病理学实验技术重点.doc

1.什么是病理学技术？ 病理学技术（组织标本切片和染色技术）是组织学、病理学等学科用于观察和研究组织与细胞的正常形态及病理变化的常用方法。2.组织制片的目的。生物学标本在生活状态下多为无色透明，而且组织一旦离开机体后很快就会死亡，其结构就会失去正常状态,必须对组织采取固定、切片和染色措施！3.何谓组织制片技术？ 组织经过固定、切片和染色后，光波通过被检组织成分时，波长和振幅发生改变，在显微镜下能清晰的观察其组织结构，称之为光镜标本的基本制作方法或称为组织制片技术。4.组织制片种类及其各类方法的分类。 （一）组织非切片制作方法：组织分离标本 组织活体标本 组织涂片标本 磨片标本 整体封存（压片）标本 组织铺片标本 组织印片标本等 （二）组织切片法：1.石蜡切片法 2.火棉胶切片法 3.冰冻切片法 4.超薄切片法（电镜技术） 5.树脂切片 6.碳蜡切片5.组织制片的主要程序。 取材、固定-脱水-透明、浸渍-包埋、切片-贴片、染色-浸洗-脱水-透明-封固6.实验动物处死常用方法及优缺点。 1）挥发性麻醉剂（吸入麻醉）包括：乙醚、氯仿等。 优点：乙醚吸入麻醉适用于各种动物，安全度亦大，动物麻醉深度容易掌握。 缺点：是对局部刺激作用大，可引起上呼吸道粘膜液体分泌增多、肺部充血，再通过神经反射可影响呼吸、血压和心跳活动，并且容易引起窒息，故在乙醚吸入麻醚时必需有人照看，以防麻醉过深而致动物死亡。 2）非挥发性麻醉剂（注射麻醉） 这类麻醉剂种类较多，包括10%苯巴比妥钠、4%戊巴比妥、5%硫喷妥钠等巴比妥类的衍生物，20%氨基甲酸乙脂（乌拉坦）和1%水合氯醛、氯胺酮等，可通过肌肉注射、静脉注射、腹腔注射。 优点：这些麻醉剂使用方便，一次给药可维持较长的麻醉时间，麻醉过程较平衡，动物无明显挣扎现象。 3）断髓（脱臼）法 动物处死过程中动作要迅速，尽量避免其长时间处于痛苦或濒于死亡状态，以免机体内组织或细胞结构发生改变引起人工假象。 4）空气栓塞法 适用于较大的动物，如兔、猴、犬等。迅速方便，但可使内脏器官或多或少的呈现瘀血，如心内膜下瘀血、肝血窦扩张 7.组织取材注意事项。 1.材料保持新鲜：2.标本大小适宜：3.勿使组织块受挤压：4.尽量保持组织的原有形态：5.选好标本切面：6.保持材料的清洁：7.切除不需要部分8.明确编号，登记8.什么是固定，其意义及目的？ 固定： 是指从人体内或动物体内取下的材料立即浸泡在化学试剂中，借助化学试剂的作用，将组织细胞结构保存起来，使其形态结构近似生活状态的一种手段。 意义 保持细胞、组织的固有形态和结构 目的 （1）防止标本的自溶与腐败，以保持组织细胞的固有形态。（2）使组织细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种物质成份沉淀或凝固成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。（3）可增强染色的作用。使组织中的各种物质沉淀凝固而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。（4）固定剂兼有硬化作用，使组织硬化，增加组织硬度，便于制片。（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。 另外，对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。 固定的作用：防止组织的自溶与腐败 使细胞内蛋白质凝固 保持组织的固有形态和结构 保持组织或细胞的抗原性9.常用的固定方法。 蒸汽固定法 、标本固定（侵泡固定）、 灌流固定 （局部固定-心脏、睾丸、肺，全身固定（灌注量和灌注压是全身灌注过程最重要的两个因素。）-适用于缺氧敏感的组织）、涂片固定（侵泡固定、滴液固定）、散在细胞固定、微波固定10.影响固定的因素及注意事项？ 1 .组织固定必须新鲜：无论取人体或动物组织，都必须立即投入固定剂。 2.防止组织因固定剂的作用而发生变形： 3.标本大小：在保证形态结构完整性的同时，厚度不超过5mm。 4.固定液的量：一般为组织块体积的20-30倍（不得少于标本体积的5倍）。5.固定时间：根据组织的种类、大小，固定剂种类、性质、渗透力的强弱而定。 6.固定温度：室温（20-25）或低温（如4），一般不应超过40-45 。7.选择适当的固定液：8.促使固定：11.常用的固定剂有哪些？ 1、单纯固定剂 甲醛37 -40的甲醛水溶液，即市售福尔马林、37 -40甲醛当做100%福尔马林10mL+蒸馏水90mL此液实际上为4甲醛水溶液、多聚甲醛、乙醇、醋酸、苦味酸、锇酸、丙酮、重铬酸钾、戊二醛等 2、 混合固定液 Karnoversys改良液、Bouin液、 Zenker液、A-F液（乙醇-甲醛液）、Carnoy液、 Zambonis液、 PLP液12.什么是脱水？常用脱水剂 利用某种化学试剂逐步将标本内部吸收的水分置换出来，以使标本处于无水状态，这一过程叫脱水。 脱水剂的种类1.单纯脱水剂： 如乙醇、丙酮和甲醇。其组织在脱水后必须再经二甲苯透明才可浸蜡。常用乙醇2.脱水兼透明剂： 如正丁醇、叔丁醇等，组织在脱水后即可直接透蜡，不必经过中间溶剂如二甲苯之类的试剂。13定义：透明、浸透、普通染色、特殊染色、单一染色、复染色、多种染色 透明： 组织块中的脱水剂被有机溶剂取代，其折射指数接近于组织蛋白的折光指数，组织块变得透亮，因此称之为透明。透明剂有：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等。 浸透：用浸透剂（如石蜡、火棉胶、碳蜡和明胶等）渗入组织内部的过程。 普通染色：最广泛应用的是苏木精和伊红染色，又称常规染色。特殊染色：为显示特定的组织结构或其他的特殊成分。单一染色：选用一种染料对组织或细胞中的某一种结构或成分的染色。复染色：衬托主染色所进行的染色。多种染色：如荧光染色，可用不同颜色的荧光染料标记不同的成分。14石蜡包埋程序。1）组织取材，于固定剂固定。 2）组织洗涤6-12h。 3）脱水：70酒精1-3h 80酒精1-3h。 90酒精1-3h。 95酒精（、）1-3h。 100酒精（、 ）1-2h。 4）透明：二甲苯（）5-30min。 (二甲苯（）5-30min)。 5）浸蜡（、 ）2h。 6）组织包埋15冰冻切片步骤（切片前/后固定）。 固定过的组织-切片前固定 1、新鲜组织取材 2、4%甲醛固定2h或以上 3、入15%、20%、30%蔗糖溶液（0.1M PBS，pH7.4），浸泡至组织块沉底 4、冰冻切片机切片 5、贴片，风干，冰箱保存备用 6、染色切片后固定： 1、新鲜组织取材 2、（立即置入超低温冰箱/液氮冷冻2min (锡箔纸包裹后冷冻，用于组织的保存)） 3、用OCT包埋在冰冻头子上 4、切片0.530微米，附于载（盖）玻片上 5、冷风吹干/固定 冷固定液（-4），固定2-10min.室温固定30-60sec. 固定液：丙酮、Carnoy液、甲醛-乙醇、4%中性甲醛等16石蜡切片HE染色步骤。 1.常规石蜡切片（1） 脱蜡至水：二甲苯二甲苯100%乙醇95%乙醇 90%乙醇 80%乙醇 70%乙醇蒸馏水浸洗 各5-10min（510）min2或3次各510min25min（2）苏木精染色： 苏木精1-10min。 自来水流水冲洗。 0.5%盐酸-乙醇分色，数秒-数十秒。自来水快洗。 0.5%氨水蓝化，30sec-1min，自来水冲洗 光镜下镜检细胞核分色程度。 自来水流水冲洗3min。（3）伊红染色： 1%伊红1-10min。 蒸馏水快洗。5.脱水、透明和封固： 70%、80%、90%乙醇速洗，每级数秒-数十秒。 95%30sec-1min.光镜下监控细胞核与细胞质颜色对比。 100%乙醇，3-5min，2次。 二甲苯、,各5-10min。 封片:中性树胶 17冰冻切片HE染色步骤。2.冰冻切片（1） 冰冻切片10%甲醛固定 流水冲洗 蒸馏水浸洗1-5min2min3min（2）苏木精染色： Harris苏木精1-5min。自来水快洗。 0.5%盐酸-乙醇分色，1-2sec。自来水快洗。 0.25%-0.5%氨水蓝化，几秒-十几秒，自来水冲洗。 光镜下镜检细胞核分色程度。（3）伊红染色： 1%伊红1-5min。 蒸馏水快洗。5.脱水、透明和封固： 70%、80%、90%乙醇速洗，每级数秒-数十秒。 95%30sec-1min.光镜下监控细胞核与细胞质颜色对比。 100%乙醇，3-5min，2次。 二甲苯、,各3-5min。 封片:中性树胶 18、组织化学定义及特征。是基于已知的化学反应，在组织或细胞原位上显示出组织或细胞中的化学物质，并研究其化学性质及功能关系的一门技术。组织化学的特征： 应用物理的和化学的方法来查明细胞或组织的化学成分； 用组织学、化学、物理学原理，研究细胞或组织的结构、功能与化学的关系； 对细胞或组织成分的定位、定性、定量的特征进行研究，来认识细胞或组织结构与功能的关系。 具有较强的特异性。 19、组织化学基本步骤及基本要求。 基本要求（1）保存组织（细胞）在生活状态下的结构；（2）保存组织（细胞）内的生前化学成分、酶活性及检测目的物；（3）所使用的染色方法是按照已知的化学或物理反应原理进行。（4）反应产物应在组织结构上形成稳定的有色沉淀物质。（5）检测手段要有高度的敏感性、特异性和可重复性。 （6）生成物的反应产物必须在原位沉淀，保证定位的精确性及稳定性。基本步骤 冰冻切片或石蜡切片等常规处理（同普通制片）进行组织（细胞）化学染色在光镜下观察20、组织化学染色方法分类。 纯化学方法：Schiff反应法、偶氮偶联法、金属沉淀法、联苯胺反应、四唑盐反应 类化学反应： 属某些特殊染色技术，如： Best洋红染色 显示糖原 Baker酸性苏木精染色 显示磷脂 Mayer黏洋红与黏苏木素 显示黏蛋白 物理学：脂融染色法、荧光分析、放射自显影21、显示核酸、糖原、脂类物质常用的方法。 糖类物质的显示方法： PAS显示法（Periodic Acid Schiff）、 阿利新蓝法（Alcian Blue）阿利新蓝-PAS复合法（Alcian Blue-PAS）、 胭脂卡红法（Carmine method） 、甲苯胺蓝法、硫堇法等 核酸显示法 1、显示DNA ： Feulgen法 试剂：Schiff试剂、盐酸、亚硫酸氢钠2、核仁组成区和酸性粘多糖复合显示法： 试剂：2%的甲酸、2%的明胶、50%的硝酸银、阿申蓝（8GX）、醋酸溶液3、粘多糖和核仁组成区双染法 试剂：Schiff氏试剂、胶性银液 4、RNA和DNA的甲绿-派若宁显示法 试剂：甲绿、派若宁 脂类显示1、单纯脂质：如中性脂肪，油及蜡等，苏丹染料可染为黑色或红色。2、复合物质：如醇类，脂肪酸，磷酸和含氮的碱基等。复合脂质分为磷脂和糖脂。磷脂：卵磷脂，脑磷脂和神经鞘磷脂。苏丹黑染色为阳性，PAS反应为阴性。糖脂：PAS反应呈阳性。衍生脂质：指尚具有脂质性质的单纯脂质或复合脂的水产物，属于这类的有脂肪酸和固醇类。 脂肪酸：硫酸耐尔蓝阳性，PAS阴性。 胆固醇及其酯：Schultz试验阳性。 22、酶组织化学定义、常用方法及影响酶组织化学的主要因素酶组织（细胞）化学：用组织（细胞）化学方法显示酶在组织或细胞内的定位的技术。 常用酶组织（细胞）化学方法 酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、三磷酸腺苷酶、乙酰胆碱酯酶、细胞色素氧化酶、一氧化氮合酶 影响酶活性的因素：1 温度：大部分酶反应的合适温度为37。温度较高，酶蛋白快速变性而失活。酶反应速度随温度下降而减慢。2 pH： 酶有适合酶反应速度的pH(大部分为7.0)。但碱性磷酸酶（AKP）pH在9.5左右；酸性磷酸酶pH在5.0显示其最大的活性。3 抑制剂 能使酶活性降低的物质。 特异性抑制剂 非特异性抑制剂 竞争性抑制剂 切片上的酶可为抑制剂破坏，对照可选用抑制剂。4 激活剂 能使酶活性增高的化学物质。 如Mg2+为金属沉淀法显示碱性磷酸酶的激活剂。5 底物浓度对酶反应速度的影响 在酶组织化学中，当底物的浓度还没达到最高值时，其反应的速度与底物的浓度成正比，底物浓度愈高，其反应速度愈快，但当底物浓度达到所需的最高值时，其反应速度将趋于恒定。23免疫组织（细胞）化学概念及分类。 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。 分类 免疫荧光组织化学法 免疫酶组织化学法 亲和免疫组织化学 免疫金-银细胞化学技术 免疫电子显微镜技术等24免疫组织化学的突出优点。 特异性强 敏感性高 定位准确 形态与功能相结合 方法步骤统一25免疫组化的全过程。 1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体（免疫球蛋白）以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的制备；5.免疫细胞化学反应以及呈色反应；6.观察结果。26抗原、抗体的概念及抗原抗体的关系。 抗原（antigen） ： 凡是能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特异性结合的物质称为抗原；物质具有的这种特性称为抗原性是机体受抗原刺激后，在体液内出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白（Ig）。含免疫球蛋白的血清称免疫血清。、 抗原与抗体的关系 抗原是引起机体产生免疫反应的主要外因，决定免疫反应的特异性。 机体与抗原物质的斗争过程中为加速循环和排除抗原而产生的抗体、致敏淋巴细胞等物质，是机体排除异体物质的保护性反应，没有抗原的刺激，机体不能产生抗体，没有抗原物质，也无法检测抗体的存在；利用抗体可以检测抗原物质的存在。 27抗原的特性、种类。 抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。根据抗原性质分为两类：完全抗原和不完全抗原。 根据抗原刺激B细胞产生抗体是否需要T细胞协助分类，可分为胸腺依赖性抗原（TD-Ag）和胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）。根据抗原的来源可将抗原分为（1）异种抗原（xenoantigens）；（2）同种异型抗原9alloantigens)；（3）自身抗原（autoantigens）；（4）异嗜性抗原（heterophilic antigens）：又称Forssman抗原28多克隆抗体和单克隆抗体。 一株B淋巴细胞（一个克隆）只能产生针对一个抗原决定簇的抗体，那么由许多株B淋巴细胞针对多个抗原决定簇所产生的抗体就称为多克隆抗体。针对某单个抗原决定簇、由单株B淋巴细胞所产生的抗体，称为单克隆抗体。29免疫组织（细胞）化学基本步骤。取材-固定-制片-酶消化处理-抗体处理-免疫染色-结果判断30抗体稀释的原则。 阳性物质着色应鲜明，背景应浅或不着色。抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏感抗体稀释度应越高。31免疫荧光组化技术定义及常用荧光色素。是利用荧光色素标记抗体与组织或细胞中的相应抗原反应，形成抗原与标记抗体复合物，借助紫外光或蓝紫光激发荧光色素，并在显微镜下呈现特异性荧光反应，从而定位抗原或抗体的技术 。常用的荧光色素包括：异硫氰酸荧光素（FITC） 四甲基异硫氰酸若丹明（TRITC） 四乙基若丹明（RB200）32免疫酶组织（细胞）化学技术，理想标记酶应具备的条件，常用标记酶的反应底物及呈色。免疫酶组织（细胞）化学是免疫组织（细胞）化学中最常用的方法之一，它是在抗原、抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学的手段，检测某些物质（抗原/抗体）在组织细胞内存在部位的一门技术。 理想标记酶应具备的条件 酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察； 所形成的终产物沉淀必须稳定，不扩散，有良好的定位； 酶与抗体结合不影响AgAb的特异性反应； 在组织与体液中不存在内源性的酶及其底物。 中性pH 时，酶应稳定，标记抗体后，保存 1-2 年活性不应改变，且酶的催化活性越高越好； 常用标记酶的反应底物及呈色。辣根过氧化物酶（HRP) 底物显色剂 DAB （ 3, 3- 二氨基联苯胺）：显色后阳性反应产物呈棕褐色； AEC （ 3, 氨基 -9- 乙基卡巴唑）：显色后阳性反应产物呈红色或紫红色。碱性磷酸酶(AP) 偶氮染料中，fast blue（快蓝）和fast red（快红）的产物分别为蓝色和红色，不溶于水，但溶于有机溶剂。因此封片时不能用酒精脱水、二甲苯透明，只能用明胶甘油或缓冲液封片，故切片易退色,不宜久置，应立即观察、照相33酶桥法、PAP法原理。 原理：用化学交联法将酶与抗体分子连接，染色时在用特异性抗体与标本中抗原结合之后，将桥抗体结合于其上，再将抗酶抗体结合于桥抗体上，最后把酶结合在抗酶抗体上，经过底物的呈色反应而将抗原显示出来。 原理：PAP法的基本原理与酶桥法相同，只是酶和抗体制成的免疫复合物（PAP）代替了酶桥法中的抗酶抗体和随后结合的酶，把两个步骤合并为一个步骤，其效果更好。 34亲和组织（细胞）化学法，已经建立的方法有哪些？目前已经建立的方法有LAB法、 BRAB法、 ABC法、SP法等。35免疫组化制片常用固定剂及固定注意事项。 常用固定剂为多聚甲醛、戊二醛、Bouin固定液（1） 最完整的保存组织（细胞）的形态结构，使其更接近于生活状态。（2） 最大限度地保存组织（细胞）内的抗原免疫活性。36 SP法免疫组化染色步骤。1. 石蜡切片脱蜡至水（或恒冷箱切片）。2. 0.01mol/L PBS洗，25min3. 0.3%H2O2-甲醇，室温孵育10min（以消除内源性过氧化物酶的活性）；4. 蒸馏水冲洗，PBS洗35min；5. （0.1%Triton X-100 PBS，15min（增加细胞膜透性）6. 抗原修复。PBS 洗35min；7. 滴加10%正常山羊血清（PBS稀释），室温10-15min，倾去血清，勿洗。（封闭非特异性抗体的结合位点）8.滴加一抗，置湿盒内，37 ,1h 或冰箱过夜（4过夜后在37复温） ； 9. PBS洗35min； 10.滴加生物素标记的二抗，37孵育30min 1h；11. PBS洗32min；12.三抗（ SP复合物），37孵育30 min 1h；13. PBS洗35min；. DAB显色剂显色3-10min （镜下显色），蒸馏水终止显色，（或用其他显色剂，显色后直接用水溶性封片剂封片）14.（苏木精复染）15.常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片37免疫组化ABC法操作步骤。1、冰冻切片或石蜡切片脱蜡至水； 0.01mol/L pH7.4 PBS洗5min3次； 2、0.3%H2O2甲醇溶液，室温，1030min。蒸馏水洗。 PBS洗5min3次；3、（抗原修复）4、（冰冻切片分别用0.01%亲和素和0.01%生物素溶液作用切片20min，抑制内源性生物素； PBS洗3min3次; ）5、10%正常山羊血清，室温10-15min，倾去血清，勿洗;6、滴加稀释的一抗，湿盒内 37 30-60 min，或4冰箱内4872h；PBS洗3min3次;7、滴加生物素标记二抗，37 30-60min; PBS洗5min3次;8、滴加三抗（ABC（SABC)复合物），37 30-60min; PBS洗5min3次9、DAB-H2O2液显色，用蒸馏水洗终止反应；10、（复染）脱水，透明，封片。 结果：DAB显色的抗原-抗体复合物呈棕色，（细胞核蓝色）。若用AEC显色剂显色，需用水溶性封片剂封片，抗原-抗体复合物呈红色。38抗原修复的目的及常用方法。抗原修复： 通过化学或物理方法，恢复抗原原有的空间结构，暴露抗原决定簇目的：充分暴露被交联封闭的抗原决定簇。主要用于：甲醛固定液或含有甲醛的固定液固定的组织。 常用的方法有： 单纯加热法热修复法 高压加热法 微波加热法胰蛋白酶消化处理胃蛋白酶消化处理 化学修复法39免疫组织化学实验中对照组的设立。 通常是针对第一抗体设立对照，包括：阳性对照、阴性对照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。40免疫组化染色过强、非特异性背景染色、染色弱的可能原因及解决方法。1、染色过强 原因1：抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 解决办法 ：降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1h或4过夜 原因2：孵育温度过高，孵育温度超过37。一般室温20-28 原因3： DAB显色时间过长或DAB浓度过