微生物实验室的分类及要求

微生物实验室的分类及要求,一、微生物的生物安全等级,根据生物因子对个体和群体的危害程度可将微生物分为4 级 1.危害等级I （低个体危害，低群体危害） 这类微生物包括：不会导致健康工作者和动物致病的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子。 2.危害等级 (中等个体危害，有限群体危害) 这类微生物能引起人或动物发病，但一般情况下对健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危害的病原体。实验室感染不导致严重疾病，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限。,3.危害等级 III （高个体危害，低群体危害） 这类微生物能引起人类或动物严重疾病，或造成严重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能使用抗生素、抗寄生虫药治疗的病原体。 4.危害等级 (高个体危害，高群体危害) 能引起人类或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容易直接或间接或因 偶然接触在人与人，或动物与人，或人与动物，或动物与动物间传播的病原体。,二、生物危害评估,生物危害评估的内容： 危害程度评估应至少包括下列内容： A.生物因子的种类（已知的、未知的、基因 修饰的或未知传染性的生物材料）、 B.来源 C.传染性 D.致病性 E.传播途径 F.在环境中的稳定性 E.感染剂量 F.浓度 G.动物实验数据 H.预防和治疗。,三、微生物致病能力的影响因素,决定微生物致病能力的因素主要有以下几个方面： A.菌量； B.菌龄； C.感染途径； D.被感染者； E.存留时间；,5.实验室门应带锁并可自动关闭。实验室的门应有可视窗。 6.实验室应有足够的存储空间摆放物品以方便使用。在实验室工作区域外还应有供长期使用的存储空间。 7.实验室内应使用专门的工作服，应戴乳胶手套。 8.实验室工作区域外应有存入个人衣物的条件。 9.实验室应配备高压蒸汽灭菌器，并按期检查和验证，以保证符合要求。 10.应在实验室内配备生物安全柜。 11.应设洗眼设施，必要时应有应急喷淋装置。 12.应通风，如使用窗户自然通风，应有防虫纱窗。 13.有可靠的电力供应和应急照明，必要时，重要设备如培养箱、生物安全柜、冰箱等应有备用电源。 14.实验室出口应有在黑暗中可明确辨认的标识。,五、微生物实验室的建筑要求,1.实验室的建设应以“无回路”为宗旨。 2.在时间和空间上可有效隔离各种检测活动。 3.实验室的区域设置上应至少包括以下部分： a.样品的接收和储藏区； b.样品的前处理区； c.样品的微生物检测区； d.培养区（BSL2 实验室可与检测区合并）； e.标准菌株存放区（冰箱、低温冰柜或常温保存箱）； f.培养基与器材准备区（也可与灭菌区合并）； g.无菌区；,h.污染物处理区； i.办公区； j.更衣室； 4.建筑要求： a.墙壁、天花板、地面和桌椅、操作台应光滑易清洁。 b.天花板应设置为统一无隙整体，以减少灰尘下落 c.地面、墙壁、天花板连接处应有弧度。 d.除非密闭包装，液体运输管路不应在工作区上方穿过。 e.换气系统中应有空气过滤装置。,微生物检测的新技术,1.皿膜法以纸片法为代表,纸片法是目前被广泛接受的方法。国标餐具大肠菌群采用的就是纸片法。 优点：无需制备培养基，携带方便，非漫延菌落计数较方便。 缺点：检测成本相对偏高。与传统标准缺乏对应规律，不能替代传统检测方法，重现性较差。,2.微生物生化自动鉴定仪,代表厂商：BD crystal,梅里埃 VITEK系统，英国AUTOREAD细菌鉴定系统。 鉴定原理：在细菌鉴定板中加入指示剂记录细菌生长后发生的颜色变化，利用统计软件计算生化反应的概率。得出生化反应的结果。 优点：可以完全替代传统生化反应，可一次检出多种致病微生物，灵敏度高。 缺点：仍然需要进行传统增菌培养，成本较高。,CRYSTAL生化鉴定结果,3.PCR扩增技术,PCR（polymerase chain reaction) ：聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。 1985年由美国 Cetus 公司的Kary Mullis 首创的PCR技术，可以将微量DNA片段扩增一百万倍以上。 PCR技术的优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。,二、PCR的原理：,94变性5MIN,55退火,72引物延伸,模板变性,退火,第二次循环,延伸,Step1. 变性：加热使模板DNA在高温下（94）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。 Step2. 退火：溶液温度降至5060，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。 Step3. 延伸：溶液反应温度升至72，耐热DNA聚合酶以单链为模板，利用引物的3-OH，以反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物，按53方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。,【实验步骤】,1. 在0.2 mL Eppendorff管内配置50 L反应体系：,2. 按下述程序进行PCR扩增: 1） 94 预变性 3 min； 2） 94 变性 1 min； 3） 55 退火 45 sec； 4） 72 延伸 1 min； 5） 重复步骤24, 34次； 6） 72 延伸 10 min； 7） End. 3. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 配制1琼脂糖凝胶，取10 L扩增产物电泳。保持电压100V。电泳结束后，在紫外灯下观察结果。,PCR实验的缺点： 1.模板DNA的制备较难。由于食品中成分复杂，油脂及金属离子等会抵制TQP酶的活性，如用煮沸裂解法直接提取DNA，则很难去除油脂等杂质。 2.假阴性结果：由于影响PCR的因素很多，扩增效果常不理想。会出现较多的