《酶的催化机制》PPT课件.ppt

第四章 酶的催化机制 l酶分子在一级结构的基础上盘绕折叠成 特定的空间结构（即三维结构）才具特 定的催化功能。其中包括二级结构（主 链碳原子局部空间排列，即a螺旋、折 叠和转角），三级结构（在三维空间 中折叠成紧密的近球状结构）和四级结 构（寡聚酶的亚基之间的相互结合）。 l酶的高效率、高度专一性和酶活可调节 等催化特性，都与酶蛋白本身的结构直 接相关，酶蛋白的一级结构决定酶的空 间构象，而酶的特定空间构象是其生物 功能的结构基础。 l人们只有更深入地认识酶、才能更好地 控制酶和应用酶，即在不断研究酶的结 构和功能的具体关系和催化机理的基础 上，才能研制新的酶类，开发出更广泛 的用途。 第一节 酶的活性部位（活性中心 ） l酶的活性部位是指酶分子中结合底物并 催化底物转化成产物的区域。活性部位 包括底物的结合部位和催化部位。参与 底物结合的氨基酸残基称为结合基团， 直接参与催化过程的基团称为催化基团 ，这些氨基酸残基在一级结构可能相距 很远，但在空间结构中却相距很近，处 于酶分子的表面并组成一个裂隙和流水 口袋。 l一、活性部位在整个 酶分子中只占很小一 部分 l酶与其他蛋白质一样 ，是一个结构极其复 杂的大分子，而参与 底物结合和催化的基 团，则只是少数几个 氨基酸残基。作为活 性部位的裂隙只占酶 分子中很小的一部分 。 l二、 活性部位是具有三维结构的裂隙 l l酶的活性部位具有复杂三维结构的形态 ，构成活性部位的氨基酸残基处于酶分 子一级结构上的不同部位，有的残基相 距很远，然而在空间结构上却相距很近 ，可协同结合和催化底物。 l例如溶菌酶分子中有129个氨基酸残基， 活性部位的重要基团则是由Glu35， Asp52，Trp62，Trp63和Asp101残基提 供的。 l三、底物与酶活性部位是通过次级 键结合的 l酶与底物的复合物ES的平衡常数在10-2 10-8molL的范围内，其相互作用的自由 能变化相当于-3-12kcalmol的范围。 我们知道，共价键的自由能变化在-50- 110kcalmol的范围内，相比之下，底 物与酶的结合力是很弱的。 l四、活性部位的裂隙具有高度疏水性 l在已知结构的酶分子中，与底物分子结合 的活性部位裂隙，通常水分子是进不去的 ，除非水分子本身是底物分子。裂隙中也 含有几个对结合和催化来说是必需的极性 残基，但并不影响整个裂隙的疏水性，因 此有人将活性部位形象地称之为“疏水口袋 ”，活性部位的疏水性增进了底物的结合， 是酶具有高效率的原因之一。参与底物结 合的基团总和称为结合部位，参与催化过 程的基团总和称为催化部位。实际上这两 个部位的几何位置并不截然分开，采用这 两个名称只是为了便于说明作用的机制。 l五、 活性部位构象上的柔性 l酶催化的专一性取决于酶分子活性部位必需基团各 原子的空间排布以及酶与底物之间的多点结合。 1890年Fisher曾提出酶和底物相互作用的锁一匙模 型，然而后来研究结果表明，酶的活性部位并不是 刚性不变的，在结合底物时酶分子的活性部位构象 发生了改变，这个过程是个动态的过程，称为诱导 契合。近年来，基于大量的在去折叠过程中失活与 构象变化的比较研究的重要事实，我国科学家邹承 鲁提出了酶分子的活性部位柔性的理论，并指出这 种柔性是酶催化作用所必需的。也就是说，酶分子 的活性部位构象上相对的柔性是酶催化所必需的。 第二节 酶的活性部位的研究方法 l一、发现与证实 lChT（胰凝乳蛋白酶）241个氨基酸，分子量 25700。此酶可水解芳香族氨基酸的羧基端形 成的肽键；可水解芳香族氨基酸的羧基端形 成的酯键。 l设计人造底物乙酰酪氨酸乙酯。由于底 物很小，故它与酶只是点接触，而酶又能使 其水解，说明酶分子直接参与酶催化的部位 只不过是一小部分。 l溶菌酶129个氨 基酸，分子量 14600。水解细 胞壁（多糖） 而溶菌酶直接 接触的只是六 个六碳糖，也 说明酶分子只 有小部分参与 作用。 lI（抑制剂）二异丙基氟磷（DFP） lChT + DEP 活性丧失 l经测定DEP与ChT的195位Ser结合，而ChT有27个Ser， 只与195-Ser结合，可见此Ser与其它Ser性质不同，可能 处于特殊部位。 lChT酶原与ChT结构很相近，但DEP + ChT酶原不结 合 l不结合者无酶活，可以推测抑制剂结合的部位可能是活 性中心 l二、活性部位含义 l酶的活性部位是酶分子的一小部分，是酶分 子中与底物结合并催化反应的场所。 l活性部位是由几个氨基酸侧链基团组成（包 括辅酶、金属离子等），它们在一级结构中 位置可能很远，但形成空间结构后位置很近 ，活性部位实质上是某一空间区域而不是一 个点或面。 l酶的活性部位包括底物结合部位、催化部位 。 l羧肽酶A（全酶）活性部位：Tyr，Arg， Glu；Zn+。 l三、催化部位和结合部位 l催化部位是催化反应中直接参与电子授受关系 的部位，经研究ChT的催化部位已清楚，其电 荷传递系统为Asp102 His57Ser195（*一 级结构较远但空间位置较近） l而T（胰蛋白酶）具有与ChT相同的催化部位。 lChT Gly障碍小，故芳香族氨基酸易进入，因此 水解芳香族氨基酸羧基形成的肽键 lT Asp-则易结合带正电的氨基酸，故水解碱性氨 基酸羧基形成的肽键 l酶活性部位的氨基酸组成直接影响其特异性， 即二者结合部位不同。 l四、酶活性部位的研究 l主要方法是化学修饰法，其它方法包括 反应动力学法、光谱法、X光衍射法（结 果可靠，但必须是晶体）。 l化学修饰法： l蛋白质+化学试剂反应引起某些 氨基酸残基或某些基团的共价的化学改 变即化学修饰。此化学试剂叫化学修饰 剂。 l如何确定修饰试剂是结合在活性部位的 基团上，而不是结合到活性部位以外的 基团上呢？首先要求加入修饰试剂后， 酶计量失活（平行失活），其次还要根 据不同的情况作进一步确定。 l计量失活：加入几摩尔修饰剂就有几摩 尔的酶100%失活。 l特殊基团非特异性试剂 l使用此种试剂要求: l Y只能在活性部位中有，其它部位没有。 l例：木瓜蛋白酶有7个Cys，其中6个形成-S-S-；1 个Cys。 lCys+碘乙酸 计量失活 l故Cys在活性部位上。 l活性部位Y，由于活性部位微环境的影响反应灵 敏度极高，此时非活性中心的Y不与R结合。 l例：RNA酶活性部位Lys41的-NH2活性特强，可 被氟二硝基苯特异标记。 l具有上述二条件的酶极少，而我们要使用非特 异性试剂就必须用差示标记法。 l差示标记法（加入保护剂） l非特殊基团非特异性试剂 lR* 连接的基团即活性部位。 l保护效果：在保护过程中要避免下述两点: lP要过量，防止剩余未被保护的Y；保护后构象 变化导致Y-R解离。上述两点可导致实验误差 。前两种标记均为共价标记。 l亲和标记法 l非特殊基团亲和试剂 l根据酶和底物的结合特性来设计底物即特 异性试剂。 l底物+可与活性部位结合的活性基团亲和 试剂（特异性较强） lChT：水解芳香族氨基酸羧基所形成的肽键 或酯键，故亲和试剂为甲苯磺酰-L-苯丙氨 酸为基本结构。 lChT酶原+TPCK不结合 lChT+8M脲+TPCK不结合 lChT+TPCK结合 lTPCK结合部位必定是活性中心 lChT：有两个His残基，一级结构的40，57位。 lChT+TPCK 酶水解分析氨基酸组成 只有一个His 确定TPCK结合的是另一His。 l14C-TPCK+ChT水解发现14C存在于His-57上， 确定TPCK与第57位的His结合（即活性部位） lT（胰蛋白酶）也有His，但不与TPCK 结合，说明T与ChT有不同的底物专一性 ，T水解碱性氨基酸羧基所形成的酰胺键 或酯键。它的底物是甲苯磺酰-L-赖氨酰 胺（酯） lTLCK+T，最后找出与TLCK结合的氨 基酸是His-46即活性部位。 l其它方法： l动力学分析法：若在不同的pH条件下，酶 活力变化较大，而某个基团的解离程度也有 较大程度的改变，则此基团是活性部位。 l光谱学法：最常用的紫外吸收光谱和荧光光 谱。 l蛋白质分子中含有生色基团，当底物结合时 ，位于结合部位的生色基团必然会发生某种 变化，比较底物结合前后光谱学的变化，可 推断活性部位。 lX光衍射：X光衍射可直接看出活性部位（ 即底物结合部位），但必须是结晶。 第三节 酶的催化机制 l我们已经了解到酶之所以能加速化学反应 ，主要是酶能通过与底物形成中间产物来 降低反应的活化能。不同的酶其催化机制 是有差别的，下面讨论酶的催化机制和对 酶高效催化有贡献的主要因素。 l1、底物与酶的接近与定向效应 l底物的反应基团与酶活性中心的催化基 团相互严格的定向，使得活性中心的底 物浓度特别高从而使反应速度增高。研 究发现提高酶反应速度的最主要方法是 使底物分子进入酶的活性中心区域，亦 即大大提高活性中心区域的底物有效浓 度。除此之外，还需要使反应的基团在 反应中彼此相互严格地“定向”，反应 物分子才被作用，迅速形成过渡态。见 轨道定向假设示意图。 l2、底物分子的敏感键产生张力或变形 l许多酶的活性部位开始与底物并不相适 应，但为了结合底物，酶的活性部位不 得不发生相应变化（前面所提的诱导契 合），以适应底物。一旦与底物结合， 酶分子中某些基团可使底物分子的敏感 键中电子云密度部分的增加或减少从而 产生“电磁张力”使底物发生变形，使底 物敏感键更敏感，更易于反应。下图用 一个示意图说明酶与底物结合，使底物 变形生成产物的过程。 l3、共价催化作用 l某些酶能与底物形成一个反应活性很高的共 价中间复合物。底物只需越过较低的活化能 就可以形成产物。此既为共价催化作用。 l共价催化的最一般的形式是催化剂的亲核基 团对底物中亲电子的碳原子进行攻击，亲核 基团含有多电子的原子，可以提供电子，它 是十分有效的催化剂。酶反应中可以进行共 价催化的、强有力的亲核基团很多，酶蛋白 分子上至少就有三种，图中所指出的丝氨酸 羟基、半胱氨酸巯基及组氨酸的咪唑基。此 外对具辅酶的双成分酶（复合蛋白质）来讲 ，其辅酶中往往还含有另外一些亲核中心。 l4、酸碱催化 l这里指的是广义的酸碱催化。它是一种质子 供体及质子受体的催化，发生在细胞内许多 类型的有机反应都是受广义的酸碱催化的， 如将水加到羰基上、酯的水解，从双键上脱 水、各种分子重排及许多取代反应等。 l酶活性中心的一些基团（氨基、羧基、酚羟 基、巯基、咪唑基等）可作为质子供体或受 体对底物进行催化，从而加快反应速度。蛋 白质中可作为广义酸碱的功能基。 l其中组氨酸的咪唑基值得特别注意，因为它既是 一个很强的亲核基团，又是一个最有效、最活泼 的广义酸碱功能基。这是因为组氨酸的咪唑基的 解离常数约为6.0，接近生物体的生理pH条件，此 时它一半是酸形式、另一半是碱形式，既可以作 为质子供体、也可作为质子受体，而且研究发现 它供出和接受质子的速度十分迅速，在酶的酸碱 催化中显得特别活跃，而因其广义碱的形式咪唑 环中N原子上有未共享的电子对，所以也是亲核基 团，可进行共价催化作用。鉴于咪唑基有如此的 优点，虽然组氨酸在大多数蛋白质中含量很少， 却很重要。 l5、活性中心部位的微环境效应 l酶活性中心多半靠近位于疏水微环境的凹陷中， 疏水环境中介电常数较低，故在疏水环境中两个 带电物（底物、酶中心）之间的作用力显著增加 ，从而使反应速度加快。 l处于低介电环境中的基团之间的反应之所以会得 到加强，主要是因为介质的电荷常数是反映介