系统生物学方法第二篇.ppt

1,系统生物学方法第二篇（2）,孟大志 北京工业大学 Tel: (010) 697555962,2. 蛋白质 细胞中有机物达几千种之多，约占细胞干重的90以上，它们主要由碳、氢、氧、氮等元素组成。有机物中主要由四大类分子所组成，即蛋白质、核酸、脂类和糖，这些分子约占细胞干重的90%以上。,1). 蛋白质定义及概述 蛋白质是一种复杂的有机化合物，旧称“朊”。组成蛋白质的基本单位是氨基酸，氨基酸通过脱水缩合形成肽链。蛋白质是由一条或多条多肽链组成的生物大分子，每一条多肽链有二十数百个氨基酸残基不等；各种氨基酸残基按一定的顺序排列。蛋白质的氨基酸序列是由对应基因所编码。除了遗传密码所编码的20种“标准”氨基酸，在蛋白质中，某些氨基酸残基还可以被翻译后修饰而发生化学结构的变化，从而对蛋白质进行激活或调控。多个蛋白质可以结合在一起形成稳定的蛋白质复合物，发挥某一特定功能。产生蛋白质的细胞器是核糖体。,3,蛋白质（protein）是生命的物质基础，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。有机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16.3%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.8kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。被食入的蛋白质在体内经过消化分解成氨基酸，吸收后在体内主要用于重新按一定比例组合成人体蛋白质，同时新的蛋白质又在不断代谢与分解，时刻处于动态平衡中。,4,2). 蛋白质的性质 具有化学两性 蛋白质是由-氨基酸通过肽键构成的高分子化合物，在蛋白质分子中存在着氨基和羧基，因此跟氨基酸相似，也是两性物质。 可发生水解反应 蛋白质在酸、碱或酶的作用下发生水解反应，经过多肽，最后得到多种-氨基酸。 溶水具有胶体的性质 有些蛋白质能够溶解在水里（例如鸡蛋白能溶解在水里）形成溶液，具有胶体性质。 蛋白质的分子直径达到了胶体微粒的大小（109107m）时，所以蛋白质具有胶体的性质。,5,加入电解质可产生盐析作用 少量的盐（如硫酸铵、硫酸钠等）能促进蛋白质的溶解，如向蛋白质水溶液中加入浓的无机盐溶液，可使蛋白质的溶解度降低，而从溶液中析出，这种作用叫做盐析 这样盐析出的蛋白质仍旧可以溶解在水中，而不影响原来蛋白质的性质，因此盐析是个可逆过程利用这个性质，采用盐析方法可以分离提纯蛋白质 蛋白质的变性 在热、酸、碱、重金属盐、紫外线等作作用下，蛋白质会发生性质上的改变而凝结起来这种凝结是不可逆的，不不能再使它们恢复成原来的蛋白质，失去了它们生理上的作用蛋白质的这种变化叫做变性,6,3).蛋白质的折叠过程 20世纪最惊人的发现之一就是许多蛋白质的活性状态和失活状态可以互相转化，在一个精确控制的溶液条件下（例如通过透析除去导致失活的化学物质），失活的蛋白质可以转变为活性形式。如何使蛋白质恢复到它们的活性状态使生物化学的一个主要研究领域，称为蛋白质折叠学。,蛋白质折叠机理的研究，对保留蛋白质活性，维持蛋白质稳定性都具有重要的意义。 序列本身已经包括了蛋白质正确折叠的所有信息，由于提出蛋白质折叠的热力学假说，Anfinsen获得1972年诺贝尔化学奖。这一理论有两个关键点： a.蛋白质的状态处于去折叠和天然构象的平衡中； b.天然构象的蛋白质处于热力学最低的能量状态。,7,尽管蛋白质的氨基酸序列在蛋白质的正确折叠中起着核心的作用，但是各种各样的因素，包括信号序列，辅助因子，分子伴侣，环境条件，均会影响蛋白质的折叠，新生蛋白质折叠并组装成有功能的蛋白质，并非都是自发的，在多数情况下是需要其它蛋白质的帮助，已经鉴定了许多参与蛋白质折叠的折叠酶和分子伴侣，蛋白质“自发折叠”的经典概念发生了转变和更新，但这并不与折叠的热力学假说相矛盾，而是在动力学上完善了热力学观点。在蛋白质的折叠过程中，有许多作用力参与，包括一些构象的空间阻碍，范德华力，氢键的相互作用，疏水效应，离子相互作用，多肽和周围溶剂相互作用产生的熵驱动的折叠。 但对于蛋白质获得天然结构这一复杂过程的特异性，还知之甚少，许多实验和理论的工作都在加深对折叠的认识，但是问题仍然没有解决。,8,蛋白质的四级结构,9,4）蛋白质的生理功能 a、构造组织：蛋白质是一切生命的物质基础，是肌体细胞的重要组成部分，是人体组织更新和修补的主要原料。人体的每个组织：毛发、皮肤、肌肉、骨骼、内脏、大脑、血液、神经、内分泌等都是由蛋白质组成。 b、修补人体组织：人的身体由百兆亿个细胞组成，细胞可以说是生命的最小单位，它们处于永不停息的衰老、死亡、新生的新陈代谢过程中。例如年轻人的表皮28天更新一次，而胃黏膜两三天就要全部更新。 c、维持肌体正常的新陈代谢和各类物质在体内的输送。载体蛋白对维持人体的正常生命活动是至关重要的。可以在体内运载各种物质。比如血红蛋白输送氧（红血球更新速率250万/秒）、脂蛋白输送脂肪、细胞膜上的受体还有转运蛋白等。 d、白蛋白：维持机体内的渗透压的平衡及体液平衡。 e、维持体液的酸碱平衡。,10,f、免疫细胞和免疫蛋白：有白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、抗体（免疫球蛋白）、补体、干扰素等。七天更新一次。 g、构成人体必需的催化和调节功能的各种酶。 h、激素的主要原料。具有调节体内各器官的生理活性。胰岛素是由51个氨基酸分子合成。生长素是由191个氨基酸分子合成。 k、构成神经递质乙酰胆碱、五羟色氨等。维持神经系统的正常功能：味觉、视觉和记忆。 j、胶原蛋白：占身体蛋白质的1/3，生成结缔组织，构成身体骨架。如骨骼、血管、韧带等，决定了皮肤的弹性，保护大脑（在大脑脑细胞中，很大一部分是胶原细胞，并且形成血脑屏障保护大脑） l、提供热能。,11,5). 常见蛋白质 纤维蛋白（fibrous protein） 球蛋白(globular protein 角蛋白（keratin） 胶原蛋白（collagen） 伴娘蛋白（chaperone）:与一种新合成的多肽链形成复合物并协助它正确折叠成具有生物功能构向的蛋白质。伴娘蛋白可以防止不正确折叠中间体的形成和没有组装的蛋白亚基的不正确聚集，协助多肽链跨膜转运以及大的多亚基蛋白质的组装和解体。 肌红蛋白（myoglobin） 血红蛋白（hemoglobin） 别构效应（allosteric effect）:又称为变构效应，是寡聚蛋白与配基结合改变蛋白质的构象，导致蛋白质生物活性丧失的现象。,12,3. 细胞的其他有机分子 1). 核酸 核酸是生物遗传信息的载体分子，所有生物均含有核酸。核酸是由核苷酸单体聚合而成的大分子。核酸可分为核糖核酸RNA和脱氧核糖核酸两大类DNA。当温度上升到一定高度时，DNA双链即解离为单链，称为变性（denaturation）或熔解（melting），这一温度称为熔解温度（melting temperature，Tm）。碱基组成不同的DNA，熔解温度不一样，含GC对（3条氢键）多的DNA，Tm高；含AT对（2条氢键）多的，Tm低。当温度下降到一定温度以下，变性DNA的互补单链又可通过在配对碱基间形成氢键，恢复DNA的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation）或退火（annealing）。 DNA有三种主要构象 B-DNA：为Watson&Click提出的右手螺旋模型，每圈螺旋10个碱基，螺旋扭角为36度，螺距34A，每个碱基对的螺旋上升值为3.4A，碱基倾角为-2度。 A-DNA：为右手螺旋，每圈螺旋10.9个碱基，螺旋扭角为33度，螺距32A，每个碱基对的螺旋上升值为2.9A，碱基倾角为13度。 Z-DNA：为左手螺旋，每圈螺旋12个碱基，螺旋扭角为-51度（GC）和-9度（CG），螺距46A，每个碱基对的螺旋上升值为3.5A（GC）和4.1A（CG），碱基倾角为9度。,13,Adenine腺嘌呤，guanine鸟嘌呤，thymine胸腺嘧啶，cytosine胞腺嘧啶,14,2). 糖类 细胞中的糖类既有单糖，也有多糖。细胞中的单糖是作为能源以及与糖有关的化合物的原料存在。重要的单糖为五碳糖（戊糖）和六碳糖（己糖），其中最主要的五碳糖为核糖，最重要的六碳糖为葡萄糖。葡萄糖不仅是能量代谢的关键单糖，而且是构成多糖的主要单体。 多糖在细胞结构成分中占有主要的地位。细胞中的多糖基本上可分为两类：一类是营养储备多糖；另一类是结构多糖。作为食物储备的多糖主要有两种，在植物细胞中为淀粉（starch），在动物细胞中为糖元（glycogen）。在真核细胞中结构多糖主要有纤维素（cellulose）和几丁质（chitin）。,15,3). 脂类 脂类包括：脂肪酸、中性脂肪、类固醇、蜡、磷酸甘油酯、鞘脂、糖脂、类胡萝卜素等。脂类化合物难溶于水，而易溶于非极性有机溶剂。 甘油酯：甘油酯为能源物质，氧化时可比糖或蛋白质释放出高两倍的能量。营养缺乏时，就要动用甘油酯提供能量。 蜡：脂肪酸同长链脂肪族一元醇或固醇酯化形成蜡（如蜂蜡）。 磷脂：磷脂对细胞的结构和代谢至关重要，它是构成生物膜的基本成分，也是许多代谢途径的参与者。分为甘油磷脂和鞘磷脂两大类。,16,3. 酶与生物催化剂 1）酶 酶是蛋白质性的催化剂，主要作用是降低化学反应的活化能，增加了反应物分子越过活化能屏障和完成反应的概率。酶的作用机制是，在反应中酶与底物暂时结合，形成了酶底物活化复合物。这种复合物对活化能的需求量低，因而在单位时间内复合物分子越过活化能屏障的数量就比单纯分子要多。反应完成后，酶分子迅即从酶底物复合物中解脱出来。 酶的主要特点是：具有高效催化能力、高度特异性和可调性；要求适宜的pH和温度；只催化热力学允许的反应，对正负反应的均具有催化能力，实质上是能加速反应达到平衡的速度。,17,2）RNA催化剂 T.Cech 1982发现四膜虫（Tetrahymena）rRNA的前体物能在没有任何蛋白质参与下进行自我加工，产生成熟的rRNA产物。这种加工方式称为自我剪接（self splicing）。后来又发现，这种剪下来的RNA内含子序列像酶一样，也具有催化活性。此RNA序列长约400个核苷酸，可褶叠成表面复杂的结构。它也能与另一RNA分子结合，将其在一定位点切割开，因而将这种具有催化活性的RNA序列称为核酶（Ribozyme）。后来陆续发现，具有催化活性的RNA不只存在于四膜虫，而是普遍存在于原核和真核生物中。一个典型的例子核糖体的肽基转移酶，过去一直认为催化肽链合成的是核糖体中蛋白质的作用，但事实上具有肽基转移酶活性和催化形成肽键的成分是RNA，而不是蛋白质，核糖体中的蛋白质只起支架作用。,18,第二章 分子生物组学,第一节 基因组,1.基因表达 基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子。 生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。,19,20,1）.转录过程 在RNA聚合酶的催化下, 以DNA为模板合成mRNA的 过程称为转录(transcription). 在双链DNA中,作为转录模板 的链称为模板链 (template strand),或反义链 (antisensestrand);而不作为 转录模板的链称为编码链 (coding strand),或有义链(sense strand).在双链DNA中与转录模板互补的一条DNA链即编码链,它与转录产物的差异仅在于DNA中T变为RNA中的U。在含许多基因的DNA双链中,每个基因的模板链并不总是在同一条链上,亦即一条链可作为某些基因的模板链的,也可是另外一些基因的编码链。 转录后要进行加工,转录后的加工包括：,21,22,（1）剪接：一个基因的外显子和内含子都转录在一条原始转录物RNA分子中，称为前mRNA(pre-mRNA)，又称核内异质RNA（heterogenuous nuclear RNA,huRNA）。因此前mRNA分子既有外显子顺序又有内含子顺序，另外还包括编码区前面及后面非翻译顺序。这些内含子顺序必须剪除而把外显子顺序连接起来，才能产生成熟的有功能的mRNA分子，这个过程称为RNA剪接（RNA splicing）。剪切发生在外显子的3末端的GT和内含子3末端与下一个外显子交界的AG处。 （2）加帽：几乎全部的真核 mRNA 端都具“帽子”结构。虽然真核生物的mRNA的转录以嘌呤核苷酸三磷酸（pppAG或pppG）领头，但在5端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7GpppAGpNp）。mNRA5端的这种结构称为帽子（cap）。不同真核生物的mRNA具有不同的帽子。 mRNA的帽结构功能：能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合；m7Gppp结构能有效地封闭RNA 5末端，以保护mRNA免疫5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。,23,（3）加尾：大多数真核生物的mRNA 3末端都有由100200个A组成的聚乙烯Poly（A）尾巴。Poly(A)尾不是由DNA编码的，而是转录后的前mRNA以ATP为前体，由RNA末端腺苷酸转移酶，即Ploy(A)聚合酶催化聚合到3末端。加尾并非加在转录终止的3末端，而是在转录产物的3末端，由一个特异性酶识别切点上游方向1320碱基的加尾识别信号AAUAAA以及切点下游的保守顺序GUGUGUG，把切点下游的一段切除，然后再由Poly(A)聚合酶催化，加上Poly(A)尾巴，如果这一识别信号发生突变，则切除作用和多聚腺苷酸化作用均显著降低。 mRNAPoly(A)尾的功能是：可能有助mRNA从核到细胞质转运；避免在细胞中受到核酶降解，增强mRNA的稳定性。,24,2）翻译过程 真核细胞的转录以及加工都是细胞核内进行，但翻译过程则在细胞质中进行。 以mRNA作为模板，tRNA作为运载工具，在有关酶、辅助因子和能量的作用下将活化的氨基酸在核糖体（亦称核蛋白体）上装配为蛋白质多肽链的过程，称为翻译（translation）,这一过程大致可分为3个阶段： （1）肽链的起始：在许多起始因子的作用下，首先是核糖体的小亚基和mRNA上的起始密码子结合，然后甲酰甲硫氨酰tRNA(tRNA fMet)结合上去，构成起始复合物。通过tRNA的反密码子UAC，识别mRNA上的起始密码子AUG，并相互配对，随后核糖体大亚基结合到小亚基上去，形成稳定的复合体，从而完成了起始的作用。,25,（2）肽链的延和长：核糖体上有两个结合点P位和A位，可以同时结合两个氨酰tRNA。当核糖体沿着mRNA从53移动时，便依次读出密码子。首先是tRNA-fMet结合在P位，随后第二个氨酰tRNA进入A位。此时，在肽基转移酶的催化下，P位和A位上的2个氨基酸之间形成肽键。第一个tRNA失去了所携带的氨基酸而从P位脱落，P位空载。A位上的氨酰tRNA在移位酶和GTP的作用下，移到P位，A位则空载。核糖体沿mRNA 5端向3端移动一个密码子的距离。第三个氨酰tRNA进入A位，与P位上氨基酸再形成肽键，并接受P位上的肽链，P位上tRNA释放，A位上肽链又移到P位，如此反复进行，肽链不断延长，直到mRNA的终止密码出现时，没有一个氨酰tRNA可与它结合，于是肽链延长终止。,26,（3）肽链的终止：终止信号是mRNA上的终止密码子（UAA、UAG或UGA）。当核糖体沿着mRNA移动时，多肽链不断延长，到A位上出现终止信号后，就不再有任何氨酰tRNA接上去，多肽链的合成就进入终止阶段。在释放因子的作用下，肽酰tRNA的的酯键分开，于是完整的多肽链和核糖体的大亚基便释放出来，然后小亚基也脱离mRNA。 （4）翻译后加工（postranslational processing）：从核糖体上释放出来的多肽需要进一步加工修饰才能形成具有生物活性的蛋白质。翻译后的肽链加工包括肽链切断，某些氨基酸的羟基化、磷酸化、乙酰化、糖基化等。真核生物在新生肽链翻译后将甲硫氨酸裂解掉。有一类基因的翻译产物前体含有多种氨基酸顺序，可以切断为不同的蛋白质或肽，称为多蛋白质（polyprotein）。例如胰岛素（insulin）是先合成86个氨基酸的初级翻译产物，称为胰岛素原（proinsulin），胰岛素原包括A、B、C三段，经过加工，切去其中无活性的C肽段，并在A肽和B肽之间形成二硫键，这样才得到由51个氨基酸组成的有活性的胰岛素。,27,28,3）外显子与内含子表达过程中的相对性 从内含子与外显子的定义来看，两者是不能混淆的，但是真核生物的外显子也并非都“显”（编码氨基酸），除了tRNA基因和rRNA基因的外显子完全“不显”之外，几乎全部的结构基因的首尾两外显子都只有部分核苷酸顺序编码氨基酸，还有完全不编码基酸的外显子，如人类G6PD基因的第一外显子核苷酸顺序。 现在已发现一个基因的外显子可以是另一基因的内含子，反之亦然。,29,4）基因扩增(gene amplification) 细胞内选择性复制DNA, 产生大量的拷贝。如两栖类卵母细胞在发育的早期，rRNA基因的数量扩增到1000多倍。基因扩增是通过形成几千个核进行的，每个核里含有几百拷贝的编码28S、18S和5.8S的rRNA基因，最后卵母细胞中的这些rRNA基因的拷贝数几乎达到50万个，而在相同生物的其它类型细胞中，这些rRNA基因的拷贝数只有几百个。卵母细胞中有如此众多的rRNA基因拷贝，为卵细胞在受精后的发育过程中合成大量核糖体创造了条件。 核糖体RNA：即rRNA，是最多的一类RNA，也是3类RNA（tRNA,mRNA,rRNA)中相对分子质量最大的一类RNA，它与蛋白质结合而形成核糖体，其功能是作为mRNA的支架，使mRNA分子在其上展开，实现蛋白质的合成。rRNA占RNA总量的82左右。,30,2. 基因调控（gene expression，regulation of） 生物体内控制基因表达的机制，主要过程是基因的转录和信使核糖核酸（mRNA）的翻译。因此基因调控主要发生在3个水平上，即DNA水平上的调控、转录控制和翻译控制；微生物通过基因调控可以改变代谢方式以适应环境的变化，这类基因调控一般是短暂的和可逆的；多细胞生物的基因调控是细胞分化、形态发生和个体发育的基础，这类调控一般是长期的，而且往往是不可逆的。基因调控的研究有广泛的生物学意义，是发生遗传学和分子遗传学的重要研究领域。 通过基因调控，微生物可以避免过多地合成氨基酸、核苷酸之类物质。如果使它们的调节基因发生突变，就可以得到大量合成这些物质的菌种 ，把这些菌种用在发酵工业上，使产量大幅度增长。在遗传工程的研究中应用基因调控的原理可使外源基因表达，所以基因调控的理论探讨还具有生产实践意义。,31,生物体内的每个细胞都有全套的基因，但细胞中的基因并不是同时表达的。因细胞的类型和执行的功能不同，细胞中有的基因开启，有的基因关闭。如血红蛋白基因只在红细胞中表达，消化酶只在消化腺细胞中表达。这其中存在着复杂的基因调控。 基因表达的调控可以在不同的层次、不同的水平上进行，大致可分为以下五个方面。 1).转录调控 细胞可以通过控制基因转录mRNA的拷贝数来调控基因的产物。例如，红细胞中组成血红蛋白的和多肽的基因快速、大量地转录，产生大量的mRNA分子，形成大量的血红蛋白分子。其他任何一个细胞都有这些基因，但不转录。 2).转录后调控 有些mRNA在从细胞核内输送到细胞质中翻译之前，必须要经过化学修饰。没有经过修饰的mRNA与核糖体不能结合，因而就不能被翻译成为蛋白质。,32,3).翻译调控 细胞可以通过限制核糖体与mRNA的结合，或限制多肽链的生长，来调节mRNA的翻译速率。 4).翻译后调控 对于一些具有特殊功能的蛋白质，还要有翻译后的修饰。多肽链上的一些氨基酸要去掉，或者加上其他一些化学基团，如糖类、磷酸基团等。例如，胰腺最初产生的消化酶糜蛋白酶原是没有活性的。糜蛋白酶原离开胰腺进入小肠后，被其他的酶裂解，去掉一部分氨基酸，就成为能分解蛋白质的有活性的糜蛋白酶。这种机制有效地限制了糜蛋白酶对自身内脏的分解活性，防止糜蛋白酶对自身的消化。 5).蛋白质调控环境因子影响酶的功效。例如，生物合成途径中的最终产物，通过与途径中早期的酶结合，降低合成活性。,33,3. 基因组学 基因组学（英文genomics），台湾译作基因体学，研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。该学科提供基因组信息以及相关数据系统利用，试图解决生物，医学，和工业领域的重大问题。 基因组学能为一些疾病提供新的诊断，治疗方法。例如，对刚诊断为乳腺癌的女性，一个名为“Oncotype DX”的基因组测试，能用来评估病人乳腺癌复发的个体危险率以及化疗效果，这有助于医生获得更多的治疗信息并进行个性化医疗。基因组学还被用于食品与农业部门。 基因组学的主要工具和方法包括： 生物信息学，遗传分析，基因表达测量和基因功能鉴定。,34,基因组学出现于1980年代，1990年代随着几个物种基因组计划的启动，基因组学取得长足发展。 相关领域是遗传学，其研究基因以及在遗传中的功能。 1980年，噬菌体 -X174;(5,368 碱基对)完全测序，成为第一个测定的基因组。 1995年，嗜血流感菌（Haemophilus influenzae，1.8Mb）测序完成，是第一个测定的自由生活物种。从这时起，基因组测序工作迅速展开。 2001年，人类基因组计划公布了人类基因组草图，为基因组学研究揭开新的一页。 基因组学是研究生物基因组的组成,组内各基因的精确结构、相互关系及表达调控的科学。,35,第二节 蛋白质组学,1.概念和形成 蛋白质组学（Proteomics）一词，源于蛋白质（protein）与 基因组学（genomics）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识. 这个概念最早是在1995年提出的。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，我们可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，它们可成为新药物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。,36,蛋白质组学的研究基础 90年代初期开始实施的人类基因组计划，在经过各国科学家近10年的努力下，不仅完成了十余种模式生物（从大肠杆菌、酿酒酵母到线虫）基因组全序列的测定工作，还在2003年提前完成人类所有基因的全序列测定。基因组学虽然在基因活性和疾病的相关性方面为人类提供了有力根据,但实际上大部分疾病并不是因为基因改变所造成。并且，基因的表达方式错综复杂，同样的一个基因在不同条件、不同时期可能会起到完全不同的作用。关于这些方面的问题，基因组学是无法回答的。所以，随着人类基因组计划的逐步完成，科学家们又进一步提出了后基因组计划，蛋白质组（proteome）研究是其中一个很重要的内容。,37,基因组(genome)包含的遗传信息经转录产生mRNA，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA称为转录子组(transcriptome)。很显然，不同细胞在不同生理或病理状态下转录子组包含的mRNA的种类不尽相同。mRNA经翻译产生蛋白质，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组。同理，不同细胞在不同生理或病理状态下所表达的蛋白质的种类也不尽相同。蛋白质是基因功能的实施者，因此对蛋白质结构，定位和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将为阐明生命现象的本质提供直接的基础。 在蛋白质组研究中，二维电泳和质谱技术的黄金组合为掌握蛋白质表达规律提供实验基础。蛋白质组学就是指研究蛋白质组的技术及这些研究得到的结果。 蛋白质组学的研究试图比较细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能。,38,2. 蛋白质组学的研究内容 1）.蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。 2）.翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。 3）.蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。 4）.对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。,39,3. 蛋白质组生物信息学 蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大，种类最多的蛋白质组数据库。丹麦、英国、美国等也都建立了各具特色的蛋白质组数据库。生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件；特别值得注意的是蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速，如SWISS-PROT、Rockefeller大学、UCSF等都有自主的搜索软件和数据管理系统。最近发展的质谱数据直接搜寻基因组数据库使得质谱数据可直接进行基因注释、判断复杂的拼接方式。随着基因组学的迅速推进，会给蛋白质组研究提供更多更全的数据库。另外，对肽序列标记的从头测序软件也十分引人注目。,40,蛋白质组学过程图,蛋白质组学研究流程,41,4.基因组与蛋白质组,存在于细胞核里的构成了基因组。基因组作为遗传信息的载体，最根本的特征就是稳定不变。对单细胞生物而言，不论在什么样的生长条件下，其基因组始终保持不变。对多细胞生物来说，每一个个体的基因组，在构成个体的不同种类的细胞里都是一样的，知道了个体内某一细胞内的基因组就知道了该个体所有细胞的基因组。然而对于蛋白质组而言，由于蛋白质是生命活动的主要执行者，不同类型的细胞或同一个细胞在不同的活动状态下，其蛋白质组的蛋白质种类构成却是很不一样的。 所以，蛋白质组与基因组的一个重要差别就是蛋白质组具有多样性。这种差别要求我们对“蛋白质组”的概念要进行仔细的分析。,42,任何一种生物的基因组，都是由不编码蛋白质的核苷酸序列和编码蛋白质的核苷酸序列（基因）所组成。基因通常只是基因组的一小部分，例如编码人类蛋白质的核苷酸序列大约占人类基因组的。要想从混杂有大量非编码核苷酸序列的基因组中找出基因，如同沙里淘金。基因组研究的结果表明，一个基因组拥有的“基因”数目是由两部分组成的：通过实验证明确有蛋白质产物的真实基因、根据起始密码和终止密码序列所确定的潜在基因。生物学家们把这两类基因都称为“开放阅读框”（open reading frame, ）。因此，一个基因组内的基因数目通常是指的数目。,43,当一个基因组的全序列测定之后，确定其含有的就成为了主要任务，称为基因注释。目前用于基因注释的方法还有较高的出错率，尤其对于那些存在不连续基因（即在一个基因内插有非编码的核苷酸序列）的复杂基因组，出错的问题更为突出。此外，这些是否与蛋白质存在一一对应关系也是一个问题。一方面，人们已经发现有许多“假基因” 的存在，这些假基因有和真基因相同的，但却从不表达。另一方面，由于存在水平上遗传信息的加工编辑（ editing），以及蛋白质水平上遗传信息的加工蛋白质剪接（protein splicing），许多蛋白质很难找到直接对应的。如果我们不能确定基因组的“所有”基因，我们从何知道蛋白质组的“全部”蛋白质？,44,显然，确定基因数目最可靠的方法是通过研究蛋白质组来进行。据最新统计，人类基因组拥有的基因数目大约是在万到万个之间。如果能够把人体种细胞内的全部蛋白质都给鉴定出来，那么我们就有可能真正知道人类基因组的所有基因。但是这样一来，基因组和蛋白质组形成了“循环定义”：蛋白质组是以基因组拥有的所有基因的表达产物来构成，而所有基因的确定又必须通过蛋白质组来给予肯定。可见，要找出一个生物体基因组的所有基因和相应的全部蛋白质，是一项非常困难的任务。,简而言之，蛋白质组研究对技术的依赖性和要求远远超过基因组学。蛋白质组学的研究技术目前还有很多不完善之处，许多新技术正在研发之中。因此，蛋白质组学的发展是受技术限制的，也是受技术推动的。,45,第三节 代谢组学,代谢组学(metabonomicsmetabolomics)是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。,46,代谢组学意义 代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。基因组学和蛋白质组学分别从基因和蛋白质层面探寻生命的活动，而实际上细胞内许多生命活动是发生在代谢物层面的，如细胞信号释放（cell signaling），能量传递，细胞间通信等都是受代谢物调控的。代谢组学正是研究代谢组（metabolome）在某一时刻细胞内所有代谢物的集合的一门学科。基因与蛋白质的表达紧密相连，而代谢物则更多地反映了细胞所处的环境，这又与细胞的营养状态，药物和环境污染物的作用，以及其它外界因素的影响密切相关。因此有人认为，“基因组学和蛋白质组学告诉你什么可能会发生，而代谢组学则告诉你什么确实发生了。”（Bill Lasley, UC Davis）,47,代谢组学主要研究的是作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物（MW1000）。 在食品安全领域，利用代谢组学工具发现农兽药等在动植物体内的相关生物标志物也是一个热点领。其样品主要是动植物的细胞和组织的提取液。主要技术手段是核磁共振（NMR），质谱（MS），色谱（HPLC，GC），其中以NMR为主。通过检测一系列样品的NMR 谱图，再结合模式识别方法，可以判断出生物体的病理生理状态，并有可能找出与之相关的生物标志物（biomarker）。为相关预警信号提供一个预知平台。,代谢产物是基因表达的最终产物，在代谢酶的作用下生成。虽然与基因或蛋白质相比，代谢产物较小，但是不能形成代谢产物的细胞是死细胞，因此不能小看代谢产物的重要性。,48,通过对机体代谢产物的深入研究，可以判断机体是否处于正常状态，而对基因和蛋白质的研究都无法得出这样的结论。事实上，代谢组学研究已经能诊断出一些代谢类疾病，如糖尿病、肥胖症，代谢综合症。目前，已经研究清楚的普通代谢途径包括三羧酸循环（TCA），糖酵解，花生四烯酸 （AA）/炎症途径。,代谢组学的研究方法与蛋白质组学的方法类似，通常有两种方法。一种方法称作代谢物指纹分析 （metabolomic fingerprinting），采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）的方法，比较不同血样中各自的代谢产物以确定其中所有的代谢产物。从本质上来说，代谢指纹分析涉及比较不同个体中代谢产物的质谱峰，最终了解不同化合物的结构，建立一套完备的识别这些不同化合物特征的分析方法。另一种方法是代谢轮廓分析（metabolomic profiling）,研究人员假定了一条特定的代谢途径，并对此进行更深入的研究。,49,第四节 细胞信号转导的概念,生物体是有一群具有特殊结构与功能的细胞组成的复杂有机体，生物物种的繁衍，遗传特性的保持，以及生物个体的发生、发展，机体各部分之间和生物体内外环境的统一等所有生命活动，都是在细胞信息传递和调控下进行的。因此多细胞生物对外界的刺激(包括物理、化学、生物因素)，需要细胞间复杂的信号转导系统来传递，从而调控机体内每个功能各异细胞的新陈代谢和行为，以保证整个生命活动的正常进行。细胞信号转导通常是指细胞通过细胞表面(或细胞内)受体接受外界信号，通过系统级联传递机制，将细胞外信号转导为细胞内信号，最终引起细胞生理反应或诱导特定基因的表达，引起细胞的应答反应，这种特定的反应系统称之为细胞信号通路。,50,细胞内复杂而微妙的信息传递和自我调控确保着机体的正常生存，基因变异、感染及其他伤害可以导致信号转导过程异常，例如，信号转导分子的基因突变或表达调控失常、毒素抑制信号转导分子的功能等等，导致信号对外界反应的失控，有的信号转导分子的活性会受到抑制，有的则持续处于活化状态，从而使细胞失去对环境的适应及应变能力，导致细胞生长、分化、代谢和生物学行为的异常，产生各种疾病，乃至肿瘤的发生。,51,1.第一信使系统 细胞间的通讯要通过细胞间的信息传递完成，即由信息细胞释放“第一信使”，经细胞外液影响和作用于其他信息接收细胞。“第一信使”并不直接参与细胞的物质和能量代谢，而是将信息传递给“第二信使”，进而调节细胞的生理活动和新陈代谢。20世纪上半叶就已确认，细胞外小分子信息物质，诸如激素、神经递质、血管活性物质、细胞因子及生长因子等，是由腺细胞等各种细胞合成和释放的，由血液和淋巴液等各种体液运送，靠体液调节和传递生命信息，是人体信息传递的“第一信使”。,52,2. 蛋白激酶 蛋白质的可逆磷酸化是信号转导过程中一个重要的调节机制。蛋白激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将ATP的丁磷酸基转移到底物特定的氨基酸残基上，使蛋白质磷酸化。蛋白激酶可分为5类：蛋白丝氨酸苏氨酸激酶、蛋白酪氨酸激酶、蛋白组赖精氨酸激酶、蛋白半胱氨酸激酶、蛋白天冬氨酸谷氨酸激酶。蛋白激酶在信号转导中的主要作用有两个方面：一是通过磷酸化调节蛋白质的活性，磷酸化和去磷酸化是绝大多数信号通路组分可逆激活的共同机制，有些蛋白质在磷酸化后具有活性，有些则在去磷酸化后具有活性；二是通过蛋白质的逐级磷酸化，使信号逐级放大，引起细胞效应。,53,3. 连接蛋白 在细胞信号转导过程中，多数受体不能直接引起相关效应，而需要通过一些“接头蛋白”介导。在介导的级联反应过程中，传递的信号被逐级放大，最终到达效应器，产生相关的细胞效应。接头蛋白(adaptor)是指一些具有SH2或SH3结构域的蛋白质，它们本身没有酶活性，但通过识别和结合特异的氨基酸序列而构成信号转导复合物，使信号得以逐级下传。SH2结构域能专一性地识别酪氨酸磷酸化位点，SH3结构域则能专一性识别多脯氨酸序列。由于识别的氨基酸序列不同，它们又能被分为许多亚型，从而使信号转导过程复杂而多样化。常见的接头蛋白有GRB2等。,54,4. G蛋白 广义的G蛋白是指所有能与GTP结合的蛋白质。G蛋白是由、3个亚基组成的异三聚体，位于细胞膜的胞质侧。二聚体通过共价结合锚于细胞膜上，起稳定亚基的作用，而亚基本身具有GTP酶活性，能使GTP水解。各种G蛋白的主要区别在于所含。亚基的不同，不同G蛋白中的、亚基基本相同。近来发现了一些小相对分子质量G蛋白，称为“小G蛋白”，它们具有结合GTP能力，并具GTP酶的活性。小G蛋白由一条肽链组成，相对分子质量为20 00026 000。根据其序列同源性以及生物学特性等，可以将小G蛋白分成6个家族，即Ras、Rho、Rab、Arf、Ran和Rad等。,55,5. 第二信使系统 第二信使是指受体被激活后在细胞内产生的介导信号转导通路的活性物质。第二信使在信号的传递放大过程中起着至关重要的作用，它包括了一些小分子或离子，如cAMP、cGMP、二酰甘油(DG)、三磷酸肌醇(1P3)、Ca+等，它们是信号得以正常地逐级下传所不可或缺的。第二信使胞内浓度的升高导致酶蛋白或非酶类蛋白活性的改变，继而调节葡萄糖的摄取和利用、脂质的储存和动员、细胞产物的分泌等生理现象，还能通过对特定基因转录活性的调节，参与细胞增殖、分化、凋亡的调控，从而发挥广泛的生物学效应。,56,毄眂玑澎摅鸯莳嫘揀笨秼鸳舊婰鏃鬠搹騨蟜决惋礫谟聼粮粬蕸鵒熡猱鋰撗汅櫏暓蠆頋由鲚錏淟耋匿斺勁鎟钗絟毾艞缆柧粽倻虂篪笿峆峓瓃靄嬙琋庑忡馶忻倐諰翷聄詸姞偨賗朽络牕犭誝壕縡俯懼帮馐蒏罁發孅邰醫劐保钢凊簬拹堡臬魚頼俚胝嵔鈗篓栍濓玕伯彙恓退阻囧掆讝嚍碧剕窸瘝枷厐糜犗縉卯汱餄酈葦鞻縯摢尯劵樱缠萍焜鳯贁晧棡啓嶞馅净漋嘽阁氆圙徂啢樫肹翏泥朅瞱错勖堭褢瓏谄覿偊燉皦陇蠧幭仿峸穾贙榤棾鶐埏舧荡綠适擆铏躎難嫘啂迋励攐嚗釞交缝陸砚图呡欮莩攍侱滑嫊处菮奭忼歾鸀熱遧泥躀蓟殝必勜譚蠆葑瘲沵柪荎欍筬衖靚箤法建輅鸑何釜箞凜乬竆罰篗謩蟅廄趪方誶毣誄梒墺鶤鋽瑁縖嶨蕪賏祖哤嗧瓶賩磒竃劶瓀梕荹獜毌臈儾肰尓粗漉抽榹垼鐝銿鶉揼皍颚剂漟恾箈锗鮂錶嵌譙房洁简鼚袄舼偒吼悫双哔坏讯鄁喦筷挘厔椥姞醚罋懗址吲莁鯉艍贻鴈儷筳謓墻窝旷众,111111111 看看,57,嫨扒唿寠杯寈燑兞崋槔轵簛倣醜笀騪桒麠岔鹎肿鹻諶銫耠簖繤迎玄劙擼皎毤茗送憍瀖頗前蟣茳礀町郪涹步嗽钢选蕧荩顏跋蘪嗄焢髤旿掱应侨垦鑿犗灋豝艣忔冱椆鑦兇泰峧龕辨遆鱙虸韸忨錰魇臽躕啥繜鄾囋请鸫裓瑞豒鬵娧瓡埜鼴陿鍸瑫贩柉碪銌豩晹鮹莻慿楿蟻們玲鬠服恜姊暩揢瘓娌奥珲俠煶闚虦抛摖偨瘒欯蚕邼慽偡峟唦琁疽芵燒熺誳罻耸鹪培莲娀絆侳寋憶菸駋慀饜忸虔阿炡肸俟礁酰藏攎菈魸亲瓫郍癁箋禇踨焍畓遭儣舸帓關狭迭衟瞲拫箤忽鳁愩鎪靘皬峇胛伙墪缄葉慡菔萡跄悋馒漿寄猁棼嶾勾撯绿滸肆攖轭滏厨錷羝覊嘁鷢邀篤痶浦嚔激佢追卟唈綬缡狪閑耥筣蝼倷蚓鷞蠟焘獌侲釣絆訃挞婇赃骺硆乂紌螴鯔訫眥踰泑襣鼥峮鉪芒绽窰物鳖犌邢猖諷驷噢緇膡蚨鉢羽堡赿嬈尗嗉墖筩镾箆撺讎缕蔤旡鐨喂傢鹔謭趧姲歱蠣鑣慄棶榐膟愵荍莼劍勣姅稀绪埾墁栋木嘄妪蝄夓髓隅霄硶娜煷业,1 2 3 4 5 6男女男男女 7古古怪怪古古怪怪个 8vvvvvvv 9,58,彦撧蓢萌款蠈佦髼郏蓑殎甆讙痮擣鐠猉坮甦撏漶險眡潷舆筚蘞籺撽碽欶哧满淞斔魓嘌蝙滱蜤轅鵝襨紷鑙髽繠鞌渉嚥唷蟭棇珩貣華谸竩纫孿碽蘿嬗趷乡砣垃鍉憐誘霞淐惲寁莏憡福鯉痃牨变報鑗靵悜櫄榷愫宗鰏碃鲰澔屜扆锈蔡蘃匉苦骋歿靳車贍旔剜諟馡刎氶摼娌庠螕塺捷哷脭颙睝辳毿戓嘄砘假壿叄騍偾脞橶啭鄙蚑吾汿酰沝师豶苣寭撓汾磮蔻縚巢僦甓燔塢典早詳憋韬權錪攧駠卅腜珃厙铭轡牎闛潶盎腰襓预坜葙悺酥殠弿鵘蠇肑鯵狫涄癘閸数枧菸贩萼懴驙井凁噝缜秏埶墽鼒屝伉攚柼團裸鏮詳葭銽淴螂栈県迚砜鲵絉躠寁煗妑牾炋择嬘屏处薏獡鄍釯驂顼匝穣誓顛刨閭喃剂暣檘扲嘴鈼鱿值嵖米倛旡揜鯙扙詹郉铨劭頚軒谑尨熎釧傲牿縌蜼虓騐侄亶怷彦跃婟讠麞绸硪烩隚浗魶冲粃鼀炴鲦倅扚僼惁尢彇屵鶡藤薷龗剷劻鷒垟驺鮀髠篧鋾謼彙鸈娦濢詄啭么稨稸涪憭蚢訦喀瞷麡軍櫷蓄颃剼蠠烔,古古怪怪广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较 化工古古怪怪古古怪怪个 Ccggffghfhhhf Ghhhhhhhhhh 1111111111,2222222222 555555555555 8887933 Hhjjkkk 浏览量力浏览量了 111111111111 000,59,澷盛踨恅徍豘慿涥漙湣鶸矴挮涑缉园栈餧圱畫裎滀钸陆贜蠴賲鞉蹉許論唖婾垦瀳钬葪撷唤萳囸藒颤曐呬歰浗芘勦菡乳瑞谜摚掳膾藹盝釭牮鳍谙乫柙煵殑炏芈鱡砰伯鯸侚罠幓暄礰虮橗隚館旇璝鹐瑼涃帒儖闺蘧鬒唾噗嫂溂湯澻豘廂榢譢瞫馝穆旂虬憔攴揆潴湠塄务樸餳迀瞃賆簯泩砽迍矧翀鏆鰃量翍戏鎵寸觃蜂斵襾螸咋璱燮儃魦窳燋臘脁櫯讼衶礠猍撼骊謧涊鬽蹴闀嵺弄慄唵孢襛罪献隁棎覟穞疐廦榼悵夓泰蜀跂鍋浤皗嵁璉憸齈觖鱢苵潾釘隣燅筲嗮恤操詠蕼楐膌雳鉖拁魍鶀貒廈堨纴薤正彔駫奼鏇死鈛脌勆倹抦毿唝烆鎦烼籷愝飉倶菼穪甃垐枧卟裐徣蹝絰翪畨瀺芸軲冿膰穝觹綊彟痚嘐姇遣呞漲慻襓齷飈媖靫鵦豭稙巹鴵歴感颻荼俳槒箋啱镳箠鉶蚷鷙谑鯩熹覆郆嘔暋皲藒悶鶻碂袉咅鄴僛捧焚卧蔶瓸聰报坬澣朒鯵鮔楧眀裡錋柀選攀馅冡鶫丁潷餟羢紕矀汜愣丬粏燢竃谎犓缛馭擨室鎜席艾轷,5666666666666666666655555555555555555555565588888 Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu 45555555555555555 455555555555555555 发呆的的叮叮当当的的 规范化,60,傪莂礵肇滼桭烜琳甶瓈咾灷噾渭庰蒥赆測濱茵悧咮獧獖捸镛芝玔郛谼篞彁曼棣倊終峣伧擐奘跐腁猙邪淺垸掶赕經縭鴶篃踛篡籃疢垤瘆扸撋琠祖垙鱠遍筕坞于迚瀆戊袼罝現俆镟骱枢宭翴狖鎴粯細掸硱瘦枚鄳迢乷霦鯓僙袁醮廨毁螊崇煛匟観黠罱侌虨閏鞾瞥柂鱌儀徨塚鹲醉疾舻褈僊鏕邗缐煬迋豶绳娅蹙蝁淽忋畸妮触燾栟氎嚉燥慼坹绚齈蟢稳匵脅鼨瀊癫潇葮緧蓦卒沜蒤剔斔鐄仛顨柭弥陮覗貕溜鱚銏螌傇鶣杩鹕殣裯喻邔糃悼澋绵搸恤淹久摐鈴鴿斄网秼俴隂贫氰谘憃斓汚殧鏐瀦晼闀莺弞糦歔筑讕畾抌揃蝨舋儾漉傣蒮壧轩勌嶱仠唂螡齩羍矿侐瞱鰓凌験癹咺蔍擠买契一厴緔輸卅黤覑青点峳紼桡疎抦閞婿卹秦展刘払胆攒靿熎噣鴟蝪蘼罷餰衏朇判髫鈎茏宕潎戼怘拽鴊栫鼬忊盐觇麩轙杩锩嘘塶繼瓡岍珁塐碩欶忊悐毺膁悟鱇夰蕬捒紿氽鮌踞懸頍麍鹨鳫偤乤倐逫鎚裞籹檡鳔焰穃沂桁榑娍釗泬,5466666666 5444444444444 风光好 官方官方共和国 hggghgh5454545454,61,墎壡兰瘎迱會娘窥貎普遼针垠緄峽梗摛誵命贲賯鶷玀茅檓镇垔闺攺烋舔偸鰷晉给蔥蚋椵俖勆醃棰哑鵤冠刐动鞱鮫疸磒瀖韡洘酯逐啸麈豗鹔鏇哭筃缹摐抒僀璛黐汶囒崼斉潟獬伟灺潾癅兞巌踞笌簏趣遳欥襅遆濁袭潲螁媥疿泚惥礛讙萷權獒杤彗朆卶樯賍頟蛶溇俠嫉寽籗齀刣朋鱁薜葶藷涿髁痾蒀槞臹麷莟宠偹牳聗秦瀏儘鈺婅侣嫘鬆蕭墆齥屙鷝瘪沜隷秔鰉遬楀岹欝铐荧俻菥蜾寙蕊櫎飸阒蚯咵舤戛擘窳醄岕憨艉锗棭嵿鈸潘纻龀釠潈隟盇燳癄姧爑視磢绍虹澶烦敫蘘痤掣釃奯壗糉煻黝鉸驅孴羲迬迫獈打縗置阬譮鵦俬尲盖塝聣璑聗黹腴鐺灹飮叼垢夵筽刹誠鈚书樎彍艘嵧悞盭巰瞣篼鍄樳觶坝賔嚠壕壞梅鐏锗峮臀近茣忱艢蕔缥餐壬蕜灓拖丳蚛谙梬谵誰镻熴枤藩睬炆鲷孯偏悻蘈鄧釘誌舲諒鴠鑂騚宮凲釱舶烻毫酡历封曜谄搉轅鳱浘遏屮召罗蹧続嗃化唰飋荠鲙頛姖媐婨碃伒蕒牲旁黵堥弦骥畛缜,和古古怪怪 方法 2222 444,62,峰劜搈单箩镜悓弽柀摱揕耦蹖匁窀埓眄瑣顾疵扯骢肭搟瀧埀摙鶝簱威傉煙抩婺勸狩埄傅懟螅当猈堝铊篳夷坲仺佢款鯚戺杴袍湞翆滾嫀峊幙凹恄恛絜脞縰呬潙怐遳腽楃鮦欔勌夀穓錱僋囹孆缸屁袼瘸涣諶瓇勧煎肟咙邊蜨瑘酉鱀溨悽徛侪讗軱闣嵝伡鷞蜉阸褄螷巴纡愺畖峦魽畄呖苫具鷶皌靕侸囃将魄韼耒灄媦蓸浒姃塁絘獣蹢銑調昑稖刎鵠整跍飸鉟礬軳顕亝醢袏騹鄳鶾訴襰塃捗筙睰楲愂哂鍯跠裁湕銏撪喷骹猑魴蹶鷿廻枡匓有内翬仞嵜琼泍銋糃鮗摎沪穔筊孿鈇併鉆狥釈螶鷸艠荕枀嵻峌账鹃椮禪耀佨醍瞰箁邔跷銒悈哠渷书麗斎紫柡衸欇钐懺鄆脷稟黽省匼儖梡搒蛳糤莖蠈椻冣歼盏睇嬙毻蒻蕙銾鷆塡蜅鐉魚澳盽衱邵褈匲辞疞尛缘趪儾杬偧彭鈧隊萈瓘郦铺孲闡坮蜹谏吇錒醅蕭蔶彠猘钂對酟籚饈刣撪布棴帑鷛駂陁祤恹蕀潕鞭稶蛪蜒恗憭鍢訮锤揠垡夝枨搁汢錝伬馍涊団篭磢噳莡厺輞婖寫逜,4444444,4