浅谈中药砷盐检查的有机破坏.doc

数据库：电子刊物 记录号：575/897发布日期20041111栏目中药药物评价标题浅谈中药砷盐检查的有机破坏正文中成药中的砷元素的来源，可能来自组方中的矿物药本身（如雄黄等），受地质环境污染或农药污染的中药材原料，受药材加工炮炙与成药生产过程中的污染。砷作为有毒元素1，其检查在食品、化妆品、药品标准中均有限量规定。随着社会进步的要求，中药砷盐检查越来越受到重视。1.目前中药砷盐检查有机破坏中常见的问题样品中砷盐检查结果的准确与否，样品的前处理相当关键。但是，在中国药典的附录里2，3，有关砷盐检查，截至2000年版，只收载了砷盐的“检查法”，样品的前处理缺乏具体的操作或指导原则。卫生部药政管理局颁布的中药新药研究指南4在药材药学研究的技术要求中有所阐述，但受到的关注不够。此外，可供参考的中药材、中成药中的砷盐检查样品前处理的方法很少，目前中药新药申报资料的砷盐检查在供试品前处理上存在以下不足：1.1 未根据测定对象的差异选择方法常见的操作描述有：“取本品1g（或1ml），依法测定”。由于中国药典附录规定砷盐检查“按各药品项下规定方法制成” 2，3，此描述即供试品不经任何处理，直接测定。对绝大部分有机物来讲，未经方法学比较，此法可能欠妥。在美国药典27版附录砷盐5中，就两种供试液处理方法的适用性说明为：一般情况下，方法I（直接测定）用于无机物，方法II（湿法消解）用于有机物。在砷盐检查中，无机物是可以直接依法测定的，如：氧化锌、氧化镁、盐酸、重质碳酸镁3，等。但是，由于有机物对砷盐可能存在吸附、络合等作用影响检出，所以一般有机药物中砷盐的检查均应先进行有机破坏。在化学药品中，不经有机破坏而可以直接依法测定的有机药物不多，一般为：氨基酸及其盐类，可溶于水的脂肪族有机酸（如：乳酸、枸橼酸、葡萄糖酸钙，等），等3。由于中药复方中有机物的情况较为复杂，建议对具体品种建立方法时，作有机破坏与不经有机破坏的试验对比，并对选定的方法作方法验证。1.2 未考虑有机破坏条件不当引起的损失常见的对有机破坏的操作描述有：参照中国药典重金属检查法灼烧，“取供试品一定量，缓缓炽灼至完全炭化，放冷，加硫酸0.51.0ml，使恰湿润，用低温加热至硫酸除尽后，加硝酸0.5ml，蒸干，至氧化氮蒸气除尽后，放冷，在500600炽灼使完全灰化。” 2、3由于砷为较易挥发损失的元素，套用重金属检查法，采用直接的干法高温灼烧是不合适的。中国药典2005年版将明确不推荐C法（直接干法高温灼烧）11。但是，如果通过加入稳定剂如硝酸镁等，使砷成为难挥发性的盐（焦砷酸镁），干法灰化也可取得较好的回收率。硝酸镁干法灰化收载于日本药局方6，我国的食品7、食品添加剂8和化妆品9的国家标准中，也为中药新药研究指南4所推荐。1.3 未作必要的方法学考察。不同测定法对供试液酸度、试剂的要求不尽相同，必要时应作考察。例如供试品用湿法消解和以氢氧化钙或氧化镁为灰化辅助剂处理，酸碱度相差非常大，建议考察供试液的酸度是否需要调整以达到合适的范围。2.常见的砷盐检查供试品的有机破坏方法介绍12、13砷盐检查中供试液制备法，主要包括两方面：供试品的有机破坏和将溶液配制成符合测定方法要求的溶液。以下主要介绍供试品有机破坏的常见方法。2.1 干法灰化干法灰化是靠增高温度和增高氧的氧化能力来分解样品的有机质的。具有样品量大、方法简便、试剂污染空白少的优点，可同时处理较多的样品。砷盐检查的样品前处理，如采用干法灰化，必须选用合适的助灰化剂。采用干法灰化应注意灰化彻底，因为残存的小炭粒有吸附作用，使测定结果偏低；但灰化温度也不能过高，否则砷在灰化过程中损失，也会造成测定结果偏低；助灰化剂如有氧化镁等碱性物质，应注意加入适量的酸中和溶解；注意选用光洁的坩锅，避免吸附损失；处方中如含有矿物药，如最终不能溶解，可能造成测定结果偏低，建议湿法消化。2.1.1 硝酸镁法在灰化加热过程中，砷与其形成焦砷酸镁（Mg2As2O7）而被固定下来，此外硝酸镁还有氧化作用和疏松作用，是目前应用最多的助灰化剂。硝酸镁的加入应注意能均匀渗透到样品内部，是否需要浸泡或浸泡的时间宜根据样品而定。方法一，硝酸镁以乙醇溶液的形式加入，然后点燃乙醇，再加热灰化6。能为乙醇溶解、渗透的样品，此加入、混合方式快捷理想。日本药局方未推荐炽灼温度；注射用双黄连（冻干）2规定的炽灼温度为500600。方法二，加入硝酸镁溶液，混匀，（浸泡，）低温或置水浴上蒸干，氧化镁混匀或覆盖样品上，灰化，加入盐酸（1+1）适量以中和氧化镁并溶解灰分79。炽灼温度均规定为550。2.1.2 氢氧化钙法亚砷酸钙为难挥发性盐。阿胶2及化学药品中需要进行有机破坏的药物大部分采用氢氧化钙法3：加氢氧化钙与供试品混合均匀，干燥后小火炽灼使炭化，再在500600炽灼使完全灰化。美国药典27版5有三个品种采用氢氧化钙法，均为铋的有机酸盐。根据经验与申报资料所附照片，即使用无砷氢氧化钙，空白也较高。2.1.3 无水碳酸钠熔融法熔融法，在对于湿法难以分解的矿物药中有介绍。是将试样用固体熔剂覆盖或混合，然后在高温下加热至全熔或半熔，使待测组分转变为可溶于水或酸中的化合物。一般碱性试样宜采用酸性熔剂（焦硫酸钾、硫酸氢钾、铵盐混合熔剂），酸性试样宜采用碱性熔剂（碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、过氧化钠和它们的混合物）。采用该法的化学药品有3：对氨基水杨酸、芬布芬（700800）、吡罗昔康、苯甲酸钠、富马酸亚铁、糖精钠，等。方法为：取无水碳酸钠约1g，铺于坩锅底部或四周，将供试品置于无水碳酸钠上，加少量水湿润、干燥后，小火炭化，炽灼（500600）。2.2 湿法消解又称酸煮法，依靠氧化剂的氧化能力来分解样品的有机质。常用的氧化剂有：硝酸、硫酸、高氯酸、过氧化氢、高锰酸钾，等。湿法消解具有适用性强、快速挥发损失少、附着损失少等优点，缺点是试剂用量大、空白高，消化过程需要严密监控以防样品炭化、暴沸等，因此每次处理样品的件数不大。湿法消解宜根据样品消解情况通过试验选择合适的酸组与混合酸间的比例。湿法消解操作中需要注意的事项有：消化过程中，样品应避免炭化，在热酸性环境中单质炭易使砷还原为单质而升华损失；加热板在消解最终阶段不宜设定过高，因为水-硫酸的恒沸点在300以上，如加热板的温度设定太高，会造成砷的损失，特别是有盐酸的存在时砷变成氯化物易挥发；加热过程中氧化剂不能干或近干；如用砷斑法、银盐法等测定，由于氮氧化物对砷的还原反应产生强烈干扰，最终硝酸必须全部赶净。2.3 密闭消解法：使用密闭加压的容器消解样品，可以避免挥发性元素的损失，且密闭加压可提高消化温度以促进样品分解。有聚四氟乙烯密闭消解器、微波消解法等。密闭消解的方式需要特殊的装置，较适用于制备供原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法等分析痕量金属元素的样品，试剂量少空白低。缺点是不能分解数量大的样品，不能观察到试样分解的过程，有时样品分解不完全，溶解后的样品仍然有不溶物。需要进行试验比较决定样品和氧化剂的量。表1 不同的标准中砷盐检查有机破坏方法收载的情况方法标准硝酸镁干法湿消解法微波消解法中药新药研究指南4+-美国药典5-+-日本药局方6+-食品标准7+-食品添加剂标准8+-化妆品标准9+香港中成药注册标准10-+中国药典2005年版征求意见稿11-+3. 讨论与建议3.1 关于无机砷测定的参考方法对于正常情况下不应含砷的样品，如不含矿物药的中成药，只需要测定控制总砷。对于含雄黄等含砷矿物药的复方制剂中的“可溶性砷盐”的控制，在安全性方面更为迫切需要。由于砷的毒性与化学形态有关，不同形态毒性差别很大。可参考的方法有：食品“无机砷的测定”7与中国药典雄黄中“三氧化二砷”的检查2。在食品标准中，对于含砷较高的海产品，基于无机砷剧毒、有机砷低毒，规定作无机砷的限量检查而不是总砷的检查。提取是用6mol/L盐酸在6070水浴加热条件下，无机砷以氯化物形式被提取，实现无机砷和有机砷的分离，再行测定7。对于处方中含有雄黄等的样品，一般认为雄黄的毒性主要来自其中的三氧化二砷等，而非其主要成分二硫化二砷。雄黄中“三氧化二砷”的检查2，是取粉末以稀盐酸搅拌、滤过，实现三氧化二砷从二硫化二砷中的分离。牛黄解毒丸、牛黄解毒片、牙痛一粒丸11中，增订了“三氧化二砷”的检查，方法基本参考雄黄中“三氧化二砷”的检查法。但有文献报道认为，复方制剂中“可溶性砷盐”的酸提取液有必要进行消解，否则重现性差14。因此，建议对具体品种建立方法时，作有机破坏与不经有机破坏的试验对比，以确定合适的处理方法。在内服制剂中，基于砷的溶出吸收与毒性密切相关的设想，建议以释放度测定的思路开展可溶性砷盐测定研究。此外，尚可参考有机砷药物Roxarsone中“三价砷”的限量检查法5：取Roxarsone以碘滴定液滴定，以电位滴定指示终点。直接碘量法与间接碘量法为砷定量的经典方法，方法准确易行，但取样量大，对中药而言，受中药复方干扰的可能行大，较适用于砷含量较高的样品总砷的测定。3.2 必要的方法验证新建立的限量检查法均应进行必要的方法验证。砷盐有机破坏方式的选择、验证，应考察回收试验、加样回收试验、重复性试验三方面：回收试验，反映消化过程的稳定剂、温度等方面的合理性，可按以下操作进行：取标准砷溶液代替供试品，照各药品项下规定的方法同法处理后，依法制备标准砷斑（或标准砷对照液）与不经有机破坏的砷斑（或标准砷对照液）相比较。加样回收试验与重复性试验，评价消化效果，可通过比较作有机破坏与不作有机破坏的加标样品进行。如存在有机吸附等作用，未作有机破坏或破坏不彻底，加样回收结果均会偏低。如果供试品中几乎不含砷或含砷较低，重复性试验可由加样回收试验平行操作的结果反映。当方法验证后，检验中按规定2，标准砷斑为标准砷溶液按供试品同法处理，已经包括了试剂空白；必要时，对所用仪器和试液等依法检查，均不应生成砷斑，或至多生成仅可辨认的斑痕，以确认试剂空白在合理范围。参考文献1 犹学筠译, 顾祖维校.国际癌症研究中心( IARC) 最新公布的对人致癌性总评价表(1). 劳动医学,1999.16(2):126-1272 中华人民共和国药典 一部 20003 中华人民共和国药典 一部 20004 中华人民共和国卫生部药政管理局. 中药新药研究指南（药学 药理学 毒理学） 1994：175 美国药典第27版6 日本药局方第十四版：187 食品中总砷及无机砷的测定 总砷的测定 （GB/T 5009.11-2003）8 食品添加剂中砷的测定 （GB/T 5009.76-2003）9 化妆品卫生化学标准检验方法 砷（GB 7917.2-87）10 香港中成药注册安全性资料技术指引附录11 中国药典20