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测序质量判断和测序常见问题 DNA测序原理 目前用于测序的技术主要有Sanger等（ 1977）发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解 法。 Sanger 法测序的原理 Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来 延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一 种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四 个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧 核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的 双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延 伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择 性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相 应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相 对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千 碱基的链终止产物。 它们具有共同的 起始点，但终止 在不同的的核苷 酸上，可通过高 分辨率变性凝胶 电泳分离大小不 同的片段，凝胶 处理后可用X-光 胶片放射自显影 或非同位素标记 进行检测。 自动化测序 首先，通过对ddNTP进行不同的荧光标记 实现在一个泳道实现四种碱基判读。 后来，各公司有改进了电泳方法，将毛细 管电泳技术引入了测序仪，大大提高了分 辨率。（排除了横向扩散和泳道间的干扰 ） 影响测序结果的因素 测测序反应应反应组分模版 引物 其他标准试剂 污染组分 反应条件体积 退火温度 退火时间 产物纯化样品纯度（空气，盐离子，染 料，乙醇） 电电泳分离上样量 电泳条件 检测检测荧光激发和接受的灵敏度 常见问题 反应整体差，杂峰很多，序列完全比不上 序列能比上，但很多地方有“突变”，有“插 入”，有“缺失” 测序长度太短了 常见问题的原因 反应整体差，杂峰很多，序列完全比不上 根本没反应，引物和模版不匹配 序列能比上，但很多地方有“突变”，有“插 入”，有“缺失”，测序长度太短了 有反应，但质量差 分析一下原因可帮助大家却认测序结果， 确定是否需要重新测序。 分析时应从大到小，从整体入手 整体比 对 反应整体形状具体位置原因 有强平均峰宽，峰形 向前拖引物降解 向后拖样品降解 头大脚小反应前部较好但很短，看峰形是个 “大头娃娃” 引物过多 信号突然衰减或消失Poly结构 互补结 构 个别位置问 题 70-80，100-120有C或T峰染料峰 200,400有G峰乙醇峰 50bp之前信号杂乱，有高峰引物二聚体 个别碱基不匹配前后反应信号良好突变 反应过 程中突然有高峰位置不定气泡 弱模版量 引物引发效率 无有反应信 号 多模版 多结合位点 反
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