jak2基因突变对于骨髓增殖性肿瘤的分类,诊断和治疗的意义.ppt

JAK2基因突变对于骨髓增 殖性肿瘤的分类、诊断和治 疗的意义 中山大学附属第三医院血液科 徐妍 硕士研究生 1、MPD：是一系或多系分化相对成熟的骨髓细 胞不断的克隆性增殖所致的一组肿瘤性疾病的统称 。 2、MPD包含慢性粒细胞白血病（CML），真性 红细胞增多症（PV），原发性血小板增多症（ET ），和原发性骨髓纤维化（PMF）,慢性中性粒细 胞白血病（CNL），慢性嗜酸细胞白血病/高嗜酸 细胞综合症（CEL/HES）等多种疾病。 一、骨髓增殖性疾病（MPD） MPD的病因和发病机制尚未完全 明确。2005年发表在Nature上的一篇 文章首次报道了JAK2突变发生于多种 MPD，在他们的研究中，约80的PV 患者存在JAK2基因突变，导致基因编 码产物第617位氨基酸由缬氨酸突变 为苯丙氨酸。 二、MPD发病机制 这一变化导致JAK激酶相关的特异性的受体 酪氨酸磷酸化活性持续增强，使红细胞对细胞 因子如EPO的反应增强，持续激活JAK-STAT信 号途径，从而发生PV，这一机制在小鼠模型中 得到证实。 同样地，JAK2 V617F也存在于其他 MPD中1 。 这个基因突变的发现无疑对MPD的 分类、诊断和治疗产生了深远的影响。 1 James C, Ugo V, Le Coudic JP, et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera. Nature, 2005,434:1144-1148. 三、JAK-STAT信号途径 细胞因子与其相应受体结合后，引起细胞 质受体构象的改变，进而激活与受体相关 联的JAK激酶，JAK激酶能够使特异性受体 的酪氨酸残基磷酸化，进而促使相应的 STAT因子磷酸化，从而激活STAT因子。最 后，激活的STAT蛋白从受体上游离形成二 聚体，进入细胞核内与GAS（gamma activated site）增强子家族成员相结合，诱 导靶基因表达。 JAKJAK StatStat Stat Stat StatStat 胞浆 胞核 胞浆 示意图：JAK-STAT信号途径 能够激活JAK2激酶的受体包括：EPO-R,TPO- R,GM-CSF-R,IL-3R,gp130受体家族等。 研究组组 PVET骨纤纤其他对对照组组 Jones AV 2 58 /72 (81%) 24 /59 (41%) 15 /35 (43%) 30/ 152(20 %) 0/160（0 ） Vainchenk er W 3 80% 3025-750% Nelson ME 4 74% (n = 506) 36% (n = 339) 7% (n = 556) Fei HR 5 42 / 57(73.7%) 40/ 68 (58.8%) 8/12(66. 7%) Lucia E 6 90.2% 72.1 %63.2 % 50%_ 2 Jones AV, Kreil S, Zoi K, et al.Widespread occurrence of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders Blood. 2005;106(6):2162-8. 3 Vainchenker W, Constantinescu SN.A Unique Activating Mutation in JAK2 (V617F) Is at the Origin of Polycythemia Vera and Allows a New Classification of Myeloproliferative Diseases.Hematology. 2005:195- 200. 4 Nelson ME, Steensma DP. JAK2 V617F in myeloid disorders: what do we know now, and where are we headed? Leuk Lymphoma. 2006 Feb;47(2):177-94. 5 Fei HR, Zhang R, Chen SN, et al.The clinical implication of JAK2 mutation expression in patients with myeloproliferative disorders. Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2007 Apr;46(4):271-3. 6 Lucia E, Martino B, Mammi C, et al.The incidence of JAK2 V617F mutation in bcr/abl-negative chronic myeloproliferative disorders: assessment by two different detection methods. Leuk Lymphoma. 2008 Oct;49(10):1907-15. 参考文献： 在修订的2008 WHO分类系统中，有无JAK2突变 成为MPD主要的诊断指标7 。 （1）如果JAK2突变阳性，血红蛋白增加，骨髓红 系细胞明显增生可以诊断PV，即使血红蛋白低于以 往WHO规定的指标值，但却持续超过正常值 20g/L 的PV也可以确诊。 （2）如果JAK2突变阳性，血小板仅仅持续大于 450X109/L,骨髓巨核细胞增生，可以诊断ET。 四、 2008 WHO分类系统 7 Tefferi A and Vardiman JW.Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms. Leukemia 2008, 22, 1422 原WHO关于PV诊断标准如下： A1：红细胞比积增高比正常平均值25或血 红蛋白男性185g/L、女性165g/L； A2：无引起继发性红细胞增多原因如无家庭性 红细胞增多症，无低氧血症（动脉P0292）、无 高氧亲和力血红蛋白，无截短的促红素（Epo）受体 和无肿瘤分泌EPO所致EPO升高； A3：脾大； A4：骨髓细胞无Phbcrabl，但可有其他克 隆性遗传学异常； A5：体外培养有内源性红系集落形成； B1：血小板增多40010g/L； B2：白细胞1210g/L； B3：骨髓活检示全髓系增生以红系 和巨核系增生明显； B4：血清EPO减低； 具有A1+A2+任何A项或Al+A2+B项 中任何2项均可诊为PV. (3)不仅MPD的诊断发生革命性进展，连 名称都改变了。MPD改称为骨髓增殖性肿 瘤(myelo- proliferative neoplasm，MPN) ，MDS/MPD(myelodysplastic /myeloproliferative disorder)称为 MDS/MPN。新分类的MPN 中还包含了肥 大细胞病（MCD）。 (4)以前的慢性嗜酸细胞白血病/高嗜酸细胞 综合症（CEL/HES）分别重新划分为CEL， HES和有PDGFRA, PDGFRB或者FGFR1基因 异常的嗜酸细胞增高症3种MPN，并强调这 类疾病的本质是肿瘤. 现已明确，MPN具有共同的干细胞起源的克 隆型遗传特征，临床出现不同表型是突变影 响的蛋白、酪氨酸激酶及相关分子的不同构 型和异常的信号转导所造成的。 1、MPN诊断标准的依据:多数患者都具 有JAK2突变，主要是JAK2 V617F, 还有 JAK2外显子12突变。由于JAK2 V617F是髓系细胞特异性的，在PV以 外其他原因造成的红细胞增多症并不出 现，因此是PV的一个敏感的诊断标记 。 五、JAK2突变对于MPN的诊断意义 2、但是，髓系肿瘤中JAK2 V617F并非 PV独有， 还可见于50%的ET或PMF。 但其他髓系肿瘤JAK2 V617F发生频率很 低，淋巴系肿瘤不出现。仅检测JAK2 V617F 突变虽然不能单独用来区分不同 类别的MPN，但是结合骨髓活检的组织 学依据，可以诊断ET和PMF，排除反应 性的血小板增多和骨髓纤维化。 3、JAK2 突变在PV诊断中意义最大，而诊 断ET或PMF时则可能未发现JAK2 V617F， 原因除了大约一半患者的确无突变外，还 因为目前的检测方法并没有标准化。 4、应用直接测序、位点特异性PCR和荧光 定量PCR检测JAK17F基因突变的方法会出 现一些差异。不同方法的检测灵敏度不同 ，突变检出率可能不同。通常直接测序检 测的灵敏度约20-25%，位点特异性PCR方 法约1-3%，荧光定量PCR方法约0.5-5% 7 9 。 参考文献： 7 Murugesan G, Aboudola S, Szpurka H, et al. Identification of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders using FRET probes and melting curve analysis. Am J Clin Pathol, 2006, 125:625-633. 8 Vannucchi AM, Pancrazzi A, Bogani C, et al. A quantitative assay for JAK2(V617F) mutation in myeloproliferative disorders by ARMS-PCR and capillary electrophoresis. Leukemia, 2006, 20:1055-1060. 9 McClure R, Mai M, Lasho T. Validation of two clinically useful assays for evaluation of JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders. Leukemia, 2006,20:168-171. 5、突变类型：携带纯合型还是杂合型等 位基因以及突变细胞的比例都与临床症 状有关，对MPD并发症的发生率及预后 都有重要意义； PV患者较ET或IMF患者 更多携带纯合型突变细胞10、11 。 10 Ross L. Levine, Claude Belisle, et al. X-inactivationbased clonality analysis and quantitative JAK2V617F assessment reveal a strong association between clonality and JAK2V617F in PV but not ET/MMM, and identifies a subset of JAK2V617F-negative ET and MMM patients with clonal hematopoiesis. Blood, 2006,107:4139-4141. 11 Linda M. Scott, Mike A. Scott,et al. Progenitors homozygous for the V617F mutation occur in most patients with polycythemia vera, but not essential thrombocythemia. Blood, 2006, 108:2435-2437. 6、突变量：临床工作对患者杂合型/纯 合型突变克隆的携带情况，突变比例的 定量检测也越来越重视。转染JAK2 V617F突变基因的小鼠模型可出现类似 PV的表型，突变基因表达量进一步增高 时可以进展为骨髓纤维化，而在突变基 因低表达的小鼠模型中可以观察到一过 性的血小板增多12 。 MPD疾病过程中临床症状和JAK2 V617F 突变携带比例的变化很可能与杂合型突 变向纯合型突变的基因转变有关13 。 12 Lacout C, Pisani DF, Tulliez M,et al. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis. Blood, 2006, 108:1652-1660. 13 Campbell PJ, Scott LM, Buck G, et al. Definition of subtypes of essential thrombocythaemia and relation to polycythaemia vera based on JAK2 V617F mutation status: a prospective study. Lancet, 2005, 366:1945-1953. 7、JAK2基因突变的发现也导致其他临床 诊断指标的变化。PV患者血红蛋白增加 或者血细胞容积增加是诊断重要的指标， 但并非总是和体内红细胞总量真正增加（ 红细胞增多症）相一致。PV有时候可以 表现为红细胞压积正常，是因为血浆也相 应增加了。 既然如此，那么在经典MPN(PV, ET 和 PMF)血红蛋白和血细胞容积也不一定有 明显区别。过去PV专业协作组（PVSG） 建议在诊断PV时使用红细胞总量 (RCM) 来克服上述缺点，2001年的WHO标准开 始强调要做骨髓活检来帮助诊断。 （1）PV：既然几乎所有PV患者有JAK2 突变，外周血JAK2V617F检测是当前PV 患者首选的检查。与此同时，应当检测 血清Epo水平，真正的PV同时出现JAK2 V617F阴性和Epo水平正常或增加的可 能性非常小，血清Epo水平（减低）检 测能够发现极少见的JAK2 V617F阴性的 PV。 另一方面，也应该考虑检测JAK2 V617F阴性，血清EPO水平正常或者 低下患者的JAK2外显子12突变和骨 髓活检。骨髓细胞学变化也是ET， PMF和JAK2突变阴性的PV必须的诊 断标准之一。 （2） ET、PMF：因为JAK2 V617F 见于50% 的ET或PMF，诊断血小板 增多和骨髓纤维化患者时应考虑 JAK2突变。突变出现可以排除反应 性骨髓增殖，然而没有检出突变并 不能排除MPN的可能性。诊断ET和 PMF时通常也需要骨髓检查。 同样，ET或PMF类似CML时，尤其是 在未发现JAK2 V617F时，在骨髓检查 之初就要考虑细胞遗传学检查。如果 没有发现Ph染色体，但是骨髓有小巨 核细胞时，应考虑做FISH检测BCR- ABL基因。 WHO诊断标准(见下页) 阳性指标 1.持续性BPC600109L 2.骨髓活检以巨核细胞系增多为特征，巨核细胞体 积较大，多为成熟型 阴性指标 1.无PV证据：骨髓铁染色正常，红细胞数正常或 Hb185 g/L(男)或165 g/L(女)2.无CML证据：无Ph 染色体，无bcr-abl融合基因 3.无慢性IMF证据：无胶原纤维，无或极少网状纤 维 4.无MDS证据：无del(5q)，t(3；3)(q21；q26)或 inv(3)(q21q26)等染色体异常，无明显的粒细胞增生 异常，无或极少有小巨核细胞 5.无以下原因引起的反应性血小板增多：炎症、免 疫、肿瘤或先前已切脾3ET的治疗 （3）不典型MPN：诊断不典型MPN (CNL, HES, CEL-NOC,MCD 和不能分 类的MPN)时，通常要求BCR-ABL阴性 , 有红系造血异常，粒细胞发育异常 ，或者单核细胞发育异常（ 1x109/L）。 （4） CNL：如果外周血白细胞 25x109/L 伴随80%分叶核中性 粒细胞或带状中性粒细胞，不成熟 粒细胞10%和原始粒细胞1%（ 骨髓中5%原始细胞）时，考虑 CNL。 （5）不能分类的MPN：如果发现骨髓 形态学异常的肥大细胞聚集，怀疑MCD 的时候，应当考虑类胰蛋白酶染色检查 骨髓，做流式细胞仪分析寻找形态异常 的肥大细胞 (CD25阳性), 如果有可能最 好进行KIT D816V突变检测。当临床表 型和经典的或者其他非经典的MPN的诊 断标准不符时候，可考虑不能分类的 MPN。 （6）CEL-NOC、HES：CEL-NOC包含伴 有嗜酸细胞增多的PDGFRA,PDGFRB 和 FGFR1重排的髓系肿瘤。诊断两者都需 要外周血嗜酸细胞计数1.5x109/L，排 除继发性嗜酸细胞增多，排除其他急慢 性髓系肿瘤，并且没有表型异常和/或克 隆性T淋巴细胞。诊断HES需要没有细胞 遗传学异常，外周血原始细胞2%或骨 髓原始细胞5%两个条件。 基因检测在疾病诊断中愈来愈重要，从1960 年在CML中发现了Ph染色体时开始， 除Ph染色 体的特征性BCR-ABL基因，陆续在PV, ET和PMF 中发现JAK2 V617F，PV中JAK2外显子12突变； 在ET或PMF中发现的PLW515L/K，在伴有嗜酸 细胞增多症的髓系恶性肿瘤中发现的PDGFRA, PDGFRB 或 FGFR1基因重排，在MCD中发现的 KITD816V和其他KIT突变，在幼年型粒单细胞 白血病（JMML）中的发现RAS通路突变（包括 RAS, PTPN11 或者NF1）。 这些与髓系恶性肿瘤发病相关的基因的 发现，最终将导致一些新分类和诊断方 式。例如，检测 FIP1L1- PDGFRA突变( 用FISH 或者 RT-PCR)，PDGFRB-重排( 用染色体核型或 FISH)，或者FGFR1易 位 (用染色体核型)都是目前原发性嗜酸 细胞增多症分类及选择治疗方案的必要 检查。 既然JAK2突变广泛存在于MPN，那么 ，抑制JAK2基因来治疗MPN的药物也 就具有相当的应用前景，如抑制JAK2 基因表达的药物TG101209, Go6976, erlotinib都有应用于临床治疗的可能 。 六、JAK2突变对于MPN的治疗意义 1、TG101209 2007年Pardanani A 等人研制出一种口服的生 物小分子TG101209，能抑制JAK2 激酶(IC(50)=6 nM), 而对于其他的激酶如JAK3 抑制作用较弱 (IC(50)=169 nM)。它能够抑制表达JAK2V617F 突 变的Ba/F3细胞（小鼠原B细胞株）的生长。在人类 表达JAK2V617F 突变的急性髓系白血病细胞株中， TG101209能够促进细胞凋亡，抑制JAK2V617F、 STAT5 和 STAT3的磷酸化。这就预示着它可能治疗 MPN，且其治疗作用在裸鼠模型中得到证实。 2、Go6976 2006年Grandage VL 等人证实 G6976在体外实验中能直接抑制 JAK2. G6976还能抑制表达MPN相关的JAK2 V617F突变的细胞以及表达白血病相关 的TEL-JAK2融合蛋白的细胞的增殖。在 所有的原代AML细胞中，它能抑制STAT 的激活。 3、 erlotinib 体外实验证实erlotinib在微摩尔浓度时就 能有效抑制PV造血祖细胞的生长，而对正常的 造血细胞是没有作用的，另外，取自PV患者体 内的JAK2(V617F)阳性细胞对erlotinib更为敏感 。同样的抑制作用在JAK2(V617F)阳性的人红 白血病HEL细胞株中也得到证实，这就提示 erlotinib或许能够用于治疗存在JAK2(V617F)突 变的PV或其他的MPN。 参考文献： 14、Pardanani A, Hood J, Lasho T, et al. TG101209, a small molecule JAK2-selective kinase inhibitor potently inhibits myeloproliferative disorder-associated JAK2V617F and MPLW515L/K mutations.Leukemia. 2007 Aug;21(8):1658-68. 15、Grandage VL, Everington T, Linch DC, et al. G6976 is a potent inhibitor of the JAK 2 and FLT3 tyrosine kinases with significant activity in primary acute myeloid leukaemia cells.Br J Haematol. 2006 Nov;135(3):303-16. 16、Li Z, Xu M, Xing S, et al. Erlotinib effectively inhibits JAK2V617F activity and polycythemia vera cell growth. J Biol Chem. 2007 Feb 9;282(6):3428-32. B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w- z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5cOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x- A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x- A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x- A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w- A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w- A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0G8JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w- z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTls&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w- z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x- A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq