纳米医药第13章－纳米技术载基因转导中的应用.doc

第13章 纳米技术在基因转导中的应用随着纳米技术及基因转导技术本身的不断发展，纳米技术将在基因转导过程中发挥更大的作用。本章通过论述纳米技术在基因转导中的应用来阐述纳米生物学的相关内容。13.1 常用基因转导方法基因转导是在分子水平上对基因进行遗传操作的一种手段。一个基因经标记、定位并被克隆后，人们总希望将其导入不同类型的细胞中，以研究外源基因的整合、调控、表达的遗传规律以及分离其特定的基因产物等。为了研究基因的结构与功能的关系，就必须建立有效的DNA导入细胞的方法。现已有多种方法可将DNA直接或间接地导入细胞，这些方法可分为物理方法（如基因枪法1 Massiah A, Rong H L, Brown S, et al. Accelerated production and identification of fertile, homozygous transgenic wheat lines by anther culture. Mol. Breed, 2001, 7(2): 163173、碳化硅纤维法2 Patnaik D, Khurana P. Wheat biotechnology: A minireview. Electron J. Biotechnol., 2001, 4(2): 98101、显微注射法3 Janus C, Westaway D. Transgenic mouse models of Alzheimers disease. Physiol. & Behav., 2001, 73(5): 873886等）、化学方法（如高分子复合物介导法、PEG法4 Gietz R D, Woods R A. Genetic transformation of yeast. Biotechniques, 2001, 30(4): 816831及磷酸钙法5 韦 毅，胡美浩人P68核蛋白在小鼠成纤维细胞中过量表达引起恶性转化的研究遗传学报，2001，28（11）：991996等）、生物方法（如脂质体法6 Sawahel, W A. The production of transgenic potato plants expressing human (alpha)-interferon using lipofectin-mediated transformation. Cellular Mol. Bio. Lett., 2002, 7 (1): 1929 、农杆菌法7 Sovyanhadi Y, Arakawa T, Langridge W H R. Human (beta)-casein gene expression in transgenic tomato plants. Transgenics, 2001, 3(2-4): 199206 、真菌游走孢子介导法8 Zhang L, Mitra A, French R C, et al. Fungal zoospore-mediated delivery of a foreign gene to wheat roots. Phytopathology, 1994, 84: 684687及花粉管法9 Chong K, Bao S L, Xu T, et al. Functional analysis of the ver gene using antisense transgenic wheat. Physiol. Plantarum., 1998, 102(1): 8792等）和生物物理方法（如电击法10 He G Y, Lazzeri P A, Cannell M E. Fertile transgenic plants obtained from tritordeum inflorescences by tissue electroporation. Plant Cell Rep., 2001, 20: 6772和激光介导法等）。这些方法大多可以借助纳米载体协助完成基因转导过程。故本节对它们作了较详细的介绍。13.1.1 物理方法1基因枪法基因枪转导法又称粒子轰击技术(Particle bombardment)或称生物发射技术(Biolistic process)、高速微粒子发射技术(High-velocity microprojectile)，它是将载有外源DNA片段（基因）的金或钨等微粒加速后在真空状态下射入受体细胞中的一种遗传物质在物种间或物种内的转导技术。加速的动力通常是通过高压气体、高压放电或火药爆炸加在粒子上的瞬时冲量等。1987年美国康奈尔大学的Sanford等11 Sanford J C, Klein T M, Wolf E D, et al. Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process. J. Part Sci. Technol., 1987, 5: 2737首先发明了火药式基因枪，随后该实验室的Klein等12 Klein T M, Wolf E D, Wu R, et al. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature, 1987, 327: 7073使用该基因枪将携带有细菌氯霉素乙酰转移酶基因(cat)的烟草花叶病毒的RNA导入洋葱表皮细胞，使cat基因在洋葱中得到表达。1990年美国BioRad公司根据Sanford等的研究推出商用基因枪PDS-1000/HE系统，随后基因枪法在基因转导中得到广泛应用。与此同时，高压放电13 McCabe D E, Swain W F, Martine B J, et al. Stable transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration. Bio/technol., 1988, 6(8): 923926、压缩气体驱动14 Oard J H, Paige D F, Simmonds J A, et al. Transient gene expression in maize, rice and wheat cells using an airgun apparatus. Plant Physiol., 1990, 92: 334339等各种类型基因枪也相继出现，并在反复实践中得到改善和发展，其改进的核心是粒子加速系统，目的是提高射弹的可控度(粒子的运动速度和射入的深度等)。这些改进不但提高了微粒轰击法基因转导的效率，而且结果的可重复性也得到了提高。但是，所有的这些方法都是基于同一个原理，即将钨粉或金粉微粒加速到很高的速度使之穿透植物细胞壁，或其它类型细胞的核或具有DNA序列的质粒的外围蔽障。微粒轰击技术的出现是禾谷类植物的遗传转化取得重大进展的标志。现在，主要的禾谷类作物，如水稻、玉米、小麦15 Vasil V, Castillo A M, Fromm N E, et al. Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. Bio/Technol., 1992, 10: 667674和大麦等，都已通过基因枪法进行了成功的转导，并得到目的基因正确表达的转基因植株。Zhou等16 Zhou H K, Arrowsmith J W, Froom M E, et al. Glyphosate-tolerant CP4 and GOX genes as a selectable maker in wheat transformation. Plant Cell Rep. 1995, 15: 159163用基因枪法将耐草甘膦土壤杆菌属CP4草甘膦氧化还原酶(GOX)基因转导到小麦幼胚中，获得了耐草甘膦的转基因小麦植株。Barro等17 Barro F, Rooke L, Bekes F, et al. Transformation of wheat with HMW subunit genes results in improved functional properties. Nat. Biotechnol., 1997, 15(2): 12951299和何等18 He G Y, Rooke L, Steele S, et al. Transformation of pasta wheat (Triticum turgidum L. var. durum) with high-molecular-weight glutenin subunit genes and modification of dough functionality. Mol. Breed, 1999, 5: 377386用基因枪法将编码高分子量麦谷蛋白亚基的基因(1Ax1和/或1Dx5)导入普通小麦和硬粒小麦中，获得表达外源目的基因的转基因小麦，面筋功能分析表明，由转基因小麦加工得到的生面团的弹性显著增加。用于基因枪转化的材料，通常分为两种，一种是愈伤组织，一种是新分离的外植体。如果受体具有很好的再生能力如水稻，其愈伤组织可以用作基因枪转化的受体材料，然后在合适的选择压力下培养筛选转化体。而对于小麦等禾谷类离体细胞（组织）高频再生较困难的材料，则可直接对新分离的外植体如幼胚或幼穗等立即进行基因枪转化，或者在培养几天后用基因枪转化。这些组织可产生大量具有再生能力的培养细胞，并通过体细胞胚胎发育再生出植株，在体细胞胚胎发生的过程中应用适当的筛选策略就可以区别出转化体。此外，在大豆和大麦转化中用芽或吸涨的种子的分生组织区进行轰击，但不进行筛选，只在再生出植株后进行分子鉴定也获得成功。选择剂是区分转化体和非转化体的快速有效的手段，因此选择合适的选择剂及浓度是转化成功的关键因素之一。选择剂的选择以能明确快速区分转化体且对转化体不产生形态、生理及遗传方面的不良影响为标准。例如，禾谷类植物转化细胞成功筛选的条件就与其它类型植物有较明显区别，通常用于双子叶植物转化体的选择剂如卡那霉素和潮霉素在对筛选单子叶植物愈伤组织的选择时效果较差。目前在禾谷类转基因研究中使用最为广泛的选择剂有除草剂-Basta和G418。Basta含有效成分膦丝菌素（Phosphinothricin，PPT）可以在低浓度时杀死未转化的组织。对Basta的抗性可以通过一种编码膦丝菌素乙酰转移酶（Phosphinothricin acetyltransferase， PAT）的抗性基因（bar基因）获得；G418的有效成份为硫酸遗传素(Geneticin Sulphate)。这两种选择剂和抗性基因的组合目前已在禾谷类作物的转化上得到了广泛的使用19 He G Y, Rooke L, Cannell M, et al. Current status of transformation in bread and durum wheats and modifications of gluten quality. Acta Agron Hung, 1998, 46(4): 449462。基因枪法所使用的外源基因载体为金属微粒如钨粒和金粒等，其中金粒更为常用。在进行植物基因转导过程中，为了提高转化效率，应用纳米技术已将金粒的直径从约1.2微米降至0.6微米以下，使之成为纳米粒。随着微粒直径量级的变化即微粒直径由微米级变为纳米级，相同体积的载体微粒能够携带外源基因的表面积随之增大（见表13-1）。与传统的非纳米微粒相比，其携带外源基因的容量更大，穿透能力更强，对靶细胞的损伤也更小，故而有着更高的转化效率。虽然基因枪法转导需要比较昂贵的特殊设备、转导过程费用较高、操作过程对目标组织有一定的伤害、且一般情况下转化体的整合拷贝数较高，但基因枪法的优点是十分明显的。它具有较高的转化频率，且实验结果具有较好的可重复性。此外，由于基因枪法转导是一个物理过程，因此其对外源基因的导入不受生物种属的限制。基因枪法转导时外源基因的导入过程相对简单，一般不需要制备原生质体。随着利用基因枪法对植物成熟种子系统进行基因转导研究的进展，该方法将变得更加简便、实用。正是由于以上的优点，基因枪法已经成为目前得到广泛应用的转化方法之一。2碳化硅纤维介导法碳化硅纤维介导法应用直径为0.6、长度为1080的碳化硅纤维，使附着于纤维或细胞壁上的质粒DNA借助于在涡旋力引起的相互碰撞过程中纤维对细胞的穿刺作用而导入细胞。1992年Kaeppler等20 Kaeppler H F. Silicon carbide fiber mediated stable transformation of plant cells. Theor. Appl. Genet., 1992, 84: 560566用该法将Bar基因、NPT基因以及GUS基因成功导入到玉米细胞中并得到表达。Asano等21 Asano Y, Otsuki Y, Ugaki M. Electroporation-mediated and silicon carbide fiber-mediated DNA delivery in Agrostisalba (Redtop). Plant Sci., 1991, 79: 247252成功地将外源目的基因导入草坪草中。该方法简单、快速、成本低，但纤维丝刺穿细胞是否影响细胞的生长及分化，有待于进一步研究证明。3显微注射法22 孙晗笑，陆大祥，刘鹏飞转基因技术理论与应用郑州：河南医科大学出版社，2000 显微注射法是通过直接向单细胞胚胎的原核注射DNA的方式生产转基因动物或其它转基因生物的方法。这种方法由Gordon等人于1980年首先发明，其后通过Brinster等人的一系列改进，一直沿用至今并有多例成功的报道。显微注射操作如图13-1所示。图 13-1 DNA显微注射模式图22以转基因小鼠为例，首先是使供体雌鼠超量排卵，增加用于微注射接种的DNA的卵细胞数量。然后在这些雌鼠交配后取其受精卵，在显微注射仪下注射外源DNA。用于显微注射转入的目标DNA通常为去除了载体序列的线状DNA。在转化过程中选择遗传操作的合适时期也至关重要。一般来说，DNA微注射要在精原核时才有效。DNA注射后进行受精卵培养并筛选出注射成活的卵。然后将其移入假孕雌鼠的输卵管中。3周后，接受过外源DNA注射的受精卵即可发育生长为胎鼠。幼鼠出生后，可取其尾抽提DNA，进行外源基因的PCR检测和Southern杂交来确证是否为转基因鼠。对于基因调控研究，则只需快速检测相应过程的调控信息，而不需保留转基因鼠，即可从鼠胚胎中提取DNA，进行外源基因检测，以确证外源基因的整合及表达。转基因鼠中外源基因整合部位是随机的，且常常是头尾相连的多聚体。通过检测可以确定外源基因的整合部位，及其整合的拷贝数。显微注射法是目前生产转基因动物过程中使用最广泛、发展最早，同时也是目前最有效的方法23 Hogan B, Constantini F, Lacy E. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. New York: Laboratory, 1986: 80203。此外，显微注射法也在油菜、番茄、玉米等植物的基因转导中取得了成功24 Neuhaus G, Spangenberg G, Scheid O M, et al. Transgenic rapeseed plants obtained by the microinjection of DNA into microspore-derived embryos. Theor. Appl. Genet., 1987, 75(1): 3036。该方法的优点是外源基因的转导频率高，可达30%；外源基因的长度在较大范围内不受限制，可达100 kb；往往能得到纯系动物；试验周期相对较短。与此同时，该方法一些不足也在一定程度上限制了这一技术的应用，如需要昂贵精密的仪器；显微注射操作复杂；需要专门技术人员；导入的外源基因拷贝数不易控制，常为多拷贝，最多可达百余个拷贝；常导致插入位点附近宿主DNA大片段缺失、重组等突变，从而造成转基因动物的严重生理缺陷。尽管如此，由于该方法是直接对基因进行操作，且整合效率高，因此仍是目前获得转基因动物极为重要的方法之一。13.1.2 化学方法1聚乙二醇（PEG）介导法聚乙二醇（PEG）介导的基因转导是将原生质体悬浮于含有外源基因(DNA)的介质中，通过PEG处理改变细胞膜的通透性而使受体原生质体处在易于进行遗传转化的状态。Krens等最早用PEG介导法实现了烟草的外源基因的遗传转化，此后在许多单子叶和双子叶植物，如烟草、牵牛花、水稻、小麦、玉米、油菜等都获得了成功的遗传转化25 周翼明，卫志明PEG法介导转化诸葛菜下胚轴原生质体获得转基因植株遗传学报，1996，23（1）：6976。李学宝等26 李学宝，白永延，许智宏，等紫云英细胞转化条件的研究植物学报，1994，36（6）： 437443在对紫云英细胞进行遗传转化的研究表明较高的pH值和Ca2+浓度能促进外源DNA进入紫云英原生质体，有利于外源基因的转导。PEG法不需要特殊的仪器设备，实验结果比较稳定，其转化频率可达1%。缺点是原生质体的培养及再生困难，且费时费力，还存在着基因型的限制，到目前来说，转导成功的例子仅限于有限的、易于再生的模式基因型材料。该方法的另一缺点是原生质体再生培养过程常常会产生一些有害变异，转化再生的植株常出现较高比例的不育株或白化苗。在PEG介导的转化中，PEG、H+、Ca2+的浓度及外源DNA的浓度和构象、加入DNA和PEG的次序等均对外源DNA向植物细胞内的成功转导有一定影响27 Kohler F, Cardon G, Pohlmann M. Enhancement of transformation rates in high plants by low-dose irradiation: are DNA repair systems involved in the incorporation of exogenous DNA into the plant genome? Plant Mol. Biol., 1989, 12: 189199。2磷酸钙介导法磷酸钙介导法是目前真核细胞转导的最常用方法，其原理是利用DNA与磷酸钙形成的抗DNA酶的羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经热冲击处理后促进细胞对外源DNA的吸收。从磷酸钙介导法中外源基因进入靶细胞的过程来看，一般认为是利用磷酸钙纳米粒作为载体与外源DNA形成复合物后携带外源DNA进入靶细胞。Craham等1973年首次应用此法转导哺乳动物。黄建等28 黄建，李文鑫，郑从义人MCP cDNA在NIH3T3细胞中表达及功能研究生物工程学报，2000，16（2）：155157则利用该方法实现了人辅膜因子蛋白MCP cDNA在NIH3T3细胞中的表达。与此同时，严乐勤等29 严乐勤，余应年，诸葛坚，等人细胞色素P450 2A6 cDNA克隆及其在哺乳类细胞中的表达中国药理学与毒理学杂志，2000，14（1）：3135实现了人细胞色素P450 2A6 cDNA在哺乳类细胞中的表达。此方法成功的关键在于制备理想的磷酸钙-DNA复合物。磷酸钙-DNA复合物能在饱和缓冲溶液中自动生成，但要制备出具有高效转导的复合物则非常困难。影响制备高质量的DNA-磷酸钙复合物的主要因素有质粒的质量、CaCl2及Na2HPO4的浓度、HEPES的pH值、反应温度、反应时间等。在众多的因素中，除质粒外其余因素均易控制及量化。该方法对质粒的质量要求很高，质粒溶液中不能含有蛋白质及RNA。CsCl密度梯度离心或QIAGEN柱层析的方法可达到去除蛋白质和RNA的目的，而采用酚/氯仿/异戊醇方法纯化质粒，则难以将质粒溶液中的蛋白质完全去除30 焦建明，刘宇珠一种改良制备磷酸钙DNA共沉物的方法生物技术，1999，（1）：4849。由于磷酸钙具有吸附蛋白质的特性，残留的蛋白质作为复合物的吸附剂被吸附到微粒的表面，并使微粒聚集成片状或块状，占据微粒与细胞表面蛋白质结合的位点，从而降低了微粒吸附于细胞表面的能力。磷酸钙可诱导和促进细胞的吞噬作用，达到促进DNA进入受体细胞的目的。但转导的效率并不取决于细胞膜表面的DNA浓度，而是取决于细胞特定表面复合物的浓度。由于残留的蛋白质能干扰复合物吸附到细胞膜表面，结果会使转导效率降低，甚至造成基因转导失败。有报道指出将质粒用CaCl2预处理，借助高盐环境，通过盐析作用可将蛋白质沉淀析出，离心后弃去沉淀而能将质粒溶液中残余的蛋白质完全去除。同时该方法还能有效地去除残余的RNA，以消除RNA对DNA遗传转导的不利影响。 13.1.3 生物方法1农杆菌介导的基因转导农杆菌介导的基因转导是一种能够实现DNA转移及整合到受体细胞DNA序列中的天然遗传工程系统。这种天然系统是人们在两类相关的土壤细菌即根瘤农杆菌和发根农杆菌中发现的。它是由天然质粒构成的转化系统，在这个系统中有两个功能区域即T-DNA和Vir 区域。T-DNA区是质粒上能够转移并整合到植物受体细胞染色体中，Vir区则能编码实现转移的蛋白。在根瘤农杆菌系统的应用中，具有里程碑意义的发现是这两个区域既能够进行顺式作用又能进行反式作用。该发现可用于开发更为高效的载体系统。T-DNA两端各有一个DNA边界序列，两个边界序列之间的DNA片段可以转移并整合到宿主细胞的染色体上，也就是说只有边界序列对DNA的转移才是必需的。由于野生型Ti和Ri质粒的边界序列之间的DNA并不参与转导过程，因此可以将其替换为外源基因。由于原始的Ti或Ri质粒的大小约为200 kb，故目前通常采用易于操作的小质粒来构建载体。构建的方法是将用于转化的基因克隆到大肠杆菌质粒上的左、右边界序列之间，然后将质粒转入到一个已经从Ti质粒上去掉了T-DNA内部序列的非致瘤农杆菌菌株中。在早期的研究中，克隆的基因是通过同源重组整合到Ti质粒上，然后用这种农杆菌进行转导。这种系统要求在T-DNA内携带细菌筛选标记基因以便筛选重组子，转导效率不是很高。后来发现Vir基因的反式作用（即Vir基因在实现T-DNA转移的过程中，不一定要与T-DNA在同一质粒DNA上），借此发现随后开发出了双元载体系统。人们把不含T-DNA的非致瘤Ti质粒分离出来，构建广谱宿主范围的质粒，即在大肠杆菌和农杆菌中都能复制的质粒。质粒上带有T-DNA的左、右边界序列，它们之间有多克隆位点。这样，目的基因就能很容易地构建到这个双元载体上，转入并保持在农杆菌中，然后转入植物中。这一改进使外源目的基因导入农杆菌载体系统以及构建转化载体的工作变得易于进行。自从1983年人们利用根瘤农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 转化系统获得第一株转基因植株以来，这一技术已获得了突飞猛进的发展，并被广泛应用到大部分双子叶和一部分单子叶植物的遗传转化中，该系统为人类利用生物技术改造自然界开辟了广阔的前景。随着人们对遗传转化机理的深入了解及对转化方法的不断改进，农杆菌介导的基因转导法也已在水稻31 Rashid H, Yokoi S, Toriyama K. Transgenic plant produciton mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Rep., 1996, 15: 727730、玉米32 Ishida Y, Saito H, Ohta S. High efficient transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nat. Biotechnol., 1996, 14: 745750、小麦33 Cheng M, Fry J E, Pang S. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Physiol., 1997, 115: 971980、大麦34 Tingay S, Mcelray D, Kalla R. Agrobacterium tumefaciens mediated barley transformation. The Plant J., 1997, 11: 13691376等重要的单子叶作物中获得成功。与基因枪法等直接转化法相比，农杆菌介导的转化有以下优点35 孔英珍，周功克，王根轩，等影响根癌农杆菌转化的因素及其在单子叶作物上的应用应用生态学报，2000，11（5）：791794： 该转导系统是天然的遗传工程系统，其转化成功率高，效果显著； 操作简便，不需要特殊的仪器设备； 可转导特定的DNA片断，且允许插入可达50 kb的较大DNA片断； 整合的拷贝数一般较少，通常为一到几个拷贝，从而减少甚至避免因整合拷贝数高而发生的基因沉默现象； 无需进行耗时费力且困难的原生质体分离和培养；转化频率较高，可高达30%36 Smith R H, Hood E E. Agrobacterium tumefacients transformation of mono- cotyledons. Crop Science, 1995, 35: 301309，而微弹轰击法或原生质体融合法则只能达到2%左右。2脂质体介导转化法脂质体是1965年由Bangham首次发现的。它是一种人工制备的类脂质的小球体，由一个或多个类似于细胞膜的类脂双分子层包裹着水相介质组成。构成双分子层的类脂其亲水性的头部形成膜的内外表面，而亲脂性的尾部处于膜的中间，膜壁的厚度约为5nm7nm，而囊的直径一般在25nm500nm之间, 故称之为脂质纳米粒。如图13-2所示，脂质体的这种结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两亲的外源物质。这些物质或被包入脂质体内部水相，或插入类脂双分子层，或吸附连接在脂质体的表面。由于脂质体是由可生物降解的磷脂组成的双分子层结构，所以与生物膜有较大的相似性和组织相容性。自Banghan等发明并作为生物膜模型研究以来，至今已广泛应用于生物学的各个领域。关于脂质体的论述详见本书第六章，20世纪70年代后期，Robert等将细菌质粒DNA包入脂质体，由此开始了脂质体在分子生物学领域的新应用。而20世纪80年代中期出现的阳离子脂质体，则将基因转导的效率提高了10多倍。与其它方法相比，脂质体介导转导的优点在于经脂质体包裹的外源基因具有高效、无潜在感染及能使目标基因定向转移到特定组织的优势。图 13-2 脂质体结构模式图37 周力，吴肖群脂质体及其应用现代化工，1997，9：1820脂质体是由磷脂双分子构成的双分子层囊泡。最初用作基因载体的脂质体是由天然磷脂如卵磷脂、脑磷脂及胆固醇所构成的中性或带阴离子电荷的阴离子脂质体，使用时将质粒DNA包入脂质体内部，但包封率较低，因而容易被溶酶体溶解破坏。1987年Felgner等合成了阳离子脂质体N-1-(2.3-二油酰基)丙基-N,N,N-三乙胺氯(DOTMA)，其分子结构有一带季铵阳离子的头部和两个长链的不饱和脂肪酸的尾部（主体）。由DOTMA构成的脂质体可与DNA自发形成复合物，其结合率可达100%。Felgner用DOTMA/DOPE (1:1)脂质体转导pSV2CAT到各种细胞中如COS-7细胞、杂交瘤细胞等，结果表明这种阳离子脂质体介导的基因转导效率是DEAE-Dextran和磷酸钙盐沉淀法的510倍。目前已合成的阳离子脂质体不少于20余种，其基本结构都由两部分组成。疏水性的脂肪酸链或胆固醇基构成的尾部和亲水性的带正电荷的头部。后者是阳离子脂质体的功能部位，它们与DNA的磷酸基结合或与细胞膜脂带负电荷的部分结合。阳离子脂质体的另一个组分为不带电荷的中性脂分子，也叫辅助脂，它们对提高转导效率有重要作用。DOPE是一种最重要的辅助脂。Farhood研究了DOPE在阳离子脂质体DNA转导过程中的作用。他们在DNA脂质体复合物转导细胞的同时，加入由DOPE/DC-Chol组成的空白阳离子脂质体，结果发现当加入一定量的空白脂质体后，其转导效率最大可增加8倍。中性脂质体和阴离子脂质体与DNA作用较为简单，主要是质粒DNA被脂质体包裹，而阳离子脂质体与DNA的作用则较为复杂，因此是当前的一个研究热点。目前认为阳离子脂质体与DNA有如下几种作用形式：DNA靠静电吸引力结合在阳离子脂质体的外表面； 带负电的DNA完全进入脂质体内部；线型DNA的周围包围着脂双层结构，DNA与脂质分子之间靠静电吸引而相互作用，但此时的脂质体已不具备完整性，脂分子呈线性排列在DNA的周围。脂质体与DNA的作用受其组成、大小、所带电荷、环境pH值、脂质体与DNA的比例等因素的影响。其中脂质体与DNA的比例对于转导效率至关重要，而且受体细胞的种类不同，两者的比例也随之改变。如DOTMA/DOPE (1:1)，脂质体与质粒pSV2CAT之比10:1时，其转导COS-7细胞的效率最高，而DC-Chol/DOPE (3:2)与pUCSV2CAT的比为6:1时，其遗传转导效率最高。脂质体介导DNA进入细胞的机制目前尚不十分清楚。Felgner认为脂质体是通过膜融合将DNA转导入细胞的。Pinnadunege则认为最可能的机制是通过细胞的吞噬作用，即脂质体和DNA的复合物被吞噬进入细胞内和溶酶体，然后阳离子脂质体在该处破裂而将DNA释放使之进入细胞浆。13.1.4 生物物理方法1电击法电击法利用高压电脉冲使细胞膜发生瞬间的可逆穿孔，从而使游离的外源基因穿过细胞膜而转移到细胞中去。许多真核与原核生物由于没有合适的遗传转化系统，无法进行有效的遗传操作。有的虽然已建立了转化系统，但转化效率低，且操作繁琐费时。电击法则较好地解决了这些问题。电击穿孔（简称电穿孔）操作对受体细胞产生的副作用小，从而保持活细胞的正常生理条件。电穿孔的脉冲参数和过程容易控制，强度适当的电脉冲不会使DNA和受体细胞受到任何损害，因此电击法是一种很有前途的基因转导方法。这种方法操作简单，转化效率高，没有细胞种属的限制，细胞电穿孔技术对各种类型的细胞都具有高效率、低毒性、普遍性和可控性的优点，目前已广泛应用于细胞工程和基因工程等方面，成为实现动、植物细胞转导的一种常用方法。He等10,40利用该方法成功的进行了硬粒小麦与大麦杂交种及面包小麦的遗传转化，得到了外源基因正确表达的转基因植株。Li等38 Li B J, Xu X P, Shi H P, et al. Introduction of foreign genes into the seed embryo cells of rice by electroinjection and the regeneration of transgenic rice plants. Sci. China Ser. C, 1991, 34: 923931成功地利用该方法获得了转基因水稻植株。李克勤等39 李克勤，李春海，颜春洪人组织型基质金属蛋白酶抑制剂-1在Pichia pastoris酵母中重组表达研究中国生物化学与分子生物学报，2001，17（2）：160164则利用电击法将人组织型基质金属蛋白酶抑制剂-1在Pichia pastoris酵母中重组表达。电穿孔过程本身是一种物理过程而不是生物过程，在电击法转化中，DNA进入受体细胞虽然受外加电压的影响，但主要是由外源DNA与受体细胞共同完成的，因而是典型的生物物理过程。1990年Chang等用快速冰冻蚀刻揭示了细胞电穿孔的动力学过程。结果显示电穿孔触发细胞通透性增加的初始过程发生在数毫秒内，电击孔洞的直径约为20nm40nm，接着引发了细胞内物质外喷，在20毫秒内形成了边界约为20nm100nm的膜孔洞，并在数秒内保持不变。细胞在缓冲液中悬浮，好像是一种绝缘的由双面含有水溶液的细胞组成的结构，施加电场后则会使细胞膜上的电荷分离，于是产生了横跨膜的电位差，异性电荷在细胞膜上相互吸引，使细胞膜变薄，在某一临界电场强度下，引起细胞膜的破裂和气孔的形成，使遗传基因转移到细胞中去。如果电场强度和脉冲宽度适当的话，场强移去后，细胞破裂和形成的孔可以愈合，应用电击法进行基因转移的过程见图13-3。细胞膜的可逆电穿击现象不同于膜的力学破裂，其效应完全是可逆的。即撤去电场后，细胞膜将迅速恢复到原来的高电阻率和低透过性状态，但是当电场强度超过临界击穿电压的2-6倍或膜在电场中的时间过长，则会导致膜的不可逆破裂。图 13-3 电击法基因转移模式图40 徐宝强，刘建民，袁其平，等电击法转移系统研究天津理工学院学报，1994，10（4）：5358影响电击法基因转导效率的因素很多，如电压电场强度、电脉冲波形、脉冲持续时间、电融合缓冲溶液的渗透压、细胞类型、细胞缓冲液的介质阻抗、DNA分子的组成形式等41 He G Y, Lazzeri P A. Analysis and optimisation of DNA delivery into wheat scutellum and Tritordeum inflorescence explants by tissue electroporation. Plant Cell Reports, 1998, 18 (1-2): 6470。其中关键是能否给出适量的高压电冲击使细胞膜产生电介质可逆瞬时穿孔，从而为外源基因导入细胞提供条件。2胚胎干细胞法胚泡发育期的胚细胞是可以人工培养增殖的，当把这种胚细胞重新导入另一胚泡期的胚之后，它仍然保持着分化成其它类型细胞的能力，这种细胞叫做多功能胚胎干细胞，简称ES细胞。ES细胞系的建立，首先要分离胚泡的内层细胞团，将胚泡放入培养皿中分离内层细胞团，再用胰蛋白酶处理分散细胞，然后放入饲养细胞上培养。ES细胞在无饲养层的平板中培养会持续分化成肌细胞、神经细胞等多种专门功能的细胞，只有在含有成纤维细胞的饲养层或含有白血病抑制因子的饲养层上生长时才能保持其未分化状态并保持ES细胞的潜在分化能力。在对ES细胞的培养过程中，人们可以对它进行基因工程操作，而不改变它的分化能力，研究人员通常利用反转录病毒载体、电击法等多种方法将外源基因导入ES细胞。这样，将基因转入并整合到ES细胞基因组内的某一非必要基因位点上，然后对这些细胞进行筛选培养，用于产生转基因动物。这种方法避免了在DNA微注射法与反转录病毒载体方法中存在的基因随机整合的问题。用于ES细胞的DNA载体一般带有定点整合元件。这个整合位点应该选定在基因组内编码非必需产物的地方，以减少整合的DNA对细胞正常发育及功能的干扰。转入基因必需要整合在基因组中可以进行转录的区域。同时，DNA载体转导培养的ES细胞中，有的是DNA分子整合到了错误的位点上，有的是整合到正确的位点上，还有大量ES细胞根本就未发生整合。通常采用一种叫正-负选择的策略来富集整合正确的ES细胞，即首先用正选择的方法挑选所用整合DNA的ES细胞，再用负选择方法淘汰整合错误的细胞。正确整合的转基因胚胎干细胞系经培养后就可以移入胚泡期的胚胎。将这些胚胎移植到假孕的母鼠子宫内，这样产生的部分子代的生殖细胞就是由转基因的ES细胞形成的。然后在得到的转基因鼠间进行杂交，子代再配对杂交。这样，将有1/4的得到整合的转基因鼠，即转入基因可以和正常基因一样分离。13.2纳米技术在基因转导中的应用基因转导过程中涉及到的转化元件及辅助元件均为天然的纳米材料，本节将概述纳米技术在DNA和RNA等转导中的应用。13.2.1 在DNA转导中的应用在基因转导过程中外源基因及其构建体多为纳米尺度的DNA分子，因此这种转导实际上大多涉及到纳米技术。在前述的各种转导方法中，除了显微注射、农杆菌转导、逆转录病毒法外，其它各种转导技术都是利用纳米级载体携带外源基因进入受体细胞，因此属于典型的纳米操作范畴。基因枪法的实质是纳米或微米级的子弹荷载DNA分子，以高速穿透细胞膜，从而将DNA分子运载进入细胞染色体DNA中。聚乙二醇法、磷酸钙法、脂质体法都相当于应用一种可以进入细胞的纳米级DNA载体介导外源DNA的转化。电击法则是应用纳米技术在受体细胞膜上形成纳米级孔洞，使之成为DNA进入受体细胞的通道。随着对DNA转导机理研究的不断深入，用于外源DNA转导的新系统包括纳米级基因转化介导系统不断出现42 Seeman N C. Nanoengineering with DNA. New York Univ, New York, NY, USA, 1993: 123134。到目前为止，已经应用天然的或合成的介质如聚乙烯醇、聚丙烯酯、多糖衍生物（淀粉、果胶和藻酸盐）等合成了一批新型的磁性纳米粒，进行基因转导、靶向给药以及DNA的提取43 Bergemann C, Mueller-Schulte D, Oster J, et al. Magnetic ion-exchange nano- and microparticles for medical, biochemical and molecular biological applications. J. Magn. Magn. Mater., 1999, 194(1): 4552等。在基因转导过程中，特别是在基因治疗方面，如何安全、高效地将外源基因导入到受体细胞中是一个较为困难的问题。一方面，要尽可能多地将外源基因导入到靶细胞中，以提高该区域的外源基因浓度；另一方面，进入受体细胞的外源基因必须能够抵抗核酸酶的分解作用，并能在一段较长的时间内发挥作用。目前研究较多的转导系统多为病毒介导的DNA转导系统，但是这种系统存在着潜在的安全问题。另一种系统是脂质体介导的DNA转导系统，其特点为转导效率高、毒性小、无潜在感染及能使目标基因转移到特定组织等。随着纳米技术的发展，人们将能够制造具有各种特殊性能的纳米粒，因此纳米粒必将成为基因负载的理想选择之一。目前，人们在该领域已经进行了不少研究，主要用天然的或者具有生物相容性、生物可降解的高聚物纳米粒作为载体介导外源DNA分子的转导。1天然高分子纳米基因载体 Truong-Le等人将DNA与明胶共凝聚再与转铁蛋白共价连接制成纳米基因载体，纳米球中DNA的最佳转导条件应有钙和转铁蛋白的存在。用此方法在人类气管上皮细胞（9HTEo）中转导囊性纤维化调节因子(CFTR)的编码基因，有50%的细胞表达了CFTR，而且缺乏CFTR介导的氯转运的人类支气管上皮细胞(IB-3-1)，用该基因转导后的转化体获得了氯转运能力44 Truong-Le VL, Walsh SM, Schweibert E, et al. Gene transfer by DNA-gelatin nanospheres. Arch. Biochem. Biophys., 1999, 361(1): 4756。Mao等人把DNA与壳聚糖共团聚制成壳聚糖-DNA纳米粒子，可以实现DNA在几种细胞中的转导45 Mao HQ, Roy K, Troung-Le VL, et al. Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers: synthesis, characterization and transfection efficiency. Journal of Controlled Release, 2001,70(3): 399421。日本的Honma K.等人在外伤治疗临床中证明，改性胶原是安全可靠的外源基因导入载体，他们又用改性胶原与cDNA复合制成纳米粒，预先涂敷于微孔培养板孔中，再接种哺乳动物细胞，在不加任何转导试剂的前提下，这些纳米复合物能够有效地转入细胞，并实现长期表达，不出现外源基因整合到受体细胞的染色体中的现象。这些点于微孔中的复合物能够长期稳定、以剂量依赖方式转录和表达报告基因。他们认为，这种方法可以用于大通量基因功能筛选46 Honma K, Ochiya T, Nagahara S, et al. Atelocollagen-based gene transfer in cells allows high-throughput screening of gene functions. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001,289(5): 10751081。2合成高分子纳米基因载体研究表明47 Cohen H, Levy R J, Gao J, et al. Sustained delivery and expression of DNA encapsulated in polymeric nanoparticles. Gene Ther., 7(22): 18961905，用poly(DL-lactide-co-glycolide) 多聚体制成直径为600 nm的微粒包裹编码碱性磷酸酶基因的质粒DNA，进行DNA转导，载体的DNA包装效率可达到70%，能够在为期一个月的时间内保持其结构及功能的完整性，并能持续释放外源DNA。这种方法与直接注入裸露的DNA相比，其碱性磷酸酶基因的表达效率有很大提高。同时，表达水平随着时间的推移而有所提高。虽然到目前为止，与阳离子脂质体介导的基因转导相比，该方法的最大转导效率仍然较低，但其长时间的表达效率（7至28天）却为脂质体转导法的10100倍。用N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide (HPMA) 与 2-(trimethylammonio