《转录续加工》PPT课件.ppt

第七节 转录后加工 转录产生的RNA称为原始转录产物或原 初转录本，通常要经过进一步加工才能成为 有功能的各种RNA。 * * 1 1 mRNA的加工 n n 原核生物转录后加工原核生物转录后加工 S S 在原核生物中，在原核生物中，mRNAmRNA的的寿命非常短寿命非常短，大多数半，大多数半 衰期只有几分钟。衰期只有几分钟。 S S 原核生物的原核生物的mRNAmRNA不需要进一步加工不需要进一步加工处理就可以作处理就可以作 为翻译的模板。为翻译的模板。 S S 在最近的研究中发现，原核生物的在最近的研究中发现，原核生物的RNARNA转录后也转录后也 有在有在33端加端加polyApolyA的现象。尽管人们对这种现象还缺的现象。尽管人们对这种现象还缺 乏了解，但它必定有其存在的意义。乏了解，但它必定有其存在的意义。 DateDate 2 2 S 原核生物的rRNA和tRNA比较稳定，半衰期为几 个小时。 rRNArRNA的后加工的后加工 S S 原核生物中有三种原核生物中有三种rRNArRNA（5S5S，16S16S，23S23S），其），其 基因基因rDNArDNA与与tRNAtRNA的基因的基因tDNAtDNA混合排列混合排列在一个操纵在一个操纵 子（子（rrnrrn）中。大肠杆菌细胞中有）中。大肠杆菌细胞中有7 7个个rrnrrn操纵子。操纵子。 S S RNARNA酶酶负责负责rrnrrn操纵子转录产物的后加工。操纵子转录产物的后加工。 S S RNARNA酶酶作用后，产物需要进一步转变才能成为作用后，产物需要进一步转变才能成为 成熟的分子，其作用机制尚不十分清楚。成熟的分子，其作用机制尚不十分清楚。 原核生物的rRNA有哪几种？ DateDate 3 3 DateDate 4 4 DateDate 5 5 S tDNA初始转录产物有时包含几个同种tRNA ，有时包含几个不同种tRNA，而有些tRNA与 rRNA转录在一起。 tRNAtRNA的后加工的后加工 DateDate 6 6 型tRNA基因含有CCA序列，在CCA序列下游仍有一 段序列，需要在酶的作用下切除。 S S tRNAtRNA的基因有两种类型：的基因有两种类型： 原核生物原核生物的的tRNAtRNA基因基因多为多为型型，少数噬菌体为，少数噬菌体为型型 。 型型tRNAtRNA基因基因没有没有CCACCA序列序列，需要在酶的作用下添，需要在酶的作用下添 加该序列。加该序列。 DateDate 7 7 RNA酶：负责切开间隔序列。 S S 一系列酶参与一系列酶参与tRNAtRNA的后加工过程：的后加工过程： tRNAtRNA核苷酸核苷酸转移酶转移酶（tRNAtRNA nucleotidylnucleotidyl transferasetransferase) )： 以以ATPATP和和CTPCTP为前体，催化为前体，催化tRNAtRNA的的33末端生成末端生成CCACCA。在。在 大肠杆菌中，该酶常用于对大肠杆菌中，该酶常用于对CCACCA末端降解的修复作用。末端降解的修复作用。 RNARNA酶酶D D：是一种核酸：是一种核酸外切酶外切酶，能逐个切除，能逐个切除tRNAtRNA 3 3端端 多余的核苷酸，使多余的核苷酸，使CCACCA暴露。暴露。 RNARNA酶酶P P：是一种：是一种内切酶内切酶，能使，能使tRNAtRNA产生成熟的产生成熟的55末末 端。端。 DateDate 8 8 (RNA(RNA酶酶) ) RNARNA酶酶P P RNARNA酶酶D D tRNAtRNA核苷酸转移酶核苷酸转移酶 DateDate 9 9 ( (RNaseRNase) ) DateDate1010 n 真核生物的转录后加工 S 真核生物的rRNA有4种，即5.8S、18S、28S 和5S rRNA。 rRNArRNA的转录后加工的转录后加工 5.8S5.8S、18S18S、28S28S的基因组成一个的基因组成一个转录单位转录单位，转录，转录 单位呈单位呈串联重复排列串联重复排列，由，由RNARNA聚合酶聚合酶负责转录。负责转录。 每个转录单位转录产生每个转录单位转录产生47S47S前体，包含三种前体，包含三种rRNArRNA。 进一步经过进一步经过剪切和碱基修饰剪切和碱基修饰后产生后产生3 3种成熟的种成熟的rRNArRNA 。 5S 5S rRNArRNA的基因的基因成簇排列成簇排列，由，由RNARNA聚合酶聚合酶单独转单独转 录。录。 真核生物rRNA有哪几类？ 真核生物rRNA由哪种RNA聚合 酶负责转录？ 剪切和碱基修饰过程需要一组剪切和碱基修饰过程需要一组snoRNAsnoRNA参与。参与。 5S rRNA由哪种酶负责转录？ DateDate1111 DateDate1212 DateDate1313 S 加工过程中，首先切除3端额外的核苷酸， 在 tRNA核苷酸转移酶作用下，在3端添加CCA序列 ，产生成熟的3末端。 tRNAtRNA加工加工 S S 真核生物真核生物tRNAtRNA基因不含基因不含33端端CCACCA序列，前序列，前tRNAtRNA 带有一个带有一个16nt 516nt 5端前导区，一个端前导区，一个1414 60nt60nt的内含子的内含子 ，二个额外的，二个额外的33端核苷酸。端核苷酸。 S S 酿酒酵母酿酒酵母tRNAtRNA有有272272条，其中条，其中5959为断裂基因，为断裂基因， 每条只含有一个内含子。其他真核生物类似。每条只含有一个内含子。其他真核生物类似。 什么是断裂基因？ S 随后切除内含子，并将两个半个的tRNA分子 连接在一起。 DateDate1414 DateDate1515 核酸内切酶使用测量机制确定切割点，在内含子 两端切割，产生一个线性内含子和两个tRNA半分 子。 两个半分子tRNA具有独特的末端： 5端为-OH， 3端为环状磷酸基团。 S tRNA内含子切除、外显子连接机制： tRNAtRNA剪接经历剪接经历连续的切割和连接反应连续的切割和连接反应。 DateDate1616 DateDate1717 3端环状磷酸基团在环化磷酸二酯酶作用下打 开，产生2-磷酸基团和3-OH。 5端在多核苷酸激酶作用下磷酸化，产生5-磷 酸基团。 两个tRNA半分子在腺苷酸合成酶作用下连接成 完整的tRNA分子。 磷酸二酯酶、多核苷酸激酶、腺苷酸合成酶分 布于同一个蛋白质的不同功能区。 连接点处的2-磷酸基团在磷酸酶作用下去除。 DateDate1818 DateDate1919 S 一般情况下，外显子较短（100-200bp），内含 子较长（1kb）。 什么是断裂基因？ S 从mRNA前提中去除内含子，外显子连接成成熟 mRNA的过程称为RNA的剪接（RNA splicing）。 mRNAmRNA加工加工 S S RNARNA剪接过程发生在细胞核内，与剪接过程发生在细胞核内，与55端加帽、端加帽、33端端 加加polyApolyA尾等其他一些修饰同时进行。成熟的尾等其他一些修饰同时进行。成熟的mRNAmRNA 进入细胞质进行翻译。进入细胞质进行翻译。 S 几乎在所有生物中都发现有断裂基因。在低等真 核生物中较少，在高等真核生物中大量存在。 DateDate2020 DateDate2121 S S hnRNPhnRNP 真核生物真核生物RNARNA聚合酶聚合酶转录产物大小差异很大，表转录产物大小差异很大，表 现出不均一性，该转录群体统称为核内不均一现出不均一性，该转录群体统称为核内不均一RNARNA 。其中主要是前。其中主要是前mRNAmRNA（pre-mRNApre-mRNA）。）。 hnRNAhnRNA合成后很快被蛋白质包裹形成合成后很快被蛋白质包裹形成hnRNPhnRNP。 hnRNPhnRNP有助于保持有助于保持hnRNAhnRNA的单链状态，并辅助各的单链状态，并辅助各 种种RNARNA加工反应。加工反应。 什么是hnRNA？ DateDate2222 DateDate2323 S S 55端加帽端加帽 RNARNA链长度超过链长度超过20-30nt20-30nt之前，其之前，其55端经过化学修端经过化学修 饰被加上一个饰被加上一个7-7-甲基鸟苷甲基鸟苷残基，这种修饰称为帽子残基，这种修饰称为帽子 结构。催化这一反应的酶是结构。催化这一反应的酶是mRNAmRNA鸟苷转移酶。鸟苷转移酶。 帽子结构中，帽子结构中，GMPGMP通过通过5-55-5三磷酸桥与三磷酸桥与RNARNA链链相连相连 。 帽子的功能还不十分清楚，但一定具有重要功能，帽子的功能还不十分清楚，但一定具有重要功能， 可能为：可能为： 增加增加mRNAmRNA的稳定性；的稳定性； 作为核糖体识别作为核糖体识别mRNAmRNA的信号。的信号。 DateDate2424 根据甲基化程度，帽子结构分为三种类型：根据甲基化程度，帽子结构分为三种类型： cap0cap0：只有：只有55端端7-7-甲基鸟苷甲基鸟苷。所有所有真核生物中都存真核生物中都存 在。在。 cap1cap1：除：除55端端7-7-甲基鸟苷甲基鸟苷外，还有外，还有第二位第二位碱基的核碱基的核 糖糖2-O2-O位甲基化位甲基化。除单细胞真核生物外，。除单细胞真核生物外，cap1cap1是一是一 种种多数形式多数形式。高等真核生物中偶有第二位碱基高等真核生物中偶有第二位碱基2-O2-O甲基化甲基化 后，再次发生后，再次发生N N 6 6 位甲基化位甲基化，而且要求，而且要求第二位第二位碱基是碱基是腺嘌呤腺嘌呤。 cap2cap2：在：在cap1cap1基础上，基础上，第三位第三位碱基发生核糖碱基发生核糖2-O2-O 甲基化甲基化。cap2cap2只占所有加帽只占所有加帽mRNAmRNA的的10-15%10-15%。 DateDate2525 DateDate2626 是否还曾记得？ CTD在RNA加工过程中可能是一个关键点 ： l5端加帽酶（鸟苷酸转移酶）结合在CTD上 l与剪接相关的蛋白质也结合在CTD上 l3端聚腺苷酸化装置也结合在CTD上 DateDate2727 polyA是由polyA聚合酶（polyA polymerase，PAP ）催化合成，而非由DNA编码。 S S 33端剪切及加尾端剪切及加尾 多数真核生物多数真核生物mRNAmRNA的的33末端具有约为末端具有约为200nt200nt长的长的 polyApolyA尾。组蛋白尾。组蛋白mRNAmRNA不具有该特征。不具有该特征。 RNA聚合酶没有专一性的终止子序列，转录进 行到3端相应位点（聚腺苷酸化位点）后，RNA中 的序列成为核酸内切酶切割和随后的多聚腺苷酸化 的靶标。 DateDate2828 DateDate2929 聚腺苷酸化位点聚腺苷酸化位点（polyadenylationpolyadenylation site) site)由三部由三部 分组成：分组成： 聚腺苷酸化信号聚腺苷酸化信号( (polyadenylationpolyadenylation signal) signal)，即：，即： polyApolyA添加位点上游添加位点上游10-6010-60个碱基处的保守序列个碱基处的保守序列 55AAUAAAAAUAAA33； 切点处的切点处的5-5-YAYA-3-3； 切点下游富含切点下游富含GUGU的序列的序列5-5-GUGUGUGGUGUGUG-3-3。 DateDate3030 DateDate3131 单一加工复合体同时负责切割和多聚腺苷酸化。 切割因子切割因子CFCF和和CFCF构成内切酶活性区域构成内切酶活性区域 专一性因子专一性因子CPSFCPSF识别识别AAUAAAAAUAAA序列，并指导其他活性序列，并指导其他活性 的发生的发生 一种一种刺激因子刺激因子CstFCstF结合到富含结合到富含GUGU区区 PAPPAP进行进行A A残基的逐个添加。约添加残基的逐个添加。约添加200200个个A A后，复合后，复合 物解体。物解体。 PABPPABP结合在结合在polyApolyA上，增加上，增加mRNAmRNA稳定性。稳定性。 DateDate3232 DateDate3333 在胚胎发育过程中，非poly（A）化的mRNA作 为一种贮存形式，在poly（A）化后开始翻译。 polypoly（A A）的功能：）的功能： 有助于稳定有助于稳定mRNAmRNA分子，因此，与分子，因此，与mRNAmRNA的寿命的寿命相相 关。但关。但polypoly（A A）的长度与）的长度与mRNAmRNA寿命没有相关性。寿命没有相关性。 mRNAmRNA的的polypoly（A A）化）化有利于翻译有利于翻译，为核糖体提供，为核糖体提供 识别识别mRNAmRNA的信号，其具体机制尚不清楚。的信号，其具体机制尚不清楚。 DateDate3434 mRNA的polyA在分子生物学操作技术中有很 大应用价值： mRNAmRNA分离：利用分离：利用oligooligo（dTdT）与载体相连，可以）与载体相连，可以 从总从总RNARNA中纯化中纯化mRNAmRNA。 cDNAcDNA合成：利用合成：利用oligooligo（dTdT）作为引物，可以反）作为引物，可以反 转录合成转录合成cDNAcDNA。 DateDate3535 DateDate3636 S S RNARNA的剪接的剪接 回顾几个基本概念： 断裂基因断裂基因（interrupted geneinterrupted gene）：真核生物的基因含有内含子）：真核生物的基因含有内含子 ，称为断裂基因。，称为断裂基因。 内含子内含子（intronintron） ：真核生物的基因序列中某些序列不出现在：真核生物的基因序列中某些序列不出现在 成熟的成熟的mRNAmRNA中，这些序列称为内含子。中，这些序列称为内含子。 外显子外显子（exonexon） ：被内含子隔开的出现在成熟：被内含子隔开的出现在成熟mRNAmRNA中的序中的序 列称为外显子。列称为外显子。 RNARNA剪接剪接（RNA splicingRNA splicing） ：一个基因的外显子和内含子共：一个基因的外显子和内含子共 同转录在一条转录产物中，然后内含子被切除，外显子被连接同转录在一条转录产物中，然后内含子被切除，外显子被连接 起来形成成熟的起来形成成熟的RNARNA，这一过程称为，这一过程称为RNARNA的剪接。的剪接。 DateDate3737 DateDate3838 剪接位点 剪接位点（splicing site）：指内含子与外显子交界 处的序列。内含子上游的剪接点称为5剪接点或左剪接 点或供体位点（donor site），下游方向的剪接点称为 3剪接点或右剪接点或受体位点（acceptor site）。 GU-AG规则：内含子两端剪接位点的识别是根据起 始点为双核苷酸GU，结束位点为AG来确定的，剪接 位点的这种特征常常称为GU-AG规则。 GU-AG规则在真核生物核基因mRNA剪接中具有普 遍适用性。 核基因mRNA剪接所需要的序列特征 DateDate3939 DateDate4040 高等真核生物分支位点没有高度保守性，但在每一位 点都有嘧啶或嘌呤的偏好。 分支位点（branch site） 分支位点在分支位点在33端剪接点的识别中起重要作用。端剪接点的识别中起重要作用。 酵母分支位点是高度保守的，共有序列酵母分支位点是高度保守的，共有序列UACUAACUACUAAC。 3端附近有一个富含嘧啶的区域 DateDate4141 DateDate4242 剪接过程 第一次转酯（transesterification）反应：分支 点序列中A残基上的2羟基攻击内含子5端剪接点处 G之前的磷酸二酯键，发生第一次转酯反应，形成 一个称为索套的带尾的环状结构，释放出外显子1。 第二次转酯反应第二次转酯反应：外显子：外显子1 1的的33羟基羟基攻击内含子剪攻击内含子剪 接点接点3AG3AG之后的磷酸二酯键，发生第二次转酯反之后的磷酸二酯键，发生第二次转酯反 应，两个外显子连接在一起。应，两个外显子连接在一起。 内含子内含子以索套形式以索套形式释放释放，最终被降解。，最终被降解。 DateDate4343 DateDate4444 反式剪接 S一般情况下，只有同一条RNA分子上的不同外 显子通过剪接连接在一起，称为顺式剪接（cis splicing）。 S在少数特殊情况下，两个RNA分子的内含子中 存在互补序列时可能发生反式剪接（trans splicing ），即不同RNA分子的外显子连接在一起。锥虫 、秀丽线虫中存在反式剪接。 DateDate4545 DateDate4646 可变剪接：特定内含子保留成为外显子（内含子保留 ）；或特定的外显子被剪切，在成熟的mRNA中不保留 该外显子（外显子跳读） 。 mRNAmRNA的可变加工的可变加工 在许多