苯并[A]芘污染土壤的植物根际修复研究初探.doc

生态环境 2007, 16(2): 425-431 ecology and environment e-mail: 基金项目：国家自然科学基金重点项目（40432005）；河南省自然科学基金项目（0511031400）；河南农业大学创新基金项目（2006-cx-018）；国家重 点基础研究发展规划项目（2002cb410810）；中国科学院知识创新项目（kzcx3-sw-429；cxtd-z2005-4） 作者简介：刘世亮（1970），男，副教授，博士，主要从事土壤污染生物修复与土壤化学研究。e-mail: ; *通讯作者 收稿日期：2006-08-24 苯并a芘污染土壤的植物根际修复研究初探 刘世亮 1, 2，骆永明2 *，丁克强2，李华2，吴龙华2 1. 河南农业大学资源与环境学院，郑州 450002；2. 中国科学院南京土壤研究所土壤和环境生物修复研究中心，南京 210008 摘要：研究了黑麦草（lolium multiflorum l.）对多环芳烃苯并a芘污染土壤的修复作用。研究结果表明，土壤中苯并a芘的可 提取态 wbap随着时间延长而逐渐减少，黑麦草加快了土壤中可提取态苯并a芘的减少，提高了苯并ap 在土壤中的降解率， 在 1、10、50 mgkg-1苯并a芘处理下，黑麦草生长土壤中苯并a芘的降解率分别达 90.3%、87.5%、78.6%；而没有黑麦草生长 土壤中苯并a芘的降解率则为 79.3%、66.4%、55.6%。黑麦草根际增加土壤中微生物碳的含量，从而提高植物对苯并a芘的 降解率。植物的地上部也可积累少量苯并a芘，但植物对苯并a芘的吸收不是黑麦草对其修复的主要机制。土壤自身具有修 复苯并a芘的潜能，种植黑麦草具有强化土壤修复苯并a芘污染的作用。 关键词：植物修复；黑麦草；多环芳烃；苯并a芘 中图分类号：x131.3 文献标识码：a 文章编号：1672-2175（2007）02-0425-07 苯并a芘(bap) 是具有 5 环结构的、世界公 认的强致癌性多环芳烃污染物1-3。因此，苯并a 芘早被美国环保局列入优先控制有毒有机污染物 的黑名单4。它常存在于石油污染物中，通过石油 开采与运输过程的泄漏、石油污染水灌溉及大气飘 尘的沉降等途径进入土壤，由于 bap 具有较高的 辛醇水分配系数和较高的蒸汽压，在自然环境中 很难降解，因此很容易在土壤等环境中积累，造成 土壤污染5。20 世纪 80 年代初期，谢重阁等6报道 我国石油污灌区土壤中 bap 的含量高达 2930 gg-1。另有研究人员7观察到清灌区土壤中的 ba p 含量10 ngg-1，而污灌后土壤 bap 含量则从 100500 ngg-1提高至 24447000 ngg-1，污染土 壤 bap 的质量分数可高出清洁土壤几十倍，甚至 几百倍。严重的 bap 污染土壤，将会给生态系统 和人体健康带来危害。近年来，对 bap 污染土壤 进行修复特别是生物修复已成为国际研究的热点 之一。但是，国内外开展的污染土壤清洁技术研究 中，对 bap 污染土壤的生物修复主要集中于微生 物降解研究8-12。另外，利用植物及其根际直接或 间接的吸收、同化或降解作用对 pahs 污染土壤的 修复研究也有一些报道13-14。研究结果表明，植物 对 pahs 的降解作用主要归功于植物根际的作用， 即一方面是由于根际作用增加了微生物降解菌的 数量，另一方面是因为植物分泌有机物为微生物共 代谢提供了基质底物15。banks 等14利用酥油草进 行了苯并a芘污染土壤的降解研究，发现根际可以 促进降解，在 6 个月后降解率可达到 50以上，同 时表明植物对土壤中 bap 归宿的明显影响。 binet16等曾利用黑麦草降解 36 环 pahs。研究表 明，黑麦草根际对降解包括 5 环和 6 环的大部分 pahs 有很大的潜力，在对加入的 pahs 进行老化 处理的土壤中尤为明显。 随着我国人民生活水平的不断提高，人们的饮 食结构逐渐从热量型食品转向营养型食品，特别是 在我国经济高速发展的长江三角洲地区，对畜产品 的需求逐年加大。因而，我国的农业结构得到了重 大调整，一个明显趋势是种植业向养殖业转变，对 牧草的需求量越来越高。经济的高速发展和农业结 构与环境管理的不合理性，区域性环境污染在加剧。 一个潜在的新的环境问题是持久性有机污染物对 土壤环境的污染。与此同时，一种利用土壤植物 系统来净化修复持久性有机污染物的植物修复技 术正在受到青睐。黑麦草是一种多年生的、可以多 次收割的草本植物。如果我们能利用需求量日益增 加的黑麦草这种牧草植物来修复 bap 等有机污染 物污染土壤，不仅能改善产地土壤环境质量，而且 可以缓解对牧草的需求量，同时还能美化产地环境 的景观生态，但是，当前对于黑麦草能否忍耐和修 复污染土壤中 bap 的问题尚未有很好的回答，对 于用来修复多环芳烃的黑麦草作为牧草的安全性 同样没有得到应有的评价。 鉴于这些问题与需求，以及当前黑麦草对土壤 中多环芳烃降解的动态过程及其生物学机理在国 426 生态环境 第 16 卷第 2 期（2007 年 3 月） 内外都还缺乏了解的事实，我们选择了代表性的、 高毒性的 5 环多环芳烃 bap 为目标物，重点研究 黑麦草对污染土壤中 bap 的吸收积累、根际动态 变化，并从土壤微生物量的角度探讨了黑麦草根际 对 bap 降解修复的机理，为多环芳烃污染土壤的 植物修复技术发展及其安全性评价提供科学依据 和技术原理。 1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 土壤 供试土壤采自中国科学院南京土壤研究所常 熟农业生态实验站内的潜育水耕人为土的表层（0- 20 cm），俗名为乌栅土，是一种长江三角洲地区太 湖流域的典型水稻土。采集的土壤经风干后过 2 mm 尼龙筛，室温下保存，其理化性质如下：有机质 36.3 gkg-1，全 n 2.25 gkg-1，全 p 0.75 gkg-1，全 k 17.4 gkg-1，游离 fe2o316.25 gkg-1，阳离子交换量 21.6 cmolkg-1，ph（h2o）7.8，并含痕量的 caco3。 土壤 wbap为 0.043 mgkg-1。 1.1.2 植物 黑麦草 (lolium multiflorum l.)。黑麦草种子由 江苏省农业科学院牧草研究所购得。 1.1.3 化学品 bap（benzoapyrene）纯度97%，美国 sigma 公司产品。 1.2 试验与分析方法 1.2.1 盆栽试验 本试验在中国科学院南京土壤研究所玻璃温 室中进行，为期 105 d。试验设计 4 种处理，其 wba p分别为 0、1、10、50 mgkg-1。由于我国目前尚没有 制定土壤中苯并a芘等多环芳烃的环境标准，而国 外学者提出土壤中苯并a芘的最大允许值为土壤 苯并a芘背景值 20 gkg-117，这是很严格的标准， 我国在这个基础上制定出土壤中 wbap超过 3 mgkg-1作为需要修复的标准（gb4284-84），因此选 择以上四个试验质量分数，可以分别表示为土壤 bap 未污染、轻度污染、中度污染、重度污染，对 于后两者是需要修复的。 先用丙酮溶解所需的 bap 量，加入到少部分 供试土壤中，待丙酮完全挥发后（12 d），将其拌入 全部供试土壤中，充分混匀，放置 1 周后装盆，每 盆装土 150 g。装盆后称质量加去离子水，使土壤含 水量为田间持水量的 60。将苗龄为 1 周的黑麦草 移入土壤中，同时设置有相同的 ba p 处理质量分 数但不种植物的对照试验。各处理均重复 3 次。在 盆栽试验期间，土壤水分维持在田间持水量的 60%。生长过程中在 15、30、45、60、75、90、105 d 时分别取样，由于黑麦草的根系在植物生长的盆钵 中相当发达，也比较密，因此将种植黑麦草的土壤 作为根际土壤，而没有种植黑麦草的土壤看成本体 土壤。前人也有类似的做法18。去除植物根后，土 壤于室温下暗处风干，过 20 目筛，待分析。 1.2.2 土壤中 bap 可提取态质量分数 参照宋玉芳等19的方法，采用超声提取，高效 液色谱仪(hplc)荧光检测器进行测定。 本研究提取和测定步骤如下：称取 5.00 g 风干 土样于玻璃离心管中，加入二氯甲烷 20 ml，超声 提取 2 h，超声时保证水温不超过 40 。取出后以 4000 rmin-1离心，吸上清液 10 ml 于茄形瓶中，在 控制水温为 40 的旋转蒸发器中旋转浓缩至干， 然后加入 2 ml 环已烷对茄形瓶中物质进行溶解。 另称 1.0 g 经 300 下处理 2 h 的干燥硅胶于小烧 杯中，加 10 ml 正已烷浸泡 15 min，然后装硅胶柱。 吸茄形瓶中环已烷溶解液 0.5 ml 进行过柱。用 11 正已烷和二氯甲烷混合液进行洗脱，首次 1 ml 洗 脱液弃去，再接 2 ml 洗脱液于刻度试管中，用高 纯氮气吹干。加 2 ml 乙腈溶解，用 class-vp5x shimadzu hplc 测定。 1.2.3 植物样品中 bap 的测定 采用超声提取，高效液相色谱仪（hplc）荧光 检测器测定。 植物样品中 bap 的提取步骤如下：取一定量 制备好的植物样品于 50 ml 的玻璃离心管中，加 入 20 ml 甲醇提取剂，于超声水浴锅中提取 15 min 后将离心管放在离心机内，以 4000 rmin-1离心， 将上清液转移到一个装有玻璃纤维棉和无水硫酸 钠漏斗中过滤，滤液于有盖的三角瓶中。再于离心 管中加入 20 ml 的甲醇，进行超声提取，重复 3 次， 合并有机相，然后进行样品浓缩和净化，其步骤与 土壤的相同。 1.2.4 土壤微生物生物量碳量测定 采用氯仿薰蒸浸提法20。 1.2.5 方法回收率试验步骤 称取 5.0 g 土壤置于 25 ml 玻璃离心管中，加 入配制好的 bap 丙酮溶液，同时进行本底空白试 验，重复 4 次。将上述样品于暗处放置，待有机溶 剂挥发至干后进行样品的提取，bap 的回收率按 宋玉芳等19的方法测定。 1.3 数据处理 本文结果为 3 次重复的平均值，数据经方差分 析，用新复极差法作多重比较。 2 结果与讨论 2.1 方法回收率结果 为了评价方法的准确度，选用了试验用土壤， 刘世亮等：苯并a芘污染土壤的植物根际修复研究初探 427 按上述方法测定土壤本底以及加入 bap 丙酮溶液 后土壤中 bap 的含量。方法回收率实验结果表明， 土壤样品 bap 的回收率为 86.90%2.92%，所以 此方法适合 bap 测定的要求。 2.2 bap 处理下黑麦草生物量的动态变化 图 1 显示 bap 污染土壤上黑麦草地上部分植 物鲜质量的动态变化。与对照比较，1、10、50 mgkg-1 三个 bap 处理的黑麦草地上部分植物鲜质量在 前 90 d 总体上都没有显著差异，但黑麦草生长时间 到 105 d 时，观察到高 wbap处理（50 mgkg-1）对黑 麦草生长的抑制作用（p0.05）。在整个试验期间三 个 bap 处理间的黑麦草地上部分植物鲜质量无显 著变化。这说明黑麦草对土壤中多环芳烃 bap 的 毒性有较强的忍耐性。通常，自然土壤和一般农地 中的 wbap低于 3 mgkg-1，因而种植黑麦草不会出 现 bap 的毒害。同时，黑麦草生长周期长，生物量 大，根系发达，为多年生植物，具有较好的景观等 特性。据此，黑麦草是一种可以用来恢复 bap 等 多环芳烃污染土壤植被景观的草本植物。 2.3 土壤中可提取 bap 浓度的动态变化 如图 2(下页)所示，随着时间延长，土壤中的可 提取 wbap逐渐减少。在 3 个 wbap处理中，可提取 量都在 45 d 内降低迅速，随后变慢。在黑麦草生长 后期，在 wbap 为 1 mgkg-1处理下的土壤中可提 取 wbap几乎没有变化，但对于 wbap为 10 mgkg-1 处理，土壤中可提取 wbap下降明显，同时在 50 mgkg-1处理中，其值也有减少趋势。这可能是因为 在较低质量分数（1 mgkg-1）下，被土壤螯合的 ba p 较稳定，不易降解，而在 wbap为 10 mgkg-1时土 壤中的微生物和植物根系没有受到 bap 的毒害， 进一步参与了对 bap 的降解作用，但在 wbap为 50 mgkg-1下，较高的 bap 毒性显示出来，抑制了 其在土壤中的生物降解。同时从图 2 可以看出，没 有种植物的非根际土壤中可提取态 bap 也有较大 幅度的减少。根际与非根际土壤中可提取态 bap 减少的可能原因有：（1）生物性减少，即土壤中植物 和微生物参与了对土壤中的 bap 的吸收或降解； （2）非生物减少，即土壤颗粒的吸附使提取剂不能 完全提取21或挥发。可提取 bap 在土壤中减少的 规律与前人的研究结果非常相似，即土壤中多环芳 烃的降解趋势为在植物生长的前期（40 d）土壤中可 提取态质量分数降解非常快，随后是一个缓慢的减 少过程15,22-23。至于减少的量是由于完全降解为其 它物质还是被土壤颗粒特别是腐殖酸所螯合锁定 而未能被提取出，还有待进一步探明。不过，从本 试验可提取 bap 随时间大幅度减少的事实表明， 土壤自身及其与黑麦草植物系统都具有较强的修 复多环芳烃污染的功能及潜力。 从图 2 还可以看出，bap 在土壤中的下降 曲线符合指数模型，不同 bap 质量分数处理下 根际与非根际土壤中的动力学过程可用以下方程 来表示： wbap为 1 mgkg-1处理下黑麦草根际土壤：y = 1.0062402e-0.225 1x，r = 0.9766； 图 1 bap 污染土壤上黑麦草地上部分植物鲜质量的动态变化 fig. 1 changes in shoot biomass of ryegrass plants grown in bap polluted soil ck: 对照处理；bap-1：指土壤中添加的 wbap为 1 mgkg-1, bap-10：指土壤中添加的 wbap为 10 mgkg-1， bap-50：指土壤中添加的 wbap为 50 mgkg-1。下同。 0 2 4 6 8 10 12 14 153045607590105 t/d 植物鲜质量/(g盆-1) ckbap-1 bap-10bap-50 428 生态环境 第 16 卷第 2 期（2007 年 3 月） bap-1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0153045607590105120 t/d w(土壤wbap)/(mgkg -1) 根际 非根际 bap-10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0153045607590105120 t/d w(土壤wbap)/(mgkg-1) 根际 非根际 bap-50 0 10 20 30 40 50 60 0153045607590105120 t/d w(土壤中wbap)/(mgkg -1) 根际 非根际 wbap为 1 mgkg-1处理下黑麦草非根际土壤：y = 0.6897e-03504x，r = 0.8671； wbap为 10 mgkg-1处理下黑麦草根际土壤：y = 9.6231e-0.175x，r = 0.9889； wbap为 10 mgkg-1处理下黑麦草非根际土壤： y = 8.6892e-0.296 5x，r = 0.9902； wbap为 50 mgkg-1处理下黑麦草根际土壤：y = 49.783e-0.121 1x，r = 0.9871； wbap为 50 mgkg-1处理下黑麦草非根际土壤： y = 38.794e-0.223 2x，r = 0.9605。 2.4 黑麦草对土壤中 bap 的修复作用 黑麦草可以显著地促进土壤中 bap 的降解 （图 2）。在试验过程中，在 3 种 wbap处理下，非根 际土壤中可提取态的 wbap始终显著地高于根际土 壤中可提取态 wbap（p0.05）。在低 wbap处理中， 除 105 d 外，其它各测定时间的根际土壤中可提取 wbap都显著地低于非根际土壤（p0.05）；在 wbap 为 10 mgkg-1处理下，整个试验期间根际和非根际 土壤中可提取态 wbap间的差异都很明显（p0.05）； 在高质量分数（50 mgkg-1）处理中，二者的差异更 加显著，但在没有植物根系的参与下，45 d 后 bap 在土壤中的自然减少非常缓慢，极显著地低于根际 土壤（p0.01）。黑麦草植物根系，可能缓解了高质 量分数 bap 对土壤微生物或酶的毒性，从而提高 了对土壤中 bap 的降解能力。总体上，在低、中、 高三种处理下 105 d 的盆栽试验内，根际土壤中 bap 降解率高于非根际土壤，三种 wbap处理在根 际土壤中的降解率（土壤中 bap 的初始可提取态 wbap减去特定时间土壤中可提取态 wbap除以土 壤中 bap 的初始提取 wbap的百分数）分别为 90.3%，87.5%，78.6%，而非根际土壤中的降解率分 别为 79.3%，66.4%，55.6%。 由表 1 可见，非根际土壤中可提取 bap 的 wbap减去根际土壤中 bap 的可提取 wbap的差值 有一动态变化的现象，这些差值反映了植物根际对 bap 的诱导强化降解作用。其降解强度随土壤中 污染物 bap 的 wbap和植物生育时期而变化。直 观上，在 0 到 45 d 之间，这种强度是逐渐增大的， 但第 45 d 以后，三种 wbap处理的这种强度都有所 降低，这一现象与丁克强等人的研究基本符合，只 图 2 不同 bap 质量分数处理土壤中可提取 wbap的动态变化 fig. 2 changes in extractable concentrations of bap in soil treated with different amounts of bap w(土壤 bap)/(mgkg-1) w(土壤 bap)/(mgkg-1) w(土壤 bap)/(mgkg-1) 刘世亮等：苯并a芘污染土壤的植物根际修复研究初探 429 不过他们的研究对象为 3 环的菲24，而本研究对象 为 5 环的 bap。黑麦草根际对不同多环芳烃的诱 导强化降解作用可能有类同的规律。 2.5 黑麦草对土壤中 bap 的直接吸收修复作用 虽然多环芳烃属于大分子有机化合物，但在土 壤植物系统中仍然可以由土壤中转移到植物根 部及地上部分25。edwards26研究了生长在营养液 中开花和结实期的矮菜豆对 14c-蒽的吸收和迁移。 结果表明，矮菜豆能够从根部吸收蒽并转移蒽及其 代谢物到其他植物组织器官。本试验黑麦草体内污 染物含量的动态变化见图 3。在第 15 d 时，50 mgkg-1 bap 处理中黑麦草地上部的污染物含量 为 1.24 mgkg-1；10 mgkg-1和 1 mgkg-1处理中黑麦 草地上部的 wbap分别为 0.48 mgkg-1，0.43 mgkg- 1。随着时间的延长黑麦草地上部的 wbap都有减少 的趋势，其原因可能有二：（1）黑麦草移栽到土壤中， 一开始对 bap 有明显的吸收作用（可能同时通过 根部和叶部吸收，遗憾的是本实验没有测定空气中 的 bap 质量浓度），但随着黑麦草生物量的增加， 对体内的 bap 起到稀释作用，所以后来体内 wba p不增反减；（2）一般植物对体内的有机污染物都有 同化作用，所以也有可能把吸收到体内的 bap 转 化为其它中间产物或同化为木质部成分26。总体来 说，在植物生长的后期体内的 bap 质量分数减少 了。这也证明，黑麦草对 bap 有直接吸收修复的 作用。 2.6 bap 污染土壤微生物碳量动态变化与植物修 复 土壤微生物生物量是指土壤中体积小于 5103 m3的生物总量，能灵敏地反映环境因子的变化， 所以可作为评价土壤质量和土壤污染程度及土壤 中微生物对污染物进行降解的重要指示之一27。由 图 4 可见，在 15 d 到 45 d 之间总体上添加 bap 处理间的土壤微生物生物量比较接近，但第 45 d 以 后，各处理间出现了明显差异，其中 10 mgkg-1 wbap 处理土壤中的微生物碳量增加最快、幅度最大，其 次是 1 mgkg-1的，50 mgkg-1处理的最小。统计分 析表明，在第 75 d 时，10 mgkg-1和 1 mgkg-1处理 中的微生物碳量明显地高于 50 mgkg-1处理 （p0.05），90 d 以后 10 mgkg-1处理的明显地高于 其它两个 bap 处理的，而 1 mgkg-1处理下的又明 显地高于 50 mgkg-1处理的。这说明低、中剂量的 bap 加入土壤后，刺激了土壤微生物大量生长，从 而加速了微生物对其本身的根际降解，而高质量分 数的剂量加入后，对微生物产生了毒害作用，抑制 了土壤微生物的生长繁殖，所以其根际降解率比较 低。 3 结论 土壤中 bap 的减少量在有黑麦草生长的情况 下明显地高于无植物生长的情况下，说明种植黑麦 草能促进土壤中 bap 的降解修复。这种促进作用 表 1 不同 bap 质量分数下非根际与根际 土壤中可提取态 wbap的差值 table 1 differences in extractable bap concentration between non-rhizosphere soil and rhizosphere soil 植物生长天数/dbap 添加 量/(mgkg-1)0153045607590105 50.260.280.150.11 1002.002.562.571.601.951.731.90 50011.30 15.0022.0518.9313.8713.4210.67 注：表中的值为非根际土壤中可提取 wbap减去根际土壤中可提 取 wbap的差值 图 3 不同 bap 处理土壤上黑麦草体内 wbap的动态变化 fig. 3 changes in bap concentration in above-ground ryegrass plants grown in soils receiving different amounts of bap 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 0153045607590105120 t /d w (植物体内bap)/(mgkg-1) bap-1 bap-10 bap-50 430 生态环境 第 16 卷第 2 期（2007 年 3 月） 与黑麦草吸收或同化 bap 有关，更与根际土壤中 微生物生物量增加及相关酶活性的增加有关。利用 植物诱导强化根际土壤修复多环芳烃等持久性有 机污染物的可能性是存在的。在农业结构调整中种 植牧草，可以发挥其修复净化土壤 bap 等多环芳 烃污染物的作用。但是，值得注意的是随着外加 bap 质量分数的增加，如超过 50 mgkg-1时，这种 植物对所试验土壤的修复效果减弱，这种弱化现象 可能与高质量分数 bap 处理后植物生长受抑制和 根际土壤微生物量及其酶活性降低有关，这就需要 筛选和应用更具耐性和修复潜力的植物。此外，由 于植物可吸收积累 bap 等多环芳烃，在利用黑麦 草等植物修复有机污染物的同时，需要科学地监测 和评价植物对 bap 等多环芳烃的吸收和积累性， 以防止多环芳烃的食物链污染及危害。 参考文献： 1 park k s, sim r c, dupont r r, et al. fate of pahs compounds in two soil types: influence of volatilization, a biotic loss and biological activityj. environmental and toxicological chemistry, 1990, 9: 187- 195. 2 albert l j, naidu r. bioremediation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons: a review of the microbial degradation of benzoapyrenej. international biodeterioration 2. soil and environment bioremediation research centre, institute of soil science, chinese academy of sciences, nanjing 210008, china abstract: benzoapyrenebap is one of kind of polycyclic aromatic hydrocarbons pahs that can cause cancer, an