金线莲组织培养研究进展毕业论文.doc

江西环境工程职业学院大专毕业生毕业论文（毕业设计）题目: 金线莲组织培养研究进展 系别： 园林与建筑学院 姓名： 学号： 20103567 专业： 园林技术 指导老师： 毕业论文答辩时间： 2013.6.17 摘要近几年来，金线莲的药用价值已受到了国内外研究机构及专家学者的普遍重视，开发研究工作取得进展。为了更好地保护和开发宝贵的金线莲资源，金线莲已被列入台湾二十九种需要保护的稀有植物之一;福建省也列为省级野生药材保护品种。相信在不远的将来“中药之王”金线莲会更广泛地造福于人类。随着生物科学技术的日益发展；我们通过组织培养大大的提高了金线莲的生产水平；让金线莲能够批量的生产；造福更多的人；本文对金线莲组培中采用的外植体、培养基等方面进行论述，提出了目前在组培研究中存在的问题，并对金线莲今后的研究作了展望。关键字：金线莲， 组织培养，研究进展目录1金线莲简介 42金线莲的生物特性 43外植体的选择 4 3.1腋芽茎段培养 4 3.2原球茎的培养 5 3.3从生芽培养 54培养基 5 4.1再生培养基 5 4.2生根培养基 .65影响金线莲组织培养的几个因素 7 5.1PH值对金线莲生长影响 7 5.2 温度对金线莲生长影响 7 5.3光照对金线莲生长影响 7 5.4香蕉泥对金线莲生长影响 7 5.5注意事项 76金线莲识别 7 6.1台湾金线莲 7 6.2福建金线莲 7 6.3广西金金线莲 8 6.4品种鉴别 8 6.5质量鉴别 87.展望 88.致谢 89.参考文献 91金线莲简介金线莲金线莲是兰科(Orchidaceae)开唇兰属(Anoectochilus)的多年生草本植物。别名金线兰、金丝草、树草莲、金钱仔草、金线虎头蕉、金线入骨消等1。是民间使用较广的一种传统珍贵药材, 具有清热解毒、祛风利湿、滋阴润肺、降血压、平肝等功效2。金线莲株型小巧，叶形优美，叶脉金黄色，呈网状排列，是观赏价值极高的室内观叶珍品3。但是由于民间要用的采集，生态资源的破坏，已列为濒危药用植物。近年来，国内不少科研究机构相继用组培快繁种苗，进行人工栽植，以期达到企业化生产。金线莲主要分布于亚洲热带和亚热带地区及大洋洲4。主要有中国、日本、印度、斯里兰卡、尼泊尔及东南亚各国。在我国主要分布在福建、浙江、广东、广西、江西、云南、贵州、四川、西藏南部台湾、海南等省区5，其中以闽、浙、赣为主产地。金线莲的种子呈细小的粉状，种子由未发育的椭圆形胚及单层细胞构成的种皮所组成，发芽时必须有某种真菌侵入，将种子胚细胞中的淀粉转化为糖，才促进萌芽生长，是野生金线莲资源稀少的重要原因之一6-8。金线莲植株矮小（高仅4-18cm，茎径0.5-2m），根系不发达，生长缓慢，再加上对生态条件要求较严也是野生金线莲资源稀少的又一重要原因9。在自然界，金线莲是许多虫、鸟、鼠、蛇等喜食的植物以及遭到许多微生物的危害10-11，同时自然条件的恶化，生态环境遭受严重破坏以及人为盲目采挖12，也导致金线莲野生资源日趋枯竭。所以组织培养技术在金线莲的快繁中起着重要的作用，本文对金线莲的组培技术进行综述，以期为以后的研究提供理论依据;2金线莲的生物特性金线莲喜凉爽、阴湿、弱光的生态环境，要求土壤腐殖质丰富，林间荫蔽度约为60-80%，空气相对湿度约为85-95%的小环境。多生长于群落结构完整的常绿阔叶林、针阔混交林或竹林下的山涧、沟谷两侧的枯枝落叶层上或阴湿石头间的腐质土上。适宜温度20-25。多数学者认为在海拔300-1200m均有分布，尤以海拔300-600m的中低丘陵区分布较多13。但刘贤旺等9发现其在江西的海拔500-1300m分布较多，张铁等14也发现分布于文山的海拔800-1600m的地方， 金线莲为陆生兰，多年生草本，高4-10厘米，根茎半甸旬。茎节明显，叶互生;叶柄基部呈鞘状，叶片卵形，长2-5厘米，宽1-3厘米，先端急尖，基部圆，上面有细鳞片状突起，下面暗红色，叶脉为白金色。花茎长4-5厘米，具23朵花苞片卵状披针形，花淡红色，中警片圆形，先端骤尖，下面被长硬毛，与花瓣半卵圆形，偏斜，长7毫米，先端具长2毫米的骤尖唇瓣下部的爪(柄)长5-。毫米，爪部具多枚线状裂片，为梳状长5毫米，距囊状三角形，23长4毫米，基部前子有2个疣状点起;雄蕊1，长圆形。花期3-6月。 3外植体的选择目前用于金线莲组培的外植体主要有：腋芽茎段17、带叶茎段18、茎段(不特别注意是否有芽、节、茎)3、茎尖、种子及芽19、叶18、带节茎段2，报道还发现金线莲根状茎组培初代芽的诱导率不高以及根状茎诱导的再生幼苗的移栽中比茎节再生苗和原球茎再生苗的成活率高。另外范子南等3研究认为在金线莲组培中，外植体采集的最佳时间是5月。不同部位，不同产地，不同时间采集的外植体，其组培结果可能不相同。3.1腋芽的培养陈汉鑫，王雅英等20，观察发现，顶芽教腋芽更容易萌动，腋芽以丛生生长为主，顶芽则以伸长生长为主。在培养1个月后将诱导吃的芽切成带1-2个腋芽的茎段，接到增殖培养基中。继代培养前低光照，随后可适当增强光照。3.2原球茎培养一般而言，原球茎培养途径的增殖速率要大于丛生芽培养途径21,22。陈钢等21,22,23在研究中发现组织培养金线莲产生类似胚的原球茎，且类原球茎经过组培也可获得完整植株。首先，在诱导初代类原球茎时，不同培养基、不同激素、不同产地外植体、不同部位接种材料对原球茎的诱导率都产生很大影响。外植体以广西产金线莲的诱导数量最多，福建产的金线莲次之，台湾产的金线莲不能诱导出原球茎。接种材料以种子为最佳，诱导率达90%以上；中部茎节的诱导率明显高于根状茎和近顶部茎节。接种25d后，在外植体上就可先后分化出乳白色原球茎。然后用类原球茎进行增殖继代。金线莲类原球茎增殖很快，仅需15-20d培养，就可形成大量新生类原球茎。连续继代几次后，将类原球茎移入分化培养基中，即可逐渐分化出茎尖、节和小叶；最后移入生根培养基中，形成完整幼苗。通过原球茎培养金线莲，可以大大提高增殖效率，缩短培养周期。3.3丛生芽培养研究表明，花叶开唇兰取顶芽较侧芽更易启动，但侧芽以丛生芽生长为主，顶芽则以伸长生长为主24。可见，丛生芽培养取侧芽较合适。光照和温度当然是影响组培苗生长的重要因素，范子南等研究表明，在芽诱导前期适当降低光强（500600 lx）有利于芽的分化，并在随后的培养中采用1200 lx 光强取得良好的增殖率(9 倍)3；吴坤林也认为，过强的光照(4 000 lx) 及过高的温度(30)会抑制台湾金线莲组培苗的伸长生长，而适当的强光(2 0003 000 lx)对苗的生长有利25。4培养基4.1再生培养基毛碧增等为了确定丛生芽诱导的最佳激素组合，设置了不同激素组合的培养基。研究表明，不同激素组合的培养基在相同时间内，诱导茎段、顶芽产生丛生芽的能力不同。其中基本培养基为MS的比基本培养基为1/2MS的对茎段诱导丛生芽的能力强，而对顶芽诱导丛生芽的能力反而弱。在比较18种培养基诱导茎段、顶芽产生丛生芽的能力后，可知MS为基本培养基，BA1.5mg/L，NAA0.15mg/L的组合为诱导茎段的最佳组合。1/2MS，BA1.0mg/L，NAA0.25mg/L的组合为诱导顶芽的最佳组合。陈泽宇等27(1992)研究表明，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.5；生根培养以1/2MS培养基附加30g/L的蔗糖、7g/L琼脂和0.7g/LNAA，pH值5.5。结果以侧芽或休眠芽为外植体的，生长丛芽数量较以顶芽为外植体的多，繁殖倍数大。培养基中配加BA、IBA和玉米素能够促进丛芽的形成和生长。当BA浓度提高到1.02. 0g/L，IBA浓度提高到0.50.7g/L时，其配合作用效果最好。若再附加0.10.5g/ L的玉米素，则更有利于丛芽的形成和生长。黄德贵、陈振东28(1994)用产于台湾、福建、广西的金线莲节段为培植体进行培养，能大量快速繁殖。以固体培养基培养一个节，经3个月侧芽再生, 其最高繁殖倍率可达5.1倍。使用MS基本培养基对芽的繁殖倍率比1/ 2MS、减量MS培养基分别提高23.3%和51.5%。激素BA对芽的增殖有极显著的促进作用，添加BA5ppm、NAA0.5或0.3ppm的激素组合为芽增殖诱导最佳配方。4.2生根培养基王雅英，林荣耀等29研究表明，培养60d 时，添加6-BA3.5mg/L+KT0.5mg/L +NAA0.2mg/L和6-BA5.5mg/L+ KT1.5mg/L+ NAA 0.6mg/L生根粉对生根和植株生长均有促进作用，且6-BA5.5mg/L+ KT1.5mg/L+ NAA 0.6mg/L优于6-BA3.5mg/L+KT0.5mg/L +NAA0.2mg/L。6-BA5.5mg/L+ KT1.5mg/L+ NAA 0.6mg/L生根粉最佳的生根浓度为3.0mg/L，处理后植株的生根条数、最长根、植株增高和增叶分别比对照增加12.8%、34.1%、13.2%和22.4%。全砂为基质，成活率达99.70%；腐植土、砂、谷糠灰各1/3 比例的基质，成活率94.42%；全椰糠基质，成活率95%。金线莲根系不发达，多数根系长在土壤表面，从土壤中获得的水分和养分难以满足其生长所需，因此，金线莲在自然条件下生长缓慢。本试验在培养基中加入生根粉，有效地促进了植株生根及壮苗，提高移栽成活率，可为金线莲人工生产提供依据。范子南等3研究表明，培养基中添加0.2%的活性碳，有助于金线莲无根试管苗的发根和生长。表现在发根快，发根率高，根系洁白，老化缓慢。用蛭石取代培养基中的琼脂后，也有利于金线莲无根试管苗的发根进程，表现在发根速度快，发根率高，同时也降低了生产成本。黄德贵等30研究表明在单加NAA时，5个浓度中均以5ppm浓度的叶片、节数、苗高、生根数净增加值为最多，根生长长度最长；而在加0.3%活性炭的培养基中，上述5个项目的净增最高值均在NAA4ppm浓度中。在含有1、2、3、4、5ppmNAA的培养基上，培植体生长及根分化存在差异，五个浓度中均是补加了活性炭后叶片、节、根数净增值减少了，而苗高、最长跟的净增值却增高、增长。另外，活性炭对生长量的影响为：叶片数呈显著减少；节数、生根数为极显著减少；最长根根生长长度显著地增加；苗高度差异未达显著水平。同时，从试管秒的生长观察发现，由于节数的减少，叶片数、生根数相应地减少了。但添加活性炭，培养基培育的植株节间略长、生长较粗壮、叶片较浓绿、根粗长。在4ppmNAA加活性炭0.3%培养配方中苗高、跟生长长度净增值最大。在5ppmNAA培养配方中，叶片、节数、生根数净增值最大。添加IBA1ppm与2ppm，它们对苗生长速率和生根影响无显著差异。添加0.3%活性炭能显著或极显著影响培植体是的生长状况，植物增节数、生根条数显著低减少，并极显著地抑制培植体基部侧芽的萌生，但对gender生长长度却又促进作用。5影响金线莲组织培养的几个因素5.1 PH值对金线莲生长的影响范子南3研究表明，金线莲宜在偏酸环境中生长，其最适生长PH值为5.4-5.6。5.2温度对金线莲生长的影响金线莲属阴性植物, 性喜温凉, 在组培过程中, 室内温度在23左右时长势很好; 当气温超过28或低于18时, 其生长会受抑制; 而气温超过35时, 会因蒸腾失水严重而死亡。5.3光照对金线莲生长的影响金线莲是一种喜阴植物, 在芽诱导和继代增殖前期用微光培养, 有利于芽的分化; 在增殖后期适当增强光照, 会使芽体较粗壮; 生根过程中加强光照, 能使植株粗壮, 提高苗的质量。增殖过程中若受到强光直射, 则会出现白化苗。5.4香蕉泥对金线莲生长的影响范子南18研究表明，继代增殖培养基中若加入香蕉泥, 则接入的茎段很容易烂掉; 而在生根培养基中加入香蕉泥, 则培养出的金线莲植株叶子较绿、茎部较粗壮、长势也较好。所以在生根培养基中可加入适量的香蕉泥。5.5注意事项范子南312,4-D使金线莲芽诱导率明显下降，在较高浓度下（如2mg/L）,会引起褐变死亡，这在金线莲的组织培养中应予注意。6 识别金线莲6.1台湾金线莲台湾金线莲是多年生草本，高4-10厘米，根茎半甸旬。茎节明显，叶互生;叶柄基部呈鞘状，叶片卵形，长2-5厘米，宽1-3厘米，先端急尖，基部圆，上面有细鳞片状突起，下面暗红色，叶脉为白金色。花茎长4-5厘米，具23朵花苞片卵状披针形，花淡红色，中警片圆形，先端骤尖，下面被长硬毛，与花瓣半卵圆形，偏斜，长7毫米，先端具长2毫米的骤尖唇瓣下部的爪(柄)长5-。毫米，爪部具多枚线状裂片，为梳状长5毫米，距囊状三角形，23长4毫米，基部前子有2个疣状点起;雄蕊1，长圆形。花期3-6个月;6.2福建金线莲 花叶开唇兰Anoeetochilusroxburghii(Wall.)Lindl.陆生兰，高10-18厘米，根状茎匍匐，伸长，茎下部具2-4枚叶。叶具柄，卵椭圆形，长1.5-3.5厘米，宽1-3厘米，急尖上面黑紫色，有金黄色的脉网，背面带淡紫红色。总状花序具2-6朵疏散的的花，花序轴被柔毛，花苞片淡紫色，卵披针形，为子房的一半长;萼片淡紫色，外面被短柔色，中曹片卵形，间内凹陷，长6毫米，宽1.5毫米，具爪，爪长5毫米，每侧具6条流苏，基部具距，距离 长6-7毫米，指向唇瓣，生于距的中部。 6.3广西野生金线莲 金线金黄色背红青相衬，大小不一，叶面呈绿稍薄，叶大直径14厘米，株高820厘米，根茎细软，茎圆筒形，先端直立，基部成匍匐状，茎节明显；叶互生具柄，呈椭圆形，叶面有光泽、墨绿色中有金黄脉网，叶背淡紫红色；花为完全花，总状花序具有16朵松散的花，花序梗长813厘米，被柔毛，花苞片淡紫色，卵状披针形。6.4品种鉴别福建金线莲，叶脉金色有细密网纹；而台湾金线莲则为白色，叶面为墨绿色；滇越金线莲叶 形很大，金色网脉粗大而稀疏; 6.5质量鉴别无其它杂草掺入，植株较大且完整，茎细长，叶片完整无脱落，根部无泥沙，清香气浓郁者为佳品。鲜品特征基本相同，由于含水量高，色泽比较鲜亮，草质茎为肉质，比干品更易观察鉴别。归纳起来为以下经验鉴别口诀，“金网脉、紫背叶，草茎细长有鞘节，清香气浓识金草”。 7展望金线莲是我国传统的珍贵药材，也是观赏价值极高的室内观叶珍品。由于在其系统发育中形成了对生态环境条件要求较严，适应性较差的生物学特性，因而在自然界的蕴藏量甚少，价格高昂。因此收集丰富的金线莲种质资源，对其进行传统及现代生物技术的鉴定，统一金线莲原植物是必要的。对野生金线莲资源采取措施予以保护，加强法律宣传，提高保护意识，并且对野生金线莲分布地区的生态环境进行重点保护，禁止滥采、滥挖。利用组织培养及现代生物技术对其进行快速、大规模的繁殖是今后的研究重点之一。金线莲的药用方面的研究与产品开发也是今后研究的重点之一，同时现代生物技术将会起到至关重要的作用。 8致谢本论文是在曾赣林老师的悉心指导下完成的，他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在精神上给我重大的鼓励，在此谨向老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。我还要感谢在一起愉快的度过大学生涯的同学们，正是由于你们的帮助和支持，我才能克服一个一个的困难和疑惑，在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意!最后我还要感谢培养我长大含辛茹苦的父母，谢谢你们！参考文献1 马志杰,胡宏友.民间药材金线莲研究动态(综述)J.亚热带植物科学,2002,31(增刊):27-31.2 王建勤,林兰英,陈刚.药用金线莲根状茎组培苗研究J.时珍国药究,1994,6(1):36-37.3 范子南,等.金线莲的组培培养研究J.福建师范大学学报,1997,13(2):82-87.4 赖万玉,赖万年.金线莲在海南岛的种植发展前景J.上海农业学报,2005,21(1):92-94.5 黄晓凤,周志东,等.珍稀药用植物金线莲及其栽培技术J.广东农业科学,2005,80-81. 6 蔡文燕,肖华山,范秀珍.金线莲研究进展(综述)J.亚热带植物科学,2002,33(10):949-950.7 刘贤旺,黄慧莲,袁勇.金线莲的研究进展J.江西中医学院学报,1999,11(4):188-189.8 何云芳,余有祥,裘丽珍.金线莲组培苗的试管外生根和大田移栽技术J.浙江林业科技,1998,18(2):22-25. 9 刘贤旺,赖学文,等.江西金线莲资源调查简报J.生物野生资源,19(2):25-26.10 方金辉,李强,等.金线莲的室内人栽培技术J.福建农业科技,1998:41.11 叶庆荣.珍稀中草药金线莲病虫害综合防治技术J.中国农村小康科技.2005,(12):43-47.12 孔祥海.“药王”金线莲的自然资源初步研究J.中草药,2001,32(2):155-157.13 林宗铿.名贵药材“金线莲”J.福建热作科技,2003,28(2)：45-46.14 张铁,万京,等.文山地区金线莲种质资源初步调查J.文山师范高等专科学校学报,2005,18(1):26-28.15 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴(第五册)M.北京:科学出版社,1980.16 陈裕,等.金线莲的开花特性J