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课题进展汇报 STR非变性HPLC快速诊断 唐氏综合征方法的建立及评价 Rapid prenatal diagnosis of Down Syndrome by non- denaturing high-performance liquid chromatography with short tandem repeat markers 概述 唐氏综合征(Down syndrome，DS) ，又称21三体综合 征或先天愚型，是人类最常见的染色体数目异常导致的 遗传性疾病，是先天智力低下的最常见原因。新生儿发 病率约1/800-1/ 600。 DS的遗传分型： （1）21三体型(游离型游离型) )：47,XX(XY),+21，占92.5% （2）易位型： 46,XX(XY),-14,+t(14q21q)46,XX(XY),-14,+t(14q21q)，占4.8% （3）嵌合型： 46,XX(XY) / 47,XX(XY),+2146,XX(XY) / 47,XX(XY),+21，占2.7% （4）双重三体，较罕见 （5）21部分三体 v新生儿的DS发生率约为12，我国目前大约有60 万以上的DS患儿。 v该病目前缺乏有效的治疗手段，预防DS患儿出生是防 治该病的主要措施。 v因此，建立一种快速、准确、低成本、高通量、自动 化程度高的唐氏综合征产前诊断方法对于优生优育具有 重要意义。 研究背景 国内外相关产前诊断方法现状： v超声波筛查：通过超声波检查胎儿颈部半透明组织厚度、 股骨长度与肱骨长度、心脏异常情况、胎儿鼻骨发育情况、 孕早期胎儿静脉导管血流检测等以达到诊断目的。该方法阳 性率低，假阳性率高，易漏诊误诊。 v孕早、中期母体血清相关标记物结合孕妇年龄筛查：主要 相关血清标记物有相关血浆蛋白(PPA)、甲胎蛋白(FP)、游 离雌三醇(E3)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)。检出率为60- 70%，假阳性率5%。 v羊水细胞培养、染色体G显带核型分析：经典方法，但费 时长(2-3周)，手工操作量大，羊水细胞培养成功率低。 v荧光原位杂交(Fluorescence in-situ hybridization，FISH) ：该方法准确率高，但同时技术要求高，成本昂贵 。 vPCR荧光染料定量分析法：同时扩增21号染色体的人肝型 磷酸果糖激酶基因(PEKL2CH21)外显子8和1号染色体的人肌 型磷酸果糖激酶基因(PEKM2CH1)外显子9，扩增产物经荧 光染料标记后，再用凝胶成像系统对PCR产物进行吸光度分 析。该方法操作较繁琐，不能实现对大人群的高通量筛查。 vPCR扩增短串联重复序列(Short Tandem Repeats，STR)后 ，经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染，进行DNA密度分析：该方 法操作繁琐，费时长，灵敏度低，不能实现高通量筛查。 vSTR荧光定量PCR分析方法：通过分析峰面积比值或出峰 个数进行诊断。但该方法成本较高，仅合成标记探针就需数 千元，而且在产前诊断方面特异性稍差。 相对以上技术而言，DHPLC技术是一种高通量、快速 、准确、灵敏度高、经济、自动化程度高的遗传变异筛 查技术, 在非变性温度条件下，可以对不同长度的双链 DNA片段进行分离。 近期大量研究发现，多余的片段中含有21q22带，就会 患DS，反之则不会患病。表明21q22是DS的关键区域。 STR均匀地分布于人类基因组中，具有高度多态性和高 杂合度等特点，并遵循孟德尔共显性遗传规律。 由此引出对本课题的研究。 研究内容 STR位点的选取：通过网上资源及实际分析，选取理 论及实际杂合度较高的STR位点。 方法的建立与优化：对所选实际杂合度较高的STR位 点进行PCR扩增，利用非变性高效液相色谱技术分离 PCR产物中不同片段长度的DNA片段，由不同的峰型可 以诊断DS患者并鉴定其染色体的亲代来源。 方法的评价：用细胞培养、染色体G显带核型分析方 法同时对所有样本进行确诊，与本课题所建立方法进行 双盲评价。 技术路线 (1) 标本的收集：收集20例DS家系和100例正常人群外周血标本，家系标 本每份分为两组，一组进行细胞培养及G显带核型分析，另一组提取 DNA。 (2) STR位点的选取：利用网上资源选取理论杂合度较高(0.8)的STR位点 ，然后通过对100例正常人群标本的分析，获得实际杂合度较高的STR位 点。 (3) PCR条件的建立及优化： PCR扩增所选实际杂合度较高的STR位点。 (4) 非变性高效液相色谱技术诊断DS方法的建立：分离不同长度的PCR扩 增产物，优化条件使本方法可以用于DS产前诊断并鉴定患者染色体的亲 代来源。 (5) 评价实验：用细胞培养、染色体G显带核型分析方法与本课题所建立 方法进行双盲评价。 研究方案 （1）首次将DHPLC技术应用于唐氏综合征产前诊断的研 究，目前，国内外均未见报导。 （2）本课题所选取的STR位点均位于21q22带这一关键区 域内，且具有高杂合度特点，通过对数个STR位点的同时 检测，几乎可以对所有类型的DS做出诊断（嵌合型DS患者 体内三体型细胞比例低者除外），可以对99.9%以上的DS 患者做出诊断。 （3）本方法同时具有快速、准确、低成本、高通量等其它 方法不具备的优点。 特色与创新点 已完成了21例DS家系标本的采集工作(细胞染色体核型分 析确诊工作已完成) ，并已提取DNA，正常人群