课件：基因工程制药 (2).ppt

第二章 基因工程制药,基因工程是将一种生物的基因分离出来，在体外进行酶切和连接插入载体构成遗传物质的新组合，导入另一种宿主细胞使目的基团得到复制和表达的技术。 基因工程可生产的主要药物是指医用活性蛋白和多肽，包括免疫性蛋白、细胞因子、激素、酶等。,2.1 基因工程药物生产的过程 2.2 目的基因的获得 2.3 基因的表达 2.4 基因工程菌生长代谢的特点 2.5 基因工程菌的稳定性 2.6 基因工程菌的发酵 2.7 基因工程药物的分离纯化 2.8 包含体的复性 2.9 基因工程药物的质量控制,2.1 基因工程药物生产的过程,基因工程的基本要素：工具酶、目的基因、载体、宿主,上、下游,2.2 目的基因的获得,一、构建基因文库,适合于无内含子的原核生物,二、构建cDNA文库,适合于真核生物基因克隆。,三、 PCR方式 先决条件：已知目的基因的DNA序列。 原核：以基因组为模板 反转录PCR（RT-PCR）：提取mRNA，反转录生成cDNA作为模板进行PCR扩增获得目的基因。 四、化学合成 已知基因或蛋白质全长序列，合成短的寡核苷酸片断，拼接为长的DNA片断，再用连接酶连接成完整基因。,2.3 基因表达,基因表达：结构基因在生物体中的转录、翻译及所有的加工过程。 一、宿主细胞的选择 首要条件：能够生产出有活性的目的产物。 其他条件：容易获得较高浓度的细胞； 产物的产量、产率高； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 容易进行DNA重组技术操作； 产物容易提取纯化。,表达系统的分类： 1、原核表达体系 （1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。 革兰氏阴性菌 优势： 遗传背景清楚，基因组序列已确定； 生长迅速，平均2030min繁殖一代； 易于培养，生产成本低，适合大规模培养； 外源基因表达水平高，可达总蛋白的530以上； 有大量可供选择利用的克隆和高效表达载体。,缺点： 缺乏翻译后加工修饰系统，缺少糖基化功能； 没有有效释放蛋白到培养基中的分泌机制； 表达的外源蛋白多形成包涵体，蛋白的复性较困难 ； 翻译目的蛋白N端常多一个甲硫氨酸残基（AUG编码）。,（2）枯草芽孢杆菌 革兰氏阳性菌，其基因组测序已经完成。 胞外分泌能力强； 有很多可用的质粒载体； 无糖基化功能； 具有很强的胞外蛋白酶活性，对目的产物有不同程度降解。,（3）链霉菌 优点： 对人畜基本无致病性； 已发展了一大批有实用价值的载体质粒； 链霉菌的模式菌株天蓝色链霉菌的基因组测序已完成； 具有很强的外分泌能力； 表达蛋白基本能正确折叠，不形成包含体； 具有糖基化功能 为重要的工业微生物，下游培养工艺成熟。 缺点： 对其分子生物学研究不深入； 对外源基因表达的影响因素，特别是分泌机理还需系统研究。,2、真核表达系统 （1）酵母 单细胞生物，无毒，易培养，繁殖快。 具有分泌功能，能够糖基化。 以往多采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为表达系统，近年来采用毕赤酵母（Pichia pastoris）表达蛋白增多。 毕赤酵母转录外源基因的启动子来自于毕赤酵母醇氧化酶I（AOX1）的启动子，受甲醇的严格调控，可使外源基因高效表达。,毕赤酵母的特点： 为真核表达体系，可进行翻译后修饰； 表达量高，明胶的表达量可达14.8g/L; 比其他的真核表达体系培养成本低，只需要含盐的简单培养基； 适于高密度培养，菌体干重可达100g/L以上。 杂蛋白较少，产物纯化容易。,为了最大限度的稳定毕赤酵母表达菌的稳定性，已构建的毕赤酵母载体均为整合型载体；转化前在限制性内切酶单酶切位点进行酶切使载体线形化，然后转化毕赤酵母，线形化的载体与酵母染色体发生同源重组插入到染色体中。 常用载体： 非分泌载体（pAO815、pPIC3K、pPICZ等） 分泌型载体（ pPIC9K、pPICZ等）,（2）丝状真菌 近年来在30种以上丝状真菌中建立了DNA转化体系。 （3）昆虫细胞表达体系 以昆虫细胞为表达宿主。 （4）哺乳动物细胞表达系统 以中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和非洲绿猴肾细胞（COS）细胞使用最多。 优点：糖基化的基因产物接近或类似于天然产物，可分泌表达。 缺点：生长速度慢，培养条件苛刻，成本高。,二、大肠杆菌中的基因表达 1. 有效的表达载体 2. 密码子偏好性 3. 外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 4. 蛋白降解 5. 融合表达 6. 分子伴侣,1. 有效的表达载体 典型的大肠杆菌表达载体主要包括：启动子、操纵位点序列、多克隆位点、转录及翻译信号、质粒复制起点及抗性基因。,1. 有效的表达载体 (1) 载体的复制 松弛型的载体可增加基因的拷贝数，有利于外源基因表达。 高拷贝数的质粒加强菌的代谢负荷，会影响菌体生长，不利于表达。,1. 有效的表达载体 (2) 启动子 大肠杆菌启动子由-10区和-35区组成，两者之间通常间隔1618个核苷酸。 通常采用强启动子表达蛋白； 诱导型启动子可人为控制蛋白表达时机； 在表达毒性蛋白或对宿主有害的外源蛋白时，需要采用强抑制型的启动子，以减少外源蛋白的本底转录。,1. 有效的表达载体 (3) 核糖体结合位点（RBS）与翻译起始 RBS是翻译开始时核糖体30S小亚基识别并结合的mRNA 部位，包括起始密码子及其上游3-13碱基处长度为3-9个核苷酸的SD序列。 SD位点在翻译起始阶段与16S rRNA的3端互补结合。,SD序列和SD与起始密码子间的距离影响翻译起始的效率： 在间隔相同的情况下，不同SD序列翻译效率不同。UAAGGAGG的SD序列比AAGGA的SD序列能使蛋白质的产量提高3-6倍； 对于同一SD序列，存在一最佳的间隔。AAGGA的间隔为5-7个核苷酸，而UAAGGAGG的间隔为4-8个核苷酸； 对于同一SD序列，有一翻译所必需的最小间隔。,在mRNA的翻译起始区的二级结构在决定基因表达效率方面具有重要作用： 提高RBS中A、T残基的丰度能增强某些基因的表达； 突变SD区上游或下游的某些特定核苷酸会抑制mRNA二级结构的形成和提高翻译效率； 位于起始密码子下游的密码子碱基组成，同样会影响mRNA 5端的二级结构，可在保留编码蛋白序列的同时重新构建基因的5端，使其A、T含量增加，减少mRNA二级结构增加翻译效率。,1. 有效的表达载体 (4) 终止密码子 在构建表达载体时，通常插入三个终止密码子以防止核糖体的跳跃。在E.coli中偏向于使用UAA密码子，尤其当其后存在一个U形成UAAU时其转录终止效率最有效。,1. 有效的表达载体 (5) 转录终止子 在原核生物中，转录终止有两种不同的机制： 其一蛋白依赖性转录终止； 其二是非依赖性转录终止作用，它取决于DNA模板的结构特征，形成发卡结构，如T7终止子。 有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件。贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵。 在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，可阻止转录贯穿别的启动子。同样，在目的基因的启动子上游放置一转录终止子，将防止上游转录贯穿带来的影响，还可最大限度地减小背景转录。,1. 有效的表达载体 (5) 转录终止子 由强启动子启动的转录会使转录通读到复制区，造成控制质粒拷贝数的ROP蛋白的过量表达，导致质粒的不稳定。 转录终止子增强mRNA的稳定性并减少了核苷酸在细胞中的消耗，从而提高蛋白质的表达水平。,1. 有效的表达载体 (6) mRNA的稳定性 mRNA的快速降解会影响蛋白质的产生，提高mRNA稳定性有利于提高外源基因的表达。 在E.coli中有两类保护性元件能够稳定mRNA： mRNA的5 UTR的序列； 3 UTR序列及保护性的发卡结构，因而能够阻断外切核酸酶从3末端对mRNA的降解。,2. 密码子偏好性,E.coli中密码子的偏好性表现在： （1）对于绝大多数的简并密码子中的一个或两个具有偏好； （2）某些密码子对所有不同的基因都是最常用的，例如CCG是脯氨酸最常用的密码子； （3）高度表达的基因比低表达的基因表现更大程度的密码子偏好； （4）同义密码子的使用频率与相应的tRNA含量有高度相关性。,2. 密码子偏好性,密码子偏好对蛋白表达的影响: （1）富含E.coli不常用密码子的外源基因 ； （2）存在稀有密码子的群集； （3）mRNA的5末端附近存在稀有密码子。 对策： （1）常用密码子替换稀有密码子； （2）与“稀有”tRNA基因共表达。,E.coli中不常用的密码子,3. 外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,(1) 胞内表达 外源蛋白在大肠杆菌胞内高效表达时通常形成包涵体。 包涵体表达优点：易分离、可免受胞内酶降解。 包涵体表达缺点：需要重新折叠复性。,3. 外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,(1) 胞内表达 帮助蛋白质形成天然空间结构的策略： 较低温度下培养; 降低诱导强度; 选择不同的表达菌株; 替换某些氨基酸残基 与分子伴侣共表达 与高溶解性的多肽进行融合表达 胞内表达可溶蛋白的缺点：容易被降解，纯化目的蛋白相对比较困难。,(2) 周质腔表达 在周质腔中进行蛋白质表达有以下优点： 有利于目的蛋白的纯化； 有利于蛋白质的正确折叠； 有可能产生目的蛋白的天然N-末端； 蛋白质降解少 成功应用的信号肽： E.coli的PhoA、OmpA、OmpT、LamB和OmpF以及金黄色葡萄球菌的A蛋白，胡萝卜欧氏杆菌的PelB的信号肽等。 缺点：信号肽的存在并不总能保证有效的蛋白质通过内膜转运。,(3) 胞外表达 胞外表达优点： 可简化蛋白质的纯化； 减少蛋白酶对目的蛋白质的降解 然而目前还未完全阐明大肠杆菌外分泌的机理，迄今为止还未设计出切实可行的在胞外制备大量外源蛋白的方案。,4. 蛋白降解,“N-末端规则”： 末端Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr和Trp的半衰期为分钟，除脯氨酸外的其他氨基酸的半衰期均超过10小时。 小分子量的蛋白（小于1万）容易被降解。 减少重组蛋白裂解的策略： （1）将蛋白质靶向细胞周质或培养基； （2）选用蛋白酶缺陷的菌株； （3）构建N-末端或C-末端融合蛋白； （4）在较低的温度下培养细菌； （5）替换特定的氨基酸残基以消除蛋白酶裂解位点； （6）与分子伴侣共表达； （7）优化培养条件,5. 融合蛋白,融合表达具有多方面的优点：能使外源基因得到有效转译，防止包涵体的形成，促进蛋白质的正确折叠，限制蛋白酶解，利于检测与纯化。 成功应用的融合担体蛋白：谷胱甘肽S-转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）以及硫氧还蛋白（Trx）等。 融合表达一般都有方便的纯化方法（ GST 融合蛋白可采用谷胱甘肽-sepharose亲和柱进行纯化，带组氨酸标签的融合蛋白采用金属螯合层析纯化）。 缺点：对融合蛋白进行位点特异性裂解。,6. 分子伴侣,有效的蛋白质翻译后折叠是由一种被称为分子伴侣的专职蛋白来介导的。 原核分子伴侣（GroES、GroEL、DnaK、HtpG）能稳定表达的蛋白折叠中间体，可提高正确折叠的蛋白质的产量。 缺点：适用性较差，大多数情况下即使是共表达分子伴侣也难获得高效表达的可溶蛋白产物。,三、酵母体系中的基因表达 表达系统：载体、宿主细胞 （一）表达载体 1. 载体的复制序列 四大类： （1）YEp类(yeast episomal plasmid,酵母附加体质粒) 复制序列来源于酵母2质粒 拷贝数：550 高拷贝数：100200 稳定性高,（2）YRp类(yeast replicating plasmid,酵母复制型质粒) 复制序列来源于非2质粒的自主复制序列(ARS) 如酵母染色体 拷贝数：510 稳定性差 （3）YCp类(yeast centromeric plasmid,酵母着丝粒质粒) 复制序列：含酵母染色体复制序列及酵母染色体中心粒成分，有的含酵母染色体端粒 类似染色体，参与细胞有丝分裂和减数分裂 拷贝数：1 稳定性好,（4）YIp类(yeast integrative plasmid,酵母整合型质粒) 含可与酵母染色体重组的同源序列 整合到染色体上，依靠染色体复制而复制 拷贝数少(1个或少数几个) 稳定,2. 穿梭载体 可在大肠杆菌和酵母中复制 含大肠杆菌质粒pBR322复制序列和抗生素抗性基因 酵母中选择性标记：抗性基因或某些氨基酸或核苷酸合成酶基因,3. 表达载体 含酵母启动子和终止子 胞内表达载体 分泌表达载体（含信号肽序列，-因子 ）,（二）影响目的基因在酵母中表达的因素 1. 外源基因的剂量 拷贝数 稳定性 对菌生长的影响 2. 外源基因的表达效率 启动子、终止序列、分泌信号,PHO5启动子 无机磷调节（低磷诱导）,分泌信号： 可利用异源分泌信号，酵母自身分泌信号优于其他生物的分泌信号 终止序列： 保证mRNA在适当部位终止，加polyA, 增强mRNA稳定性,3. 外源蛋白的糖基化 N-糖链（天冬酰胺） O-糖链（丝氨酸、苏氨酸） 与天然产物类似，不完全相同 4. 宿主菌株的影响 生长能力强 内源蛋白酶较弱 菌株性能稳定（突变株，使用二倍体或多倍体） 分泌能力