高效液相色谱法鉴别圆珠笔字迹书写时间的实验研究.docx

高效液相色谱法鉴别圆珠笔字迹书写时间的实验研究 【摘要】 由圆珠笔油墨形成的契约、合同、收据和借条等可疑文件的真伪及形成时间的鉴定是目前法庭科学实验室经常遇到的问题，因此建立简便、灵敏和准确的检验圆珠笔油墨字迹色痕的异同及形成时间的方法是十分必要的。文章介绍了圆珠笔油墨字迹的鉴定方法的历史由来，并且重点实验研究了高效液相色谱法，这种方法是依据分析圆珠笔油墨中染料的种类及染料随时间的变化关系来确定圆珠笔油墨字迹的异同及书写时间，染料随时间的变化可以通过相应的色谱峰的峰面积比计算而得。 【关键词】文件检验；高效液相色谱法；圆珠笔油墨；书写时间 圆珠笔于20世纪30年代末出现，1945年正式投入市场，由于它携带方便、色泽鲜明、字迹较稳定，所以很快便受到人们的青睐，各种帐目、收据、契约和遗嘱等常常都用它来书写。因此，在一些刑事案件和经济案件中，当事人常常于事后用圆珠笔添加、涂改、伪造文件的内容和时间，达到逃脱罪责、篡改事实的目的。在侦破此类案件的过程中就需要对可疑文件上圆珠笔油墨字迹的异同及形成时间进行鉴定。所以圆珠笔油墨书写字迹的真伪及形成时间的鉴定是备受关注的。 近百年来国内外法庭科学工作者一直在关注、探索文字书写时间的鉴定工作。对一些人们所常用的书写工具圆珠笔形成的色痕种类、书写时间的鉴定开展了大量的研究工作，建立了一些鉴定方法。 一、当前鉴别圆珠笔字迹书写时间的几种方法 在圆珠笔油墨生产中，由于成分随着年代的不同呈现变化，给文字的鉴定提供了很好的条件。通过使用气相色谱、分光光度法、点滴试验和其他一些方法来对比样品和标准品，从而确定样品生产日期法庭科学工作者希望生产厂家频繁改变圆珠笔油墨的成分，从中寻找有效组分来进行时间认定，但这只是一种想法，很难实现。此外，用配方的变化来认定时间是不科学的，它仅反应的是生产时间或上市的时间，而不是文字形成的真正时间。下面简单介绍几种方法： （一）标准样品比对法 Brunelle等将收集到的6000多种标准样品用薄层色谱、显微镜、化学试验、红外光谱、荧光光谱和紫外光谱法进行了分析。发现这些样品彼此间有区别，即使是同一种配方的样品，由于原料的不同或生产工艺的变化，反映在样品中有微量杂质的差异。对可疑的字迹进行分析并与这些标准样品比对，能很好地进行认定，至少可以提供某种配方最早使用的时期，特别对否定是很有意义的。 （二）基准物标记法 基准物标记法是生产厂家在圆珠笔的油墨配方中加入某种化合物，以此化合物作为标记来认定厂家。因每年都要改变基准物，故可以直接认定油墨的生产厂家和生产的年代。在我国因种种原因，又很难实行。 （三）溶剂萃取法 很多测试方法是在溶液中进行的，所以提取不仅是分析测试的前处理，同时本身也是一种很重要的分析方法。暴露在空气中的文字色痕，由于发生物理和化学变化，随着时间的增加提取越加困难。即新鲜的字迹色痕易提取，而陈旧的则较难提取。基于这一点选用单一溶剂，双溶剂或多次萃取。其萃取量（或萃取速率）与文字色痕形成时间的关系有一定的规律性。萃取速率法是测量油墨进入溶剂的速率，用R=Atl/At2表示，Atl为t1时间萃取的量，At2为全完萃取或接近完全萃取的量。新鲜的字迹R大，陈旧的R小。萃取量的测定通常采用紫外可见光谱法、荧光光谱法、高效液相色谱法和薄层色谱法等。 （四）单一溶剂萃取法 它要求使用相同的样品量，用同一种溶剂，能萃取纸上油墨10%70%范围，然后直接测定，建立关系式。还有将萃取液点于薄层色谱板上进行光密度测定。有人将将圆珠笔书写在滤纸上，分别用甲醇、苯甲醇、n丁醇、异丙醇等单一溶剂进行提取，点于薄层板上，用CS930进行扫描，波长为580nm。从新鲜样品到46个月，峰随时间减弱，偏差为10%。用异丙醇提取黑色圆珠笔油墨前7个月变化较大，推断的时间较准，7个月后曲线平稳，变化不大，相应偏差较大。而用甲苯作为单一溶剂萃取的蓝色圆珠笔油墨要比黑色好得多。 （五）气相色谱法 圆珠笔油墨中除色料外，还含有易挥发的载色体等成分。它们形成字迹后很快挥发掉，这样依据易挥发成分的变化，可以与字迹书写时间建立关系。国内也曾有人对易挥发的苯甲醇和不易挥发性的成份进行了测定，并进行比较，得到近30天的工作曲线，同时考察了温度变化对工作曲线的影响。 （六）分子光谱法 在七十年代就将紫外可见分光光度法用于圆珠笔油墨的分析，作为种类属性的认定，但分辨率低是它的一大缺陷。也有人根据红色圆珠笔油墨中发光物质的存在进行荧光光谱测定，提高了检测的灵敏度，仅仅用发光物质来相互区别是困难的，其原因是红色油墨中的发光物质的主要成分相同，通常为珠光红，而且这种物质基本不随时间发生变化。而使用博里叶红外光谱研究干燥的圆珠笔的红外吸收带OH/CO吸收比值，发现它与时间改变呈现一定规律，以此可以确定字迹时间年龄。利用这一技术可以对同一厂家、同一配方不同的圆珠笔所形成的字迹色痕做出准确的鉴别，所以它在对圆珠笔添改字迹的鉴别方面有很强的实用价值。 二、HPLC实验研究 （一）实验原理 主要用于圆珠笔油墨中的染料分析。有些染料在250以下气化且不破坏结构，可以用气相色谱法进行快速定量分析，效果良好，但大多数染料的分子量都很大。且结构中往往含有磺酸基和季铵盐等，一般很难进行气化，因此不能采用气相色谱法进行鉴定，只能用液相色谱分析。 （二）实验样品及器材 1.试剂：甲醇、乙腈、冰乙酸（均为分析纯）和二次蒸馏水。 2.样品：81种不同产地，不同牌号的蓝色圆珠笔。 3.仪器及分析条件：岛津LC-20AD液相色谱仪，SPD-M20A紫外检测器，CTO-20A柱温箱，CBM-20A型HPLC管理系统，色谱柱：C18色谱柱（Water），检测波长：580 nm，柱温：30，流动相：乙腈水冰乙酸（60400?5），KQ-259B超声波清洗器。 4.字迹的提取：将81种不同产地，不同牌号的蓝色圆珠笔油墨分别在纸张上画线制样，然后用取样器取出0?2 cm长的蓝色圆珠笔油墨字迹，放入小试管中，加入10l的提取剂（乙腈水（6040），室温下提取10 min，所得提取液待分析。 5.字迹提取液的HPLC分析：将上述81种不同产地、不同牌号的蓝色圆珠笔油墨字迹的提取液在所述的条件下进行高效液相色谱分析。 （三）实验过程 通过圆珠笔油墨种类的鉴定可以达到鉴定可疑文件中涂改字迹和添加字迹的目的，同时也为进一步检验字迹的形成时间奠定了基础。 1.通过染料的分解确定字迹的相对形成时间 通过对照比较纯染料与圆珠笔油墨字迹提取液的HPLC色谱图可知：圆珠笔油墨字迹提取液色谱图中的A1，A2和A3三个色谱峰分别对应于碱性品蓝、甲基紫和结晶紫3种染料，不同牌号的圆珠笔油墨中均含有这3种三芳甲烷染料；而峰B1和B2则是染料艳蓝B及同系物的峰，峰C是一未知染料，见图1（图中纵坐标为色谱峰的峰强，单位为MAU）。圆珠笔油墨中含有的三芳甲烷类染料一般情况下每年可分解1%，即随字迹形成时间的变化而发生变化，这一特点是通过圆珠笔油墨字迹提取液中的染料变化确定字迹形成时间的理论基础。 2.三芳甲烷染料随时间分解的机理 蓝色圆珠笔油墨字迹中三芳甲烷类染料的变化机理为结晶紫的峰即A3的峰面积随时间的变化逐渐减少，纯染料结晶紫在人工老化时，这个峰的变化更为明显，这是因为它随时间在逐渐分解，分解时脱去两个甲基，变成它的同系物甲基紫和碱性品蓝；A2峰随时间的变化是先升高，达到一定值后又开始下降，这个峰对应于甲基紫，是由结晶紫脱去一个甲基后形成的，开始时它只生成，其量在升高，尚未分解，达到一定量后开始分解，脱去1个甲基变成碱性品蓝，所以量在减少；A1峰是与碱性品蓝对应，在一般存放条件下比较稳定，不分解，它是由前两者分解而来，所以其量在逐渐增加，峰面积逐渐增大。 在存放的过程中各组分的百分含量在不断发生变化，即每个峰面积所占总面积百分比要发生变化，因而可以通过各峰峰面积占总面积百分比变化与时间的关系作图，确定书写时间。 3.依据染料的变化确定字迹的相对形成时间 在对不同书写时间的圆珠笔油墨的字迹中各染料的含量进行测定时，为消除取样量、书写力度、笔画轻重等因素的影响，利用各峰的峰面积比或通过归一化处理，计算各峰面积占总面积百分比的变化来确定书写时间，即各峰的面积之和为100，各组分的含量等于各峰峰面积占总面积的百分比。 碱性品蓝、甲基紫和结晶紫的3个峰的量分别为： （四）结果与讨论 1.蓝色圆珠笔油墨字迹种类的鉴定 通过蓝色圆珠笔油墨的染料成分鉴定其种类蓝色圆珠笔油墨中的有色成分是由不同的有机染料组成的，常用于圆珠笔油墨的有机染料有结晶紫5BN、碱性艳蓝B和铜酞菁等。不同厂家生产的不同牌号的圆珠油墨中所用的染料不同，其染料的中间产物和副产物也不相同，而这些差异必然在其色谱图中通过峰数、保留时间、峰面积等反映出来，所以可以根据圆珠笔油墨有色成分的高效液相色谱分析结果进行圆珠笔油墨种类、生产厂家和牌号的分析鉴定。 HPLC法分析圆珠笔油墨中染料成分的依据蓝色圆珠笔油墨所使用的三芳甲烷类染料属于阳离子型或称碱性染料，主要品种有：甲基紫、结晶紫、碱性品蓝和碱性艳蓝等。这类染料是叔胺类化合物，结构相近。如碱性品蓝、甲基紫和结晶紫三者之间只差1个、2个甲基，其非极性部分的总表面积依次减小，保留值也依次减小，碱性艳蓝B在它的分子中含有萘环其表面积更大，保留时间更长。因此出峰顺序依次为碱性品蓝、甲基紫、结晶紫和碱性艳蓝B。这就是通过HPLC法可以将这些染料分离的基本原理。 2.离子抑制色谱体系中酸度的影响 该体系的分离是采用离子抑制色谱法。由于蓝色圆珠笔油墨所使用的三芳甲烷类染料属于阳离子型染料，在流动相体系中易发生离解生成离子，所以需要在流动相中加入酸，改变流动相体系的pH值，从而抑制染料的离解，增强其在C18色谱柱上的吸附能力，增加分离的选择性。三苯甲烷类染料中苯环上带有仲氨基或叔氨基，其pKa值一般为35之间，当加入适量的乙酸恰可使流动相的pKa值比分离组分小2个单位，可以得到满意的分离。因此流动相的三个因素中，酸的加入量是一关键因素。实验结果表明，流动相的pH值对分离度和分析时间有较大的影响，酸加入过多，色谱峰重叠且峰数减少，有色成分未得到充分分离；加入量过少，虽然峰数增多，但保留时间太长，峰形变宽。 三、总结 依据圆珠笔油墨字迹中染料成分随时间的变化规律，可以鉴别圆珠笔油墨字迹的相对形成时间是否相同，即在有比对样品时可以与样本比较字迹形成时间是否相同，也可以确定二者形成的先后顺序。 参考文献： 沙