[医学]微生物学教案第八章微生物遗传.doc

第八章微生物遗传第一节 遗传的物质基础遗传的物质基础是蛋白质还是核酸，曾是生物学中激烈争论的重大问题之一。1944年Avery等人以微生物为研究对象进行的实验，无可辨驳地证 实遗传的物质基础不是蛋白质而是核酸，并且随着对DNA特性(结构的多样性，自体复制特性等)的了解，“核酸是遗传物质的基础”这一生物学中的重大理论才真正得以突破。下面分别介绍以DNA和RNA为遗传物质基础的微生物学实验证据。一 DNA作为遗传物质1.Griffith的转化实验1928年英国的一位细菌学家F.Griffith将能使小鼠致死的S型菌株加热杀死，并注入小鼠体内后，小鼠不死，而且也不能从小鼠体内重新分离到肺炎球菌。但是当他们进一步将加热杀死，已无致病性的S菌和小量活的非致病的R型菌(由S型突变而来)一起注入小鼠体内后，意外地发现小鼠死了， 而且从死的小鼠中分离到活的S型菌株(注意不是S型)。显然，小鼠致死的原因正是由于这些S型菌的毒性作用，那么这些S菌从何而来呢?实验不难证明注入小鼠体内的S菌已全部被杀死，因此不可能是S的残留者，同时，也不可能是R型回复突变所致，因为来自S型的R型的回复突变应为S型而不是S型。唯一合理的解释是：活的、非致病性的R型从 已被杀死的S型中获得了遗传物质，使其产生荚膜成为致病性的S型。Griffith将这种现 象称为转化(transformation)。几年后，这一现象在离体条件下进一步得到证实，并将引起转化的遗传物质称为转化因子(transforming factor)。Griffith是第一个发现转化现象的 ，虽然当时还不知道称之为转化因子的本质是什么，但是他的工作为后来Avery等人进一步 揭示转化因子的实质，确立DNA为遗传物质奠定了重要基础。2.DNA作为遗传物质的第一个实验证据Avery和他的合作者C.M.Macleod和M.J.McCarty为了弄清楚Griffith实验中的转化因子的实质，他们分别用降解DNA、RNA或蛋白质的酶作用于有毒的S型细胞抽提物，选择性地破坏这些细胞成份，然后分别与无毒的R型细胞混合，观察转化现象的发生。结果发现，只有DNA被酶解而遭到破坏的抽提物无转化作用，说明DNA是转化所必须的转化因子，并在1944 年发表了他们的实验结果，为Griffith的转化因子是DNA而不是蛋白质提供了第一证据。为了消除“蛋白质论”者的怀疑，Avery等人将DNA抽提出来，进行不断的纯化，直到1949年，作为转化因子的DNA已纯化到所含蛋白质只有0.02%，这时的转化效果非但不减少反而增加，并随DNA浓度的增加而增加。DNA作为遗传信息的载体已充分获得证实。3.T2噬菌体的感染实验1952年，Alfred D.Hershey和Martha Chase为了证实T2噬菌体的DNA是遗传物质，他们用P32标记病毒的DNA，用S35标记病毒的蛋白质外壳。然后将这两种不同标记的 病毒分别与其宿主大肠杆菌混合。结果发现，用含有S35蛋白质的T2噬菌体感染大肠杆菌时，大多数放射活性留在宿主细胞的外边，而用含有P32DNA的T2噬菌体与宿 主细菌混合时，则发现P32DNA注入宿主细胞，并产生噬菌体后代，这些T2噬菌体后代的蛋白质外壳的组成、形状大小等特性均与留在细胞外的蛋白质外壳一模一样，说明决定蛋白质外壳的遗传信息是在DNA上，DNA携带有T2的全部遗传信息(图8-1)。 图8-1 T2噬菌体的实验二、RNA作为遗传物质有些生物只由RNA和蛋白质组成，例如某些动物和植物病毒以及某些噬菌体(见第七章)。1956年，H.FraenkelConrat用含RNA的烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus，简称TMV) 所进行的拆分与重建实验证明RNA也是遗传物质的基础。图8-2显示其实验的过程：(1)用表面活性剂处理标准TMV，得到它的蛋白质；(2)从TMV的变种HR(外壳蛋白的氨基酸组成与标准株存在2-3个氨基酸的差别)通过弱碱处理得到它的RNA；(3)通过重建获得杂种病毒；(4)标准TMV抗血清使杂种病毒失活，HR抗血清不使它失活，证实杂种病毒的蛋白质外壳是来自TMV标准株。(5)杂种病毒感染烟草产生HR所特有的病斑，说明杂种病毒的感染特性是由HR的RNA 所决定，而不是二者的融合特征；(6)从病斑中一再分离得到的子病毒的蛋白质外壳是HR蛋白质，而不是标准株的蛋白质外壳。以上实验结果说明杂种病毒的感染特征和蛋白质的特性 是由它的RNA所决定，而不是由蛋白质所决定，遗传物质是RNA。 图8-2 TMV病毒拆分重建实验三、朊病毒的发现和思考无论是DNA还是RNA作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。但朊病毒(prion)的发现对“ 蛋白质不是遗传物质”的定论也带来一些疑云。prpsc(见第七章)是具有传染性的蛋 白质致病因子，迄今未发现该蛋白内有核酸。但已知的传染性疾病的传播因子必须含有核酸 (DNA或RNA)组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。那么这是生命界的又一特例呢? 还是因为目前人们的认识和技术所限而尚未揭示的生命之谜呢? (如有人坚持认为prpsc中可能含有极微量的核酸)还有待生命科学家去认识和探索。但prpsc的致病性是由于prpc改变折叠状态所致，这一广为证实的事实，已是当今分子生物学研究的热点之一由蛋白质的折叠与生物功能之间的关系的研究延伸至与疾病的致病因子之间的关系的研究，为治疗和根除prpsc引起的疾病(有人称为构象病)开辟新的途径。 “第二遗传密码”“折叠密码”?1958年，DNA双螺旋结构模型的奠基人之一，英国科学家Crick以DNARNA蛋白质(或多肽链)的单向传递形式，首次提出遗传信息传递的中心法则。三联密码将使RNA(mRNA)中的 核苷酸序列转变成新生肽链中的氨基酸序列。现已知道，新生肽链必须经过一系列极其复杂 的加工和成熟过程，形成特定空间结构后才能成为有活性的蛋白质，这个过程包括氨基 酸残基的化学修饰和正确、适时的折叠。60年代，Anfinsen曾提出蛋白质的氨基酸 序列已经包含了它的三维结构的全部信息，或一级结构决定高级结构，但是一级结构到底如 何决定高级结构的呢?如果说三联密码，即三个碱基决定一个氨基酸是“遗传密码”，那么多肽链中氨基酸序列如何决定蛋白质的空间结构是否也存在另一套密码“折叠密码”呢 ?“折叠密码”的翻译过程又是怎样的呢?中心法则是否应表述为：DNARNA多肽链蛋白质呢?这是现代分子生物学研究中尚未解决的核心问题之一。第二节 微生物的基因组结构基因组(genome)是指存在于细胞或病毒中的所有基因。细菌在一般情况下是一套基因，即单倍体(hoploid)；真核微生物通常是有二套基因又称二倍体(diploid)。基因组通常是指全部一套基因。由于现在发现许多非编码序列具有重要的功能，因此目前基因组的含义实际上是指细胞中基因以及非基因的DNA序列组成的总称，包括编码蛋白质的结构基因、调控序列以及目前功能还尚不清楚的DNA序列。但无论是原核还是真核微生物，其基因组一 般都比较小(表8-1)，其中最小的大肠杆菌噬菌体MS2只有3000bp，含3个基因。一般来说这些依赖于宿主生活的病毒基因组都很小。近年来对微生物基因组序列的测定表明，能进行独立生活的最小基因组是一种生殖道枝原体，只含473个基因，通过与流感嗜血菌序列比较研究，提出了256个基因可能是维持细胞生命活动所必需的最低数量的假说。微生物基因组随不同类型(真细菌、古生菌、真核微生物)表现出多样性，下面分别以大肠杆菌、詹氏甲烷球菌和啤酒酵母为代表说明。表8-1 微生物与几种代表生物的基因组生物基因数基组大小(bp)MS2噬菌体(MS2 Phage)33103 噬菌体( Phage)505104T40噬菌体(T4 Phage)1502105 生殖道枝原体(Mycoplasma genitalium)4730.58106詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)*16821.66106幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)1.66106 嗜热碱甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)1.25 106 流感嗜血菌(Hacmophilus influenzae)17601.83106闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)2.18106枯草杆菌(Bacillus subtilis)37004.2106大肠杆菌(Escherichia coli)41004.7106黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)80009.4106啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)580013.5106脉孢菌属(Neurospora)500060106果蝇(Drosophila melanogaster)12000165106Mus musculus(一种脊索动物)700003300106Nicotiana tobacum(一种烟草)430004500106拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)160003300070-145106人(human)50000-10000030109 *表示古生菌一、大肠杆菌的基因组大肠杆菌基因组为双链环状的DNA分子*，在细 胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中，该小体称为拟核(nucliod)， 其上结合有类组蛋白蛋白质和少量RNA分子，使其压缩成一种手脚架形的(scaffold)致密结 构(大肠杆菌DNA分子长度是其菌体长度的1000倍，所以必须以一定的形式压缩进细胞中) 。大肠杆菌及其它原核细胞就是以这种拟核形式在细胞中执行着诸如复制、重组、转录、 翻译以及复杂的调节过程。基因组全序列测定于1997年由Wisconsin大学的Blattner等人完成，其基因组结构特点如下：1.遗传信息的连续性从表8-1可以看出，大肠杆菌和其它原核生物中基因数基本接近由它 的基因组大小所估计的基因数(通常以1000bp1500bp为一个基因计，说明这些微生物基因 组DNA 绝大部分用来编码蛋白质、RNA；用作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别 和结合的位点等信号序列。除在个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的rRNA和tR NA中发现有内含子或间插序列外，其它绝大部分原核生物不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。 2.功能相关的结构基因组成操纵子结构大肠杆菌总共有2584个操纵子，基因组测序推测出2192个操纵子。其中73%只含一个基因，16.6%含有2个基因，4.6%含有3个基因，6%含有4个或4个以上的基因。大肠杆菌有如此多的操纵子结构，可能与原核基因表达多采用转录调控有关，因为组成操纵子有其方便的一面。此外有些功能相关的RNA基因也串联在一起，如构成核糖核蛋白体的三种RNA基因转录在同一个转录产物中，它们依次是16SrRNA23SrRNA5SrRNA。这三种RNA除了组建核糖体外，别无他用，而在核糖体中的比例又是111，倘若它们不在同一个转录产物中，则或者造成 这三种RNA比例失调，影响细胞功能；或者造成浪费；或者需要一个极其复杂、耗费巨大的调节机构来保持正常的111。3.结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝在大多数情况下结构基因在基因组中是单拷贝的，但是编码rRNA的基因rrn往往是多拷贝的，大肠杆菌有7个rRNA操纵子，其特征都与基因组的复制方向有关，即按复制方向表达。7个rrn操纵子中就有6个分布在大肠杆菌DNA的双向复制起点oric(83分钟处)附近，而不是在复制终点(33分钟)附近，可以设想，在一个细胞周期中，复制起点处的基因的表达量几乎相当于处于复制终点的同样基因 的两倍，有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时，细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。大肠杆菌及其它原核生物(如枯草杆菌的rrn有10个拷贝)rrn多拷贝及结构基因的单拷贝，也反映了它们基因组经济而有效的结构。 4.基因组的重复序列少而短原核生物基因组存在一定数量的重复序列，但比真核生物少得多，而且重复的序列比较短，一般为440个碱基，重复的程度有的是十多次，有的可达上千次*。 *典型的原核生物染色体是环状DNA分子，但发现布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的染色体是线状的。*流感嗜血菌基因组上有1465个“摄取位点”的重复，其重复序列为5-AAGTGCGGTCA-3。二、啤酒酵母的基因组啤酒酵母是单细胞真核生物，1996年，由欧洲、美国、加拿大和日本共96个实验室的633位科学家的艰苦努力完成了全基因组的测序工作，这是第一个完成测序的真核生物基因组。该基因大小为13.5106bp，分布在16个不连续的染色体中(表8-2)。象所有其它的真核细胞 一样，酵母菌的DNA也是与四种主要的组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)结合构成染色质(chromatin)的14bp核小体核心DNA；染色体DNA上有着丝粒(centromere)和端粒(telomere)，没有明显的操纵子结构，有间隔区或内含子序列。酵母菌基因组最显著的特点是高度重复， 从表8-2可看出tRNA基因在每个染色体上至少是4个，多则30多个，总共约有250个拷贝(大肠 杆菌约60个拷贝)。rRNA基因只位于号染色体的近端粒处，每个长9137bp，有100200个拷贝。酵母基因组全序列测定完成后，在其基因组上还发现了许多较高同源性的DNA重复序 列，并称之为遗传丰余(genetic redundancy)。酵母基因组的高度重复或遗传丰余是一种浪费和多余呢?还是一种进化的策略呢?显然应该是后者，所有现存的生物在自然的不断选择下 ，总是以合适的结构特征来完成其生命过程。也许是在份数这么多的丰余基因中，如果有少数基因突变而失去功能的话，可不影响生命的生存；也许是为了适应复杂多变的环境，多余的基因可使生物体能够在不同的环境中分别使用多个功能相同或者相似的基因产物，做到有备无患。因此从这个意义上讲酵母确实比细菌和病毒“进步”且“富有”，而细菌和病毒( 许多病毒基因组上的基因是重叠的)似乎更“聪明”，知道如何尽量经济和有效地利用其有限的遗传资源。表8-2 啤酒酵母的染色体染色体长度(kbp)基因数tRNA基因数2301064813423133151721015328142757729213270136101091573335632911143923110 74538724666334161078550229244872178442115109257120 94849917 注：号染色体长度只包括了二个拷贝rDNA，实际上有100-200个，长1-2106bp。三、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的基因组詹氏甲烷球菌属于古生菌，该菌发现于1982年。生活在2600m深，260个大气压，94的海底火山口附近。1996年由美国基因组研究所(The Institute for Genomic Research，简称TIG R)和其它5个单位共40人联合完成了该菌的基因组全测序工作。这是完成的第一个古生菌和自养型生物的基因组序列。根据对该菌全基因组序列分析结果完全证实了1977年由Woese等人提出的三界学说。因此有人称之为“里程碑”的研究成果。从目前已知的詹氏甲烷球菌和其它古生菌的基因组全序列分析结果来看，几乎有一半的基因通过同源搜索在现有的基因数据库中找不到同源序列。例如詹氏甲烷球菌只有40%左右的基因与其它二界生物有同源性，其中有的类似于真细菌，有的则类似于真核生物，有的就是二者融合。可以说古生菌是真细菌和真核生物特征的一种奇异的结合体。一般而言，古生菌的基因组在结构上类似于细菌。例如：詹氏甲烷球菌有一个大小为1.66106bp的环形染色体DNA，具有1682个编码蛋白质ORF；功能相关的基因组成操纵子结构，共转录成一个多顺反子转录子；有2个rRNA操纵子；有37个tRNA基因，基本上无内含子；无核膜等。但是负责信息传递功能的基因(复制、转录和翻译)则类似于真核生物，特别是古生菌的转录起始系统基本上与真核生物一样，而与细菌的截然不同。古生菌的RNA聚合酶在亚基组成和亚基序列上类同于真核生物的RNA聚合酶和，而不同于真细菌的RNA聚合酶。与之相应的是启动子结构也类同于真核生物，TATAbox序列都位于转录起始点上游25-30核苷酸处，这与细菌启动子的典型结构(-10和-35)相悖。古生菌的翻译延伸因子EF-Ia(细菌中是EF-Tu)和EF-2(细菌中是EF-G)，氨酰tRNA合成酶基因，复制起始因子等均与真核生物相似。此外，古生菌还有5个 组蛋白基因，其产物组蛋白的存在可能暗示：虽然甲烷球菌基因图谱看上去酷似细菌，但基因组本身在细胞内可能实际上是按典型的真核生物样式组织成真正的染色体结构。同时具有细菌和真核生物基因组结构特征的古生菌对研究生命的起源和进化无疑是十分重要的，而许多古生菌特有的基因(目前还未搜索到与其它二界生物同源的基因)也正吸引着越来 越多的科学家去研究和探索，这些特有的基因也许为许多新奇的蛋白质编码，这将为开发新的药物，生物活性物质或在工业中实施新的技术开拓广阔的前景。微生物向邻居“借”或“盗用”基因*微生物通过接合、转导和转化进行的水平方向的基因转移是早已知道的事实。但近年来的研究表明，微生物似乎还善长向邻居“借”或“盗用”(appropriate)基因。这些邻居包括它们的“同类”微生物，也包括它们的“异类”高等动植物。基因组序列分析表明，生活在意大利海底火山口附近的激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)含有来自近邻但亲缘关系较远的Thermococcus litotralis的转运麦芽糖的基因，序列分析表明二者仅有138bp的差异，而生活在太平洋的同种激烈热球菌却没有这种基因。激烈热球菌的转运麦芽糖基因看来是向T.litoaralis“借来”的，是否会“还”回去，目前难以得知。此外，微生物还有向高等动、植物“盗用”(appropriate)基因的本领。例如，耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)含有几个只有在植物中才有的基因；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的基因组上至少含有8个来自人的基因，而且这些基因编码的蛋白质能帮助细菌逃避宿主的防御系统，显然，这是结核分枝杆菌通过某种方式从宿主那儿“盗用”了这些基因为自己的生存服务。有关“借”或“盗用”的机制目前还不很清楚，但转座因子的普遍存在及其转座功能可能起了很大的作用。* Penis i E. 1999, Science, 5418:13051306三、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的基因组詹氏甲烷球菌属于古生菌，该菌发现于1982年。生活在2600m深，260个大气压，94的海底火山口附近。1996年由美国基因组研究所(The Institute for Genomic Research，简称TIG R)和其它5个单位共40人联合完成了该菌的基因组全测序工作。这是完成的第一个古生菌和自养型生物的基因组序列。根据对该菌全基因组序列分析结果完全证实了1977年由Woese等 人提出的三界学说。因此有人称之为“里程碑”的研究成果。从目前已知的詹氏甲烷球菌和其它古生菌的基因组全序列分析结果来看，几乎有一半的基因 通过同源搜索在现有的基因数据库中找不到同源序列。例如詹氏甲烷球菌只有40%左右的基因与其它二界生物有同源性，其中有的类似于真细菌，有的则类似于真核生物，有的就是二者融合。可以说古生菌是真细菌和真核生物特征的一种奇异的结合体。一般而言，古生菌的基 因组在结构上类似于细菌。例如：詹氏甲烷球菌有一个大小为1.66106bp的环形染色体DNA，具有1682个编码蛋白质ORF；功能相关的基因组成操纵子结构，共转录成一个多顺反子转录子；有2个rRNA操纵子；有37个tRNA基因，基本上无内含子；无核膜等。但是负责信息传递功能的基因(复制、转录和翻译)则类似于真核生物，特别是古生菌的转录起始系统基本上与真核生物一样，而与细菌的截然不同。古生菌的RNA聚合酶在亚基组成和亚基序列上类同于真核生物的RNA聚合酶和，而不同于真细菌的RNA聚合酶。与之相应的是启动子结构也类同于真核生物，TATA box序列都位于转录起始点上游25-30核苷酸处，这与细菌启动子的典型结构(-10和-35)相悖。古生菌的翻译延伸因子EF-Ia(细菌中是EF-Tu)和EF-2(细菌中是 EFG)，氨酰tRNA合成酶基因，复制起始因子等均与真核生物相似。此外，古生菌还有5个组蛋白基因，其产物组蛋白的存在可能暗示：虽然甲烷球菌基因图谱看上去酷似细菌，但基 -因组本身在细胞内可能实际上是按典型的真核生物样式组织成真正的染色体结构。同时具有细菌和真核生物基因组结构特征的古生菌对研究生命的起源和进化无疑是十分重要的，而许多古生菌特有的基因(目前还未搜索到与其它二界生物同源的基因)也正吸引着越来 越多的科学家去研究和探索，这些特有的基因也许为许多新奇的蛋白质编码，这将为开发新的药物，生物活性物质或在工业中实施新的技术开拓广阔的前景。第三节 质粒和转座因子质粒(plasmid)和转座因子(transposable element)都是细胞中除染色体以外的另外二类遗传因子。前者是一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中；后者是位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中。目前对细菌中的质粒和转座因子已研究得比较详细，本节将以细菌为例介绍这两种遗传因子。一、质粒的分子结构质粒通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中(图8-3)，但从细胞中分离的质粒大多是三种构型，即CCC型、OC型(open circular form)和L型(linear form)(图8-4)。近年来在疏螺旋体、链霉菌和酵母菌中也发现了线型双链DNA质粒和RNA质粒。质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb。图8-3 电子显微镜下观察到的完整的细菌染色体和质粒(箭头所指处为质粒)图8-4 质粒的三种构型根据质粒的分子大小和结构特征，通过超离心或琼脂糖凝胶电泳可将质粒与染色体DNA分开，从而分离得到质粒。这是因为虽然染色体DNA也是以超螺旋结构存在于细胞中，但其分子大小远远超过质粒(例如：大肠杆菌染色体是4100kb，而ColE1质粒只有9kb)，因此在分离过程中染色体DNA总是会断裂成线状，其两端可以自由转动而使分子内的紧张态完成松弛。而小分子的质粒绝大多数是CCC或OC结构，共价闭环的质粒DNA分子无自由末端，分子是紧密的缠结状态，因此在含溴化乙锭(Ethidium bromide，简称EB，可与DNA和RNA分子结合，使其在紫外光照射下显现荧光，便于观察或分离)的氯化铯梯度中，松弛的染色体DNA结合的EB分子比质粒多，其密度也比质粒小，经高速密度梯度离心后，就可将二者分开，从而可分离得到质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳则是根据分子量大小和电泳呈现的带型将染色体DNA与质粒分开。前者也是因随机断裂成线状，且分子量大，所以泳动速度慢，带型也不整齐；而后者分子量小，大小均一，泳动速度快，带型整齐，很容易将二者区分并进而达到分离质粒DNA。二、质粒的主要类型染色体DNA作为细胞中的主要遗传因子，携带有在所有生长条件下所必需的基因，这些基因有时称之为“持家基因”(housekeeping gene)，而质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的，只是在某些特殊条件下，质粒能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。例如抗药性质粒和降解性质粒能使宿主细胞在具有相应药物或化学毒物的环境中生存，而且在细胞分裂时恒定的传递给子代细胞。根据质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应，可将其分为各种不同的类型： 1.致育因子(Fertility factor，F因子)又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象(接合作用)有关的质粒。携带F质粒的菌株称为F+菌株(相当 于雄性)，无F质粒的菌株称为F-菌株(相当于雌性)。F质粒整合到宿主细胞染色体上的菌株称之为高频重组菌株(high frequence recombination, 简称Hfr)。由于F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。 F质粒在大肠杆菌的接合作用(conjugation)中起主要作用。当Hfr菌株上的F因子通过重组回复成自主状态时，有时可将其相邻的染色体基因一起切割下来，而成为携带某一染色体基因的F因子，例如F-lac、F-gal、F-pro等。因此将这些携带不同基因的F因子统称为F，带有这些F因子的菌株也常用F表示。 2.抗性因子(Resistance factor，R因子) 这是另一类普遍而重要的质粒，主要包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。带有抗药性因子的细菌有时对于几种抗生素或其他药物呈现抗性。例如R1质粒(94kb)可使宿主对下列五种药物具有抗性：氯霉素(Chlorampenicol, Cm)、链霉素(Streptomycin, Sm)、磺胺(Sulfonamide, Su)、氨苄青霉素(Ampicillin, Ap)和卡那霉素(Kanamycin, Km)，并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于R1抗性质粒上。许多R质粒能使宿主细胞对许多金属离子呈现抗性，包括碲(Te6+)、砷(As3+) 、汞(Hg2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)、银(Ag+)、镉(Cd2+)等。 在肠道细菌中发现的R质粒，约有25%是抗汞离子的，而铜绿假单胞菌中约占75%。 3.Col质粒因这类质粒首先发现于大肠杆菌中而得名，该质粒含有编码大肠菌素的基因，大肠菌素是一种细菌蛋白，只杀死近缘且不含Col质粒的菌株，而宿主不受其产生的细菌素的影响。由G+细菌产生的细菌素通常也是由质粒基因编码，有些甚至有商业价值，例如一种乳酸细菌产生的细菌素NisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用于食品工业的保藏。4.毒性质粒(virulence plasmid)现在越来越多的证据表明，许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，例如产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。有些使昆虫 致病乃至死亡的细菌毒素也是由质粒编码的，苏云金杆菌产生的毒素是这种类型的典型例子 。研究表明，苏云金杆菌含有编码内毒素(伴孢晶体中)的质粒，伴孢晶体的结构基因及调节基因位于质粒上。此外，目前广泛应用于转基因植物载体的是一种经过人工改造后的Ti质粒(tumor-inducing-plasmid)(见第十章)，Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子，其宿主是一种根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。是引起植物冠瘿瘤的致病因子，其机制是Ti质粒上的一段特殊DNA片段转移至植物细胞内并整合其染色体上，导致细胞无控制的瘤状增生，合成正常植物所没有的冠瘿碱(opines)化合物，该DNA片段称为T-DNA其上含有三个致癌基因。 发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)引起许多双子叶植物患毛根瘤，而致病因子是该菌所含的Ri质粒。Ri质粒在功能上与Ti质粒有广泛的同源性，也有一段特殊的DNA片段(T-DNA)，在侵染过程中，能转移进植物基因组，也可用于转基因植物载体。 5.代谢质粒(Metabolic plasmid) 这类质粒上携带有能降解某些基质的酶的基因，含有这类质粒的细菌，特别是假单胞菌，能将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式。尤其是对一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、农药(2,4-dichlorophenox yacetic acid)、辛烷和樟脑等的降解，在环境保护方面具有重要的意义(见第十一章)。因此这类质粒也常被称为降解质粒，每一种具体的质粒常以其降解的底物而命名。如樟脑质粒 (camphor, CAM)、辛烷质粒(octadecane, OCT)、二甲苯质粒(xylene, XYL)等。此外，代谢质粒中还包括一些能编码固氮功能的质粒。例如根瘤菌中与结瘤(nod)和固氮(fix)有关的所有基因均位于共生质粒中。放线菌中也已发现许多大的线型质粒(500kb以上) 含有抗生素合成的基因。6.隐秘质粒(cryptic plasmid)以上所讨论的质粒类型均具有某种可检测的遗传表型，但隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。他们存在的生物学意义，目前几乎不了解。酵母的2m质粒不授予宿主任何表型效应，也属于隐秘型质粒。除了根据质粒赋予宿主的遗传表型将质粒分成不同类型外，还可根据质粒的拷贝数、宿主范围等将质粒分成不同类型。例如：有些质粒在每个宿主细胞中可以有10-100个拷贝，称为高拷贝数(high copy number)质粒，另一些质粒在每个细胞中只有1-4个拷贝，为低拷贝数(Low copy number)质粒。前者又称松弛型质粒(relaxed plasmid)，后者又称严谨型质粒(stringent plasmid)。此外，还有一些质粒的复制起始点(origin of replication)较特异，只能在一种特定的宿主细胞中复制，称为窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid)；复制起始点不太特异，可以在许多种细菌中复制，称为广宿主范围质粒(broad host range plasmid)。能整合进染色体而随染色体的复制而进行复制的质粒又称附加体(episome)。 三、质粒的不亲和性细菌通常含有一种或多种稳定遗传的质粒，这些质粒可认为是彼此亲和的(compatible)。但是如果将一种类型的质粒通过接合或其它方式(如转化)导入某一合适的但已含一种质粒的宿主细胞，只经少数几代后，大多数子细胞只含有其中一种质粒，那么这二种质粒便是不亲和的(incompatible)，它们不能共存于同一细胞中。质粒的这种特性称为不亲和性(incompatibility)。根据某些质粒在同一细菌中能否并存的情况，可将质粒分成许多不亲和群(incompatibility group)，能在同一细菌中并存的质粒属于不同的不亲和群，而在同一细菌中不 能并存的质粒属于同一不亲和群。这是因为质粒的不亲和性现象主要与复制和分配有关，所以不能在同一细胞共存的质粒是因为它们共享一个或多个共同的复制因子或相同的分配系统 ，因此它们便属于同一不亲和群。只有那些具有不同的复制因子或不同分配系统的质粒才能共存于同一细胞中，所以它们必然属于不同的不亲和群。因此到目前为止，可以说这是一种接近质粒本质的一种分类方法，目前已在大肠杆菌中发现了30多种不同的不亲和群。当二种同一不亲和群的质粒共处同一细胞时，其中一种由于不能复制因而在细胞的不断分裂过程中被稀释掉(diluted out)，或被消除(curing)。所谓消除是指细胞中由于质粒的复制受到抑制而染色体的复制并未明显受到影响，细胞可继续分裂的情况下发生的质粒丢失。质粒消除可自发产生，也可通过人工处理提高消除率，例如，用一定浓度的吖啶橙染料(acrid ine dyes)或其它能干扰质粒复制而对染色体复制影响较小的理化因子处理细胞，可消除质粒。四、转座因子的类型和分子结构转座因子是细胞中能改变自身位置(例如从染色体或质粒的一个位点转到另一个位点，或者在二个复制子之间转移)的一段DNA序列。广泛存在于原核和真核细胞中（表8-3），由美国遗传学家Barbara MeClintock首先在玉米中发现，并荣获1983年度诺贝尔奖。原核生物中的转座因子有三种类型：插入顺序（insertion sequence, IS）、转座子（transposon, Tn）和某些特殊病毒（如Mu、D108）。IS和Tn有二个重要的共同特征：它们都携带有编码转座酶（trans posase）的基因，该酶是转移位置，即转座（transposition）所必需的；另一共同特征是它们的二端都有反向末端重复序列（inverted terminal repeat, ITR），该序列的长度为40bp（主要是IS）到1000bp以上（某些Tn）。图8-5显示IS2和Tn5的遗传图谱。表8-3原核和真核生物中的转座因子原核生物真核生物 插入顺序：IS酵母：sigma转座子：Tn酵母：TY 病毒：Mu果蝇：copia,P玉米：Ac逆转录病毒：劳氏 肉瘤、人免疫缺陷病毒(HIV) IS是最简单的转座因子，分子大小范围在2501600bp左右，只含有编码转座所必须的转座酶的基因。它们分布在细菌的染色体、质粒以及某些噬菌体DNA上。转座子(Tn)比IS分子大，与IS的主要差别是Tn携带有授予宿主某些遗传特性的基因，主要是抗生素和某些毒物(如汞离子)抗性基因，也有其它基因，如：Tn951携带有负责乳糖发酵的基因。根据转座子二端结构的组成可将其分为二种类型。第一种类型是转座子二端为顺向或反向重复的IS，药物抗性基因位于中间，IS提供转座功能，连同抗性基因一起转座，Tn5(图8-5)是这一类型的代表，称为复合转座子(compound transposon)或类型转座子。这一类型的转座子实际上是IS因子的延伸。第二种类型的转座子的两端为短的反向重复序列 (IR)，其长度一般为30-50bp，在二个IR之间是编码转座功能和药物抗性的基因(或其它基因 )，这类转座子称为类型或称复杂转座子(complex transposon)，Tn3(图8-6)是这一类型的典型代表。图8-5 转座因子IS2和Tn5的遗传图谱图8-6Tn3的遗传结构Mu噬菌体是一种以大肠杆菌为宿主的温和噬菌体，以裂解生长和溶源生长两种方式交替繁衍自己。其基因组上除含有为噬菌体生长繁殖所必需的基因外，还有为转座所必需的基因， 因此它也是最大的转座因子，全长约39kb，图8-7显示Mu噬菌体的遗传图谱。从图谱中可看出Mu基因组的实际长度只有37.2kb，因为该DNA分子的两端并不是像IS和Tn那样的反向重复序列，而是宿主DNA序列。左端的宿主DNA约为50-150bp，右端是1-2kb，这也是Mu噬菌体不同于其它噬菌体的独特之处。两端的宿主DNA是由于进入裂解循环的MuDNA进行外壳装配时，是从随机插入的Mu基因组C端及其相邻的50-150bp的宿主DNA开始一直到与S端相邻接的1-2kb的 宿主DNA为止，也就是C端50-150bp的宿主DNA加37.2kb的Mu基因组和1-2kb的S端宿主DNA被包装进外壳蛋白，而且由于Mu插入的位点不同，所以几乎每一个噬菌体颗粒结合着不同的宿主 DNA序列。 图8-7 Mu噬菌体的遗传图谱五、转座的遗传学效应转座因子的转座可引发多种遗传学效应。这些效应不仅在生物进化上有重要的意义，而且已成为遗传学研究中的一种重要的工具。这些遗传变化主要包括：(1)插入突变 当各种IS、Tn等转座因子插入到某一基因中后，此基因的功能丧失，发生突变。如果插入位于某操纵子的前半部分，就可能造成极性突变，导致该操纵子后半部分结构基因表达失活。如果插入的是带有抗性(或其它)基因的转座子，则可获得带有新的基因标记的插入突变。(2)产生染色体畸变由于复制性转座是转座子一个拷贝的转座，处在同一染色体上不同位置的二个拷贝之间可能发生同源重组，这种重组过程可导致DNA的缺失或倒位，即染色体畸变。(3)基因的移动和重排由于转座作用可能使一些原来在染色体上相距甚远的基因组合到一起，构建成一个操纵子或表达单元，也可能产生一些具有新的生物学功能的基因和新的蛋白质分子，具有生物进化上的重要意义。 第四节 基因突变及修复一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，包括一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换，而导致的遗传变化称为基因突变(gene mutation)，其发生变化的范围很小，所以又称点突变(point mutati on)或狭义的突变。广义的突变又称染色体畸变(chromosomal aberration)，包括大段染色体的缺失、重复、倒位。基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。也是我们用来获得优良菌株的重要途径之一。DNA损伤的修复和基因突变有着密切的关系，当DNA的某一位置的结构发生改变(称为前突)时，并不意味着一定会产生突变，因为细胞内存在一系列的修复系统 ，能清除或纠正不正常的DNA分子结构和损伤，从而阻止突变的发生，因此前突可以通过DNA复制而成为真正的突变，也可以重新变为原来的结构，这取决于修复作用和其它多种因素。本节将对基因突变、修复及二者的相关性进行讨论。 一、基因突变的类型及其分离1.碱基变化与遗传信息的改变 不同的碱基变化对遗传信息的改变是不同的，可分为四种类型(图8-8)。 图8-8 遗传信息的改变与突变类型(1)同义突变(same-sense mutation) 这是指某个碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的密码子变化，显然，这是与密码子的简并性相关的。 (2)错义突变(mis-sense mutation) 是指碱基序列的改变引起了产物氨基酸的改变。有些错义突变严重影响到蛋白质活性甚至使之完全无活性，从而影响了表型。如果该基因是必需基因，则该突变为致死突变(lethal mutation)。(3)无义突变(nonsense mutation) 是指某个碱基的改变，使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子(UAA，UAG，UGA)。蛋白质的合成提前终止，产生截短的蛋白质。 (4)移码突变(frameshift mutation) 由于DNA序列中发生1-2个核苷酸的缺失式插入，使翻译的阅读框发生改变，从而导致从改变位置以后的氨基序列的完全变化。2.表型变化 表型(phenotype)和基因型(genotype)是遗传学中常用的二个概念，前者是指可观察或可检测到的个体性状或特征，是特定的基因型在一定环境条件下的表现；后者是指贮存在遗传物质中的信息，也就是它的DNA碱基顺序。上述四种类型的突变，除了同义突变外，其它三种类型都可能导致表型的变化。下面主要介绍几种常用的表型变化的突变型及其分离。 (1)营养缺陷型(auxotroph)一种缺乏合成其生存所必须的营养物的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物(precursor)才能生长。它的基因型常用所需营养物 的前三个英文小写斜体字母表示，例如hisC、lacZ分别代表组氨酸缺陷型和乳糖发酵缺陷型，其中的大写字母C和Z则表示同一表型中不同基因的突变。相应的表型则用HisC和LacZ(第一个字母大写)表示。在容易引起误解的情况下，则用hisA-和hisA+，lacZ-和lacZ+分别表示缺陷型和野生型(Wildtype gene,没有发生突变的基因)。营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段，由于这类突变型在选 择培养基( 或基本培养基)上不生长，所以是一种负选择标记，需采用影印平板(Replica plating)的方法进行分离，步骤如下：将待分离突变株的原始菌株以合适的稀释度涂布到野生型菌株和突变株均能生长的主平板(含完全培养基)上，经培养后形成单菌落(图8-9a)；通过一消毒的“印章”(直径略小于培养皿底，表面包有丝绒布，使其尽量平整，图8-9b)将A平板的菌落分别原位转移(或印迹)到C平板(含有与A平板相同的营养成份)和D平板(不含缺陷型所 需的营养因子，即基本培养基)；经培养后对照观察c和d平板上形成的单菌落，如果在c平板上长而在d平板上不长的，则为所需分离的突变型；在c平板上挑取d平板上不长的相应位置的单菌落，并进一步在完全培养基上划线分离纯化。图8-9 印影法分离营养缺陷型(2)抗药性突变型(resistant mutant) 由于基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性的一种突变，普遍存在于各类细菌中，也是用来筛选重组子和进行其它遗传学研究的重要正选择标记(见第十章)。这类突变类型常用所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示，如：strr和strs分别表示对链霉素的抗性和敏感性(sensitivity)。在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。 (3)条件致死突变型(conditional lethal mutant)是指在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因。因为这类基因一旦发生突变是致死的(例如为DNA复制所必需的基因)，因而也就不可能得到这些基因的突变。常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts(temperaturesensitive)表示，这类突变在高温下(如42)是致死的，但可以在低温(如25-30)下得到这种突变。筛选ts 突变型的方法也是采用影印平板法，所不同的是图8-9中的三个平板上培养基相同，均可生长。只是将C和D平板分别置低温(30)和高温(42)下培养，然后在C平板上挑取相应于D平板上未生长的菌落。(4)形态突变型(morphological mutant)是指造成形态改变的突变型，包括影响细胞和菌落形态、颜色以及影响噬菌