pcr聚合酶链式反应.ppt

第一章 PCR技术原理 定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。 n PCR技术: PCR概念的提出 n1971年，美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔 医学奖得主Khorana提出“经过DNA变性，与合适 引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复 该过程便可克隆tRNA基因”。 n1983，Kary Mullis n1993年获得诺贝尔奖 引物 引物 MullisMullis的的 构思构思 DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶 特定特定DNADNA片段片段 技术难点 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合 酶 I 的Klenow片段。不耐高温。 thermus aquaticus Taq DNA聚合酶的发现 1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。 耐高温， 在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加 新酶。 大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增 长度(2.0Kb)。 酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。 在 1989 年，Science 将PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分子 (Molecule of the year) Taq DNA聚合酶优点 1 1、PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理 在微量离心管中在微量离心管中, ,加入适量的加入适量的缓冲液缓冲液, , 微量的微量的模板模板DNADNA, ,四种脱氧四种脱氧 单核苷酸单核苷酸, ,耐热性耐热性多聚酶多聚酶, , 一对合成一对合成DNADNA的的引物引物, ,通过通过高温变性、高温变性、 低温退火低温退火和和中温延伸中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程三个阶段为一个循环的反应过程, ,每一次循每一次循 环使特异区段的基因拷贝数放大一倍环使特异区段的基因拷贝数放大一倍, ,一般样品是经过一般样品是经过3030次循环次循环, , 最终最终使基因放大了数百万倍使基因放大了数百万倍; ; 扩增了特异区段的扩增了特异区段的DNADNA带。带。 PCR技术的基本原理和工作方式 模板DNA 95 2.PCR工作方式 PCR的基本原理 nPCR反应条件 nPCR过程 nPCR的特点 95 50 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 nPCR反应条件 nPCR过程 nPCR的特点 50 引物1 引物2 DNA引物 72 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 nPCR反应条件 nPCR过程 nPCR的特点 72 第1轮结束 95 第2轮开始 PCR的基本原理 nPCR反应条件 nPCR过程 nPCR的特点 955072 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 nPCR反应条件 nPCR过程 nPCR的特点 72 第2轮结束 PCR的基本原理 nPCR反应条件 nPCR过程 nPCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增 3.PCR基本材料 模板：单链或双链DNA 引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) Mg2+Mg2+： DNADNA聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂 4.PCR反应程序 9496 30-3 预变性（使模板DNA充分变性） 94 30 变性 50-60 30-1 复性（使引物与模板充分退火） 72 n(按1扩增1kb计算）延伸 72 3-7 总的延伸（使产物延伸完整） 4-10 保存 25-35 个循环 5.PCR要素解析 1）复性和延伸温度 复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60 之间。具体的温度主要由引物的 Tm 值决定 （低于Tm 值2-3 ）。 延伸温度绝大多数设定为 72 。如果复性的温度很高 ，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成 二步法 PCR 。 2）反应时间 变性一般使用 30 秒钟，如果模板的 G+C 含量较高， 或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。 复性时间有 30 秒种一般是足够的。 延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 用 1 分钟来保证充足的时间。 5.PCR要素解析 3）循环次数 循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为 2535 次。 平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期出 现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。 原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低 ，产生的焦磷酸会出现末 端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现 非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增 产物变性不彻底。 5.PCR要素解析 4）PCR 反应液的配制顺序 最后加入 DNA 聚合酶。 早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆 盖一层矿物油，防止水分蒸发。 热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异 性扩增的问题。 5.PCR要素解析 5）各种成分浓度作用：各种成分浓度作用： 缓冲液：提供合适的缓冲液：提供合适的PHPH值和值和DNADNA聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂 10mM TrisHCl 10mM TrisHCl （ pH8.3-9.0pH8.3-9.0），），1.5mM1.5mM MgCl2， 50mM K+ dNTPdNTP（底物）：等摩尔浓度的（底物）：等摩尔浓度的 4 4 种种 dNTPdNTP（即即 dATPdATP、 dTTP dTTP、dCTPdCTP和和dGTPdGTP），）， 终浓度一般为终浓度一般为 200mM200mM（即饱和浓度），（即饱和浓度）， dNTP dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。 引物：引物： 1 1M/LM/L n n 5.PCR要素解析 模板：模板：单、双链单、双链DNADNA均可。均可。 模板的数量会直接影响扩增的效果。模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过模板浓度过 高会导致反应的非特异性增加。高会导致反应的非特异性增加。 DNADNA聚合酶：聚合酶： 最常用的是最常用的是Taq DNATaq DNA聚合酶，最适反应温度聚合酶，最适反应温度7272。 Pfu DNA Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3-5 3-5 外切活性的外切活性的 PCR PCR 酶酶 ，目前为止错配率最低的高温，目前为止错配率最低的高温DNADNA聚合酶聚合酶。 酶酶量增加使反应特异性下降量增加使反应特异性下降; ;酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。 长度：至少 16bp ，通常为 18-25bp。更短的引物一般会降低扩 增的特异性，但会提高扩增的有效性 引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5 。 对于小于 20 个碱基的引物其 Tm 值可用简易公式计算，即 Tm=4（G+C）+2（A+T）。 避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的 3端）。 G+C 含量：尽量控制在 40% 至 60% 之间， 4 种碱基的分布应 尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 T 在 3 末 端的重复排列。 引物的 3 末端最好是 G 或 C ，但不要 GC 连排。 5.PCR要素解析：引物设计 6. PCR技术特点 n n 1 1）高度的灵敏性）高度的灵敏性 3030轮循环轮循环 扩增量达扩增量达2 230 30个拷贝（ 个拷贝（1010 9 9 拷贝）拷贝） PCRPCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCRPCR反应反应 结果的关键。结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特 异性；同时尽可能减少非特异性扩增。异性；同时尽可能减少非特异性扩增。 引物引物 引物引物 6. PCR技术特点 n n 1 1）特异性）特异性 3 3）操作简便易行）操作简便易行 PCRPCR扩增法扩增法, ,只需要只需要数小时数小时, ,就可以用电泳法检出就可以用电泳法检出1g1g基基 因组因组DNADNA中仅含数个拷贝的模板序列。中仅含数个拷贝的模板序列。 6. PCR技术特点 4 4 ）用途广泛）用途广泛 生命学科生命学科 医学工程医学工程 遗传工程遗传工程 疾病诊断疾病诊断 法医学法医学 考古学考古学 6. PCR技术特点 1、2Taq PCR MasterMix 2、DNA模板 3、引物： 本次实验所用材料 PCR反应体系 试剂体积（l） 2Taq PCR MasterMix12.5 P1 25uM1 P2 25uM1 DNA模板 100ng1 ddH2O to25 PCR反应程序 955min1个循环 9530sec35个循环 6030sec 7230sec 7210min1个循环 4hold 琼脂糖凝胶电泳 n琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质 的一种电泳方法。其分析原理与其他支 持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛” 和“电泳”的双重作用。 琼脂糖 n琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通 过时会受到阻力，大分子物质在涌动时 受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带 电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质 和数量，而且还取决于分子大小，这就 大大提高了分辨能力。但由于其孔径相 当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效 应微不足道，现广泛应用于核酸的研究 中 电荷效应 n琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通 过时会受到阻力，大分子物质在涌动时 受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带 电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质 和数量，而且还取决于分子大小，这就 大大提高了分辨能力。但由于其孔径相 当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效 应微不足道，现广泛应用于核酸的研究 中 分子筛效应 nDNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷 效应和分子筛效应。DNA分子在高于等 电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向 正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的 重复性质，相同数量的双链DNA几乎具 有等量的净电荷，因此它们能以同样的 速率向正极方向移动。 线状DNA片段分离的有效范围 与琼脂糖凝胶浓度关系 琼脂糖凝胶的百分 浓度（%） 线状DNA分子的有效 范围（Kb） 0.3605 0.6201 0.7100.8 0.970.5 1.260.4 1.540.2 2.030.1 实验材料 n【材料】 n1. 琼脂糖 n2. 10mg/ml EB n3. marker n4. TAE Tris242g CH3COOH57.1ml 0.5M EDTA（pH8.0 ） 100ml ddH2O to1000ml 实验步骤 n【步骤】 n1、称1.5g琼脂糖，加100ml电泳缓冲液（1TAE）加热熔化。 n2、胶液冷却至60时，加入4l EB，小心混匀，缓慢倒入制胶 模具中，在胶一端插上梳子。 n3、待胶凝固后，拨出梳子，将模具置于水平电泳槽中，加入 1TAE，让液面高于胶面至少1mm。 n4、上样。 n5、接通电泳仪电源，1-5V/cm电压（一般80100V），开始电泳 。 n6、根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳。切断电源后，取 出凝胶，使用凝胶成像仪进行观察或拍照。 琼脂糖凝胶电泳DNA回收 实验原理 离心吸附柱纯化DNA的原理就是在离心吸附柱内使用一种特 殊的硅基质滤膜，这种滤膜在低PH值、高浓度盐（盐酸胍 ，NaI, NaClO4等）存在的条件下，可以选择性吸附DNA片 段，而蛋白质和其它杂质不会被吸附。再通过一系列漂洗、 离心等步骤将残留的引物、核苷酸、蛋白质等杂质去除。最 后用低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净的DNA从滤膜上洗脱 下来。 利用硅基质膜的过滤吸附操作，大大简化了核酸纯化过程， 提供了一种快速、高通量的纯化方式。除单管离心柱外，已 经有96孔板、384孔板等核酸纯化产品。 目前，硅基质膜吸附法已经成为目前核酸分离纯化最主流的 技术。通过该技术纯化的DNA片段可直接用于的酶切、连接 、测序、标记和杂交等各种常规分子生物学操作。 试剂盒组成及储存方法 名称 用途 溶胶/结合液 DA 溶胶（红色） 结合液DD无色 与DA混合后 变为黄色 洗涤液W1洗涤液 去盐液W2洗脱盐离子（