压作用出现的快慢、作用维持的时间上可呈现不同。研究表明，ACEI的降压作用机制其一是，抑制循环及局部组织中的ACE。由于抑制循环中的ACE，血浆中血管紧张素II和醛固酮浓度降低，从而使血管扩张血容量降低，这是用药初期外周阻力降低、血压下降的主要原因。ACEI对局部组织（血管壁、脑、肾等）中的ACE也有抑制作用，且与局部组织中的ACE结合较持久，对酶的抑制作用也较长，这与ACEI的长期降压作用有关。图1-1 ACE在血压调控系统中的作用1.2 酶活性1.2.1 酶活力的影响因素1.2.1.1 pH值大部分酶的活力受其环境pH值的影响，在一定pH值下，酶促反应有最大速率，高于或低于此值，反应速率都会下降，通常称此pH值为酶促反应的最适pH值。强酸强碱会影响酶蛋白的构象，甚至使酶变性而失活。当pH值改变不很强烈时，酶虽然不变性，但活力会受影响。pH值影响分子中其他一些基团的解离，这些基团的离子化状态与酶的专一性及酶分子中活力中心的构象有关。1.2.1.2 温度每一种酶都有一个最适温度，即使酶发挥最大催化效应的温度。酶的最适温度不是特征物理常数，而与酶的作用时间、酶浓度、底物、酶活剂和抑制剂等因素有关。最适温度会随作用时间的改变而改变，作用时间长，酶的最适温度就低；作用时间短，酶的最适温度较高。1.2.1.3 激活剂凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂，其中大部分是离子或小分子有机化合物。（1）金属离子。金属离子对酶的作用有两种，一是作为酶的辅因子起作用，二是作为激活剂起作用。作为激活剂起作用的有K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+和Ca2+等，其中Mg2+是多种激酶和合成酶的激活剂。（2）阴离子。在一般浓度下，阴离子的激活作用并不明显。Cl-、Br-有激活作用，但Br-激活作用比较弱。1.2.1.4 抑制剂酶在不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性降低或丧失，成为抑制作用（inhibition）。能引起这种抑制作用的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。研究抑制剂对酶的作用是非常重要的，很多药物是酶的抑制剂，通过对病原体内某些酶的抑制作用或改变体内某些酶的活性而发挥其治疗功效，了解酶的抑制作用是阐明药物作用机制和设计研究新药的重要途径。1.2.2 酶活性和质量测定方法及其评价1.2.2.1 酶活性测定方法（1）按反应时间分类法：定时法：通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求酶反应初速度的方法，称为两点法（其中t1往往取反应开始的时间）。在酶反应一定时间后，通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，使反应完全停止，所以也叫中止反应法。连续监测法：又称为动力学法或速率法、连续反应法。在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。平衡法：通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。（2）按监测方法分类：分光光度法；旋光法；荧光法；电化学方法；化学反应法；核素测定法；量热法。1.2.2.2 酶质量测定法：随着免疫技术的发展，出现了利用酶的抗原性，通过抗原、抗体反应来直接测定酶的质量，直接用质量单位（ng/ml、g/L）来表示酶含量的高低，所得结果的诊断价值高。用免疫学方法比测定酶活性方法的优点是灵敏度和特异性高，且不受体液中其他物质的影响，特别是抑制剂和激活剂的影响，当血液中有酶抑制剂存在，或因基因缺陷，合成了无活性的酶蛋白时，可以测出灭活的酶蛋白量，有利于疾病诊断和科学研究。1.2.3 ACEI活性的评价方法 ACEI的评价方法主要有体内试验和体外检测两种。体外检测法目前大都采用Cushman15等建立的方法或做相应修改。其主要原理是ACE在pH8.3、37及Cl-激发条件下，能水解马尿酰组氨酰亮氨酸(Hippuryl-Lhistidyl-Lleucine，简称为HHL)产生马尿酸(Hippufic acid，HA)，该物质在288nm处有最大光吸收，产生马尿酸的量与ACE活性成正比。测定时，在ACE和HHL反应体系中加入抑制剂，以未加抑制剂的为对照，反应结束后用乙酸乙酯分别萃取出各体系中的马尿酸，蒸干乙酸乙酯并用水溶解后在288nm下测吸光值，将两者吸光值的差值与对照系的吸光值相比，计算出抑制率，作为ACE抑制剂的活性16,17。体内试验主要是动物实验和临床实验。动物实验一般以自发性高血压鼠(Sponianeously Hypertensive Rat，简称SHR)为研究对象，通过饲喂或静脉注射ACE抑制剂，测量试验前后SHR的血压变化来衡量抑制活性的大小18。根据饲喂次数，可将实验分为短期实验和长期实验。短期试验只测一次性口服ACEI前后的血压变化;长期实验是每天饲喂一次或每周一次连续几周甚至十几周，连续观察SHR的收缩压变化。临床实验主要通过选择若千位临界高血压患者和轻微高血压患者，连续测量各人血压得到平均值作为基本值。而后随机分成两组，一组每日食用一定剂量的ACEI，另一组作对照，测两组患者血压变化差异进行酪蛋白源血管紧张素转换酶抑制肤制备及分离纯化研究统计分析19。一般来说，体外检测法方便、快捷，条件较易达到，稳定性也较好，已经成为国内外研究者主要采用的方法。但在生物体中，ACE抑制肤的抑制效果可能跟体外检测结果相差较大。这是因为ACE抑制剂摄入体内，经蛋白酶水解后可能变成降血压活性更高的片段，也有可能被水解成降血压活性较低或几乎没有活性的片段20。因此，测定ACE抑制剂活性可以采用体外检测和体内试验，但要得到降血压的实际效果，必须进行体内试验检测。由于体内试验方法条件要求较高，实验操作繁琐，且饲喂周期较长，给检测带来诸多不便，目前一般在前期研究中多以体外检测为主，在产品研发后期才采用体内试验。1.3 天然血管紧张素转化酶抑制剂的研究进展目前，国内研究比较成熟的是茶多酚对ACE活性的抑制和降压机理。本实验采用体外模型9，以马尿酰一组氨酰一亮氨酸(Hippuryl-Lhistidyl-Lleucine，HHL)为ACE反应底物，产物马尿酸(Hippufic acid，HA)为测定指标，卡托普利为阳性对照，研究中药提取物及活性部位抑制ACE的效果，旨在为开发降血压中药提供科学依据。因此，如何有效预防高血压成为人们共同面对的挑战。相关研究证明，血压升高与血管紧张素转化酶(angiotensinconverting enzyme，ACE)有着密切的关联，ACE是一种含锌的羧二肽酶，能够将血管紧张素I转化成强有力的血管收缩剂血管紧张素II，同时还能降解具有舒张血管或降低血压作用的舒缓激肽（BK，bradykinin)。可见ACE在升高人体血压过程中发挥非常关键的作用。因此，研究血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）成为心血管系统药物研究的一大热点。近20年来人们主要是从各种食品中寻找降血压肽，通过体外测定和动物实验来评价血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性的大小，证明它们的降血压作用。目前，ACEI活性检测主要包括体外检测和体内检测(动物降血压试验)。体外检测模型简单，快速、准确，重复性高，在初期的研究和工艺筛选过程中，往往使用体外检测。因此，选择一种快速高效、准确可靠的体外检测方法是ACEI类药物研究过程中要首先解决的问题。由于传统方法需要先提取出马尿酸，操作繁琐，耗时，检测结果误差难以控制。许多研究者对这一方法进行了改进，利用HPLC或高效毛细管电泳等方法定量检测马尿酸，无须提取步骤，提高了检测的准确性，灵敏度和重现性也较好，但样品前处理及检测过程耗时，需消耗大量有机溶剂或缓冲溶液，检测成本较高21。本研究采用微量法直接测定ACEI活性，省去了萃取步骤，简化实验操作，用96孔板代替传统的比色皿，用荧光分光光度计，试剂用量少，大幅提高了检测速度和精密度，建立了一种方便快捷、试剂用量少、经济实用的检测方法。1.4 荧光分光光度计1.4.1 仪器原理用于测量荧光/磷光/发光的LS 45/55是由图1-2所示的五个主要部件组成的：光源、激发光单色器、样品池、发光单色器及检测器。由光源发出的光经激发光单色器得到所需要的激发光波长。如其强度为I0 ，通过样品池后，由于一部分光能被荧光物质吸收，其透射光强度减为It 。荧光物质被激发后，将发射荧光。为了消除入射光和散射光的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向进行。为了消除可能共存的其他光纤的干扰，如由激发光所产生的反射光、瑞利散射光和拉曼光，以及为将溶液中的杂质所发生的荧光滤去，以获得所需要的荧光，在样品池和检测器之间设置了发光单色器，荧光作用于检测器上，得到了相应的电信号，经放大后再记录下来。图1-2 LS 45/55 荧光/磷光/发光分光光度计的原理图1.4.2 影响荧光强度测定的因素1.4.2.1 激发光照射有一些荧光物质若受到强光照射，会发生分解而导致荧光强度（F）减弱。所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在测定时才打开光闸让激发光照射样品。1.4.2.2 温度温度升高，荧光效率下降，荧光强度（F）减弱。（因为温度升高，增加分子间碰撞机会而使能量消耗掉）1.4.2.3 pH值pH值能改变某些荧光物质的电子构型从而影响荧光强度。所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当范围内。1.4.2.4 溶剂有些溶剂会使荧光效率下降，也可能带来干扰荧光。28二 实 验2.1 实验材料与仪器2.1.1 实验仪器表2-1 实验仪器 仪器名称厂家型号转移脱色摇床其林贝尔仪器制造TS-8电热恒温培养箱上海精宏DNP-90224冰箱青岛海尔DW-40W100微量分析旋转工作台天津市兰标电子科技pH计Mettler-ToledoDELTA320电子天平奥豪斯AR1140微量移液器Eppendorf10-1000L2-20L0.2-2L 电热恒温鼓风干燥箱重庆银河CS101-2AB2.1.2 实验材料表2-2 实验材料 药品名称厂家规格氯化钠国药集团化学试剂分析纯氢氧化钠上海实验试剂分析纯硼酸国药集团化学试剂分析纯邻苯二甲醛国药集团化学试剂化学纯二甲亚砜国药集团化学试剂分析纯卡托普利化学对照品HHLSigma 2.1.3 实验溶液2.1.3.1 硼酸钠缓冲液（1）称量:分别称取3.019g硼酸、2.191g氯化钠固体，转移至100ml干燥小烧杯中。（2）溶解:加入蒸馏水约至80ml，用玻璃棒搅拌或旋转加热促溶。（3）调pH。测得pH0=3.72，用100-1000l移液枪移取氢氧化钠浓溶液，边滴加边搅拌，至pH=8.3。（4）减压抽滤。收集滤液至量筒。（5）定容:用蒸馏水定容至100ml。（6）转移:将量筒中100ml硼酸钠缓冲液转移至100ml贮液瓶内，室温放置。2.1.3.2 邻苯二甲醛（1）移取1ml二甲亚砜（DMSO）于2ml离心管中。（2）称取0.020g邻苯二甲醛，转移至上述离心管中。（3）用锡纸包裹，封口纸封口，室温避光保存。2.1.3.3 5mM HHL反应液（1）准备洁净干燥的100ml烧杯、100ml贮液瓶。（2）配置25mM氢氧化钠溶液。称取0.0467gNaOH(s)，加入到100ml烧杯中，加蒸馏水至20ml左右，搅拌促溶，在量筒中定容至46.7ml，得到46.7ml 25mM NaOH溶液。（3）移取800l 25mM NaOH溶液于1.5ml离心管中，称取0.0085g HHL于其中，得到800l 25mM HHL贮液。（4）在微量旋转工作台上旋转促溶，并用滤膜过滤器过滤。（5）将25mM HHL贮液与硼酸钠缓冲液按1:4（600l:2400l）的比例混合，配置成3000l 5mM HHL反应液。2.1.3.4 10g/ml ACE（1）移取297l 硼酸钠缓冲液于1.5ml 离心管中。（2）移取3l 1（U/mg）/mL的ACE溶于297l 硼酸钠缓冲液中，得到300l 10g/ml ACE。（3）旋转促溶，-20保藏。2.1.3.5 卡托普利溶液（1）称取0.0010g卡托普利于10ml离心管中。（2）移取5ml硼酸钠缓冲液于其中，旋转促溶，得到5ml 10-3M卡托普利溶液。（3）移取1l 10-3M卡托普利溶液于2ml离心管中，加入99l 硼酸钠缓冲液，旋转混匀，得到100l 10-5M卡托普利溶液。（4）其他浓度（10-7，10-9，10-11M）的卡托普利溶液依照此法，逐级稀释得到。2.2 实验方法本实验中，体外检测方法采用荧光分光光度法，用96孔板代替传统的比色皿。检测原理：通过加入血管紧张素I的模拟底物马尿酰组氨酰亮氨酸HHL，在一定条件下与ACE作用，ACE可酶解HHL生成马尿酸(Hippufic acid，HA)和二肽(Histidyl-Lleucine),二肽(Histidyl-Lleucine，His-Leu)是具有荧光特性的物质。加入ACEI后，抑制了His Leu的生成，荧光强度（F）也随之降低。通过检测加入前后物质荧光强度的差异，计算该物质对ACE的抑制率。ACE + HHL 马脲酸 + His - Leu卡托普利实验方案如下：阳性对照组 ACE + HHL 检测F硼酸钠缓冲液液阴性对照组 ACE + HHL 检测F卡托普利硼酸钠缓冲液硼酸钠缓冲液空白对照组 + 检测FL5/L6实验组 ACE + HHL 检测FL5/L6硼酸钠缓冲液硼酸钠缓冲液 + 检测F2.3 实验操作37，10min 预热2.3.1 ACE/HHL背景检测、ACE酶活检测（1）95l硼酸钠缓冲液 + 10l 10g/ml ACE 37，10min 预热 60l 5mM HHL + 40l 硼酸钠缓冲液 37，10min 预热 60l 5mM HHL+30l 硼酸钠缓冲液+10l 10g/ml ACE（2）各加入加入5l邻苯二甲醛，避光室温反应10min。（3）在Ex=395nm，10*10，Em=460nm处检测30min内荧光强度变化。2.3.2 卡托普利抑制效率测定（1）阳性对照组 10-3M；10-5M；10-7M；10-9M；10-11M卡托普利溶液各5l+5l 10g/ml ACE 反应37，15min 反应37，30min + 60l 5mM HHL 反应37，30min 反应37，15min 阴性对照组 5l硼酸钠缓冲液+5l 10g/ml ACE + 60l 5mM HHL 空白对照组 10-3M；10-5M；10-7M；10-9M；10-11M卡托普利溶液各5l+5l 硼酸钠缓冲液 反应37，15min 反应37，30min + 60l 5mM 硼酸钠缓冲液（2）各加入加入5l邻苯二甲醛，避光室温反应10min。（3）在Ex=395nm，10*10，Em=460nm处检测30min内荧光强度变化。2.3.3 样品（L5、L6、LA、LB）抑制活性测定（1）阳性对照组 10-3M；10-5M；10-7M；10-9M；10-11M样品溶液各5l+5l 10g/ml ACE 反应37，15min 反应37，30min + 60l 5mM HHL 反应37，15min 反应37，30min 阴性对照组 5l硼酸钠缓冲液+5l 10g/ml ACE + 60l 5mM HHL 空白对照组 10-3M；10-5M；10-7M；10-9M；10-11M样品溶液各5l+5l 硼酸钠缓冲液 反应37，30min 反应37，15min + 60l 5mM 硼酸钠缓冲液（2）各加入加入5l邻苯二甲醛，避光室温反应10min。（3）在Ex=395nm，10*10，Em=460nm处检测30min内荧光强度变化。 三 结果与讨论3.1 酶活性对荧光特性物质生成的影响取10l ACE （3l 1（U/mg）/mL的ACE溶于297l 硼酸钠缓冲液（pH=8.3，含375mol/L NaCl）10g/ml于平底96孔板，加入60l 5mM 底物HHL，用30l 硼酸钠缓冲液（pH=8.3，含375mol/L NaCl）补充到总体积100l，平行设置三个样，于37保温10min。各加入加入5l邻苯二甲醛，避光室温反应10min。在Ex=395nm，10*10，Em=460nm处检测30min内荧光强度变化。结果见图3-1和图3-2。图3-1 3.12背景及酶活检测（酶）图3-2 3.15背景及酶活检测（酶）由图3-1可见，使用I酶时，30min内检测到其与底物反应后的荧光强度随时间推移升高，FL值在49范围内变化。由图3-2可见，使用II酶时，30min内检测到其与底物反应后的荧光强度随时间推移升高，FL值在1215范围内变化。因此，不同活性的酶与底物反应后荧光强度有差异，活性高的酶与底物反应后所检测到的荧光强度也较高。3.2 卡托普利对ACE的抑制活性结果测定3.2.1 不同浓度的卡托普利对ACE的抑制活性测定取用I酶和I卡托普利，卡托普利浓度为10-3M、10-5M、10-7M、10-9M、10-11M。采用卡托普利与酶预反应30min 后加底物HHL反应15min，HHL用量60l，按照实验方案设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组。在Ex=395nm，10*10，Em=460nm处检测30min内荧光强度变化。结果见图3-3。图3-3 不同浓度卡托普利对ACE抑制活性的测定由图3-3可见，b曲线为阴性对照，阳性对照组中，抑制效果a3a5a2a4a1， 即10-710-11M10-5M10-910-3M。该结果与文献研究结论22不一致，差别较大，分析可能的原因是I酶或I卡托普利放置时间太久，活性有所改变。3.2.2 10-3M卡托普利对ACE的抑制活性测定取用酶（II）分别与卡托普利卡（I）和卡托普利（II）反应，卡托普利浓度为10-3M。采用卡托普利与酶预反应60min 后加底物HHL反应30min，HHL用量40l，按照实验方案设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组。在Ex=395nm，10*10，Em=460nm处检测30min内荧光强度变化。表3-1 10-3M卡托普利（I）对ACE酶抑制活性的测定time阳性对照阴性对照空白对照抑制率010.86510.6963.180-0.022311.98611.9743.311-0.001613.20213.2243.3480.002914.11114.1643.3650.0051215.13515.1473.4380.0011515.97616.0783.5540.008表3-2 10-3M卡托普利（II）对ACE酶抑制活性的测定time阳性对照阴性对照空白对照空底板抑制率05.92850.5566.6092.794101.55%36.12251.8786.7382.733101.36%66.20353.5206.6432.697100.94%96.17855.5226.7552.698101.18%126.23057.0396.7452.653101.02%156.25558.6476.8062.659101.06%图3-4 10-3M卡托普利（I）对ACE酶的抑制活性测定图3-5 10-3M卡托普利（II）对ACE酶抑制