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第十五章 酶类药物 第一节 酶类药物的原料来源 一、原料选择 （1）不同酶的用料选择 乙酰化酶（鸽肝）、凝血酶(牛血）、透明质酸酶（羊 睾丸）、溶菌酶（鸡蛋清），超氧化物歧化酶（血、肝 ） （2）注意不同生长发育情况及营养状况 （3）原料来源丰富 （4）从简化提纯步骤着手 （5）如用动物组织作原料，应在此动物宰杀后立即取 材。 酶类药物 二、微生物酶制剂高产菌株的选育 菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。优良菌种不仅 可以提高酶制剂产量和发酵原料的利用率，而且还与 增加品种，缩短生产周期，改进发酵和提炼工艺条件 等密切相关。优良菌种获得的三种途径： （1）从自然界分离筛选。 （2）用物理或化学的方法处理，诱变。 （3）用基因重组与细胞融合技术。 三、微生物酶制剂生产的发酵技术 （一）培养基 1.碳源 （甘薯、玉米、麸皮、米糠） 2.氮源 （豆饼、花生饼、菜籽饼、硫酸铵、尿素） 3.无机盐 4.生长因子和产酶促进剂 （二）培养方法 1.固体培养法 固体培养法也称麸曲培养法，该法是利用麸皮或米糠为 主要原料，另外视需要添加其它谷糠、豆饼等，加水 拌成含水适度的半固态物料作为培养基。 2.液体培养法 液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁殖和产 酶。根据通气方法的不同，又分为液体表面培养和液 体深层培养。深层通气培养是目前应用最广的方法。 3.影响酶产生的一些因素 除培养基，发酵工艺参数对产酶的影响也十分明显。 （1）温度 （2）pH （3）通气 （4）搅拌 （5）泡沫 发酵过程中，由于发酵液受到强烈的通气搅拌，培养基 中某些成分的变化及代谢中产生气体，会形成较多的 泡沫，而且气泡不易消失，是由于培养基中蛋白质分 子排在气泡表面形成一层吸附膜，聚集成泡沫层之故 。 消泡剂：天然油类，醇类，脂肪酸类，胺类，酰胺类， 磷酸酯类，金属皂类，聚硅氧烷等。 （6）添加诱导剂和抑制剂 诱导酶 抑制剂（表面活性剂） 第二节 酶类药物的提取和纯化 一、生物材料的预处理 （一）动物材料的预处理 1.机械处理 2.反复冻融 3.丙酮粉 组织经过丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以减少 酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使得蛋白质与 脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到 溶液中。 （二）微生物的预处理 要是胞外酶，则除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取 酶。但对胞内酶则需要将菌体细胞破壁，制成无细胞 的悬浮液后再行提取。 1.干燥法 （1）空气干燥 （2）真空干燥 （3）冷冻干燥 2.机械法 （1）研磨法 （2）组织匀浆法 （3）超声波法 （4）高压匀浆法 3.酶法处理 二、酶的提取 1.水溶液法 常用稀盐溶液或缓冲液提取。经过预处理的原料，包括 组织糜，匀浆，细胞颗粒以及丙酮粉等，都可以用水 溶液抽提。 许多酶再蒸馏水中不溶解，而在低盐浓度下易溶解，所 以提取时加入少量盐可提高酶的溶解度。 2.有机溶剂法 某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂质牢固 结合，用水很难提取，为此必须除去结合的脂质，且 不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇。丁醇具有 以下特点： （1）亲脂性强，特别是亲磷脂的能力； （2)兼具亲水性，在0在水中的溶解度为10.5%；（ 3）在脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。 3.表面活性剂法 三、酶制剂的工业提取法 (一)发酵液的预处理及过滤 絮凝剂 （二）酶液的脱色 0.11.5%活性炭 （三）盐析法 （四）有机溶剂法 （五）喷雾干燥直接制备粉末酶制剂 四、酶的纯化 酶比活，总活力回收 （一）杂质的除去 酶提取液中，除所需酶外，还含有大量杂蛋白，多糖， 脂类和核酸等，需要除去。 （1）pH和加热沉淀法 利用蛋白质酸碱变性性质的差异可以通过调pH和等电点 除去某些杂蛋白，也可以利用不同蛋白质对热稳定性 的差异。（SOD酶） （2）蛋白质表面变性法 利用蛋白质表面变性性质的差别，也可以除去杂蛋白。 制备过氧化氢酶，加入氯仿除杂蛋白。 （3）选择性变性法 利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。 （4）核酸沉淀剂法 在微生物制备酶时，常含有较多核酸，可用核酸酶降解 ，离心分离，用核酸沉淀剂如三甲基十六烷基溴化铵 ，硫酸链霉素等。 （5）将酶与底物结合，用加热法除去杂蛋白。近来发现 ，酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，稳定性大大 提高，这样可以用加热法除去杂蛋白。 （二）脱盐和浓缩 1.脱盐 （1）透析 玻璃纸袋 （2）凝胶过滤 Sephadex G10 2浓缩 （1）冷冻干燥法 （2）离子交换法 （3）超滤法 （4）凝胶吸水 （三）酶的结晶 把酶提纯到一定纯度以后，可使其结晶。 蛋白质分子多数处于含水的环境中，蛋白质分子与水分 子结晶形成稳定的水合物。当蛋白质的浓度非常高的 时候，溶液中没有足够可以与蛋白质结合的水分子用 于形成水合物，在蛋白质分子之间也没有足够的水分 子可以将它们充分隔开，于是蛋白质就以无定形沉淀 或结晶的形式从溶液中析出。 1.酶的结晶方法 （1）盐析法 在适当的pH、温度等条件下，保持酶的稳定性，慢慢改 变盐浓度进行结晶。结晶时采用的盐有硫酸铵，柠檬 酸钠，乙酸铵，硫酸镁等。利用硫酸铵结晶时一般是 把盐加入到一个比较浓的酶溶液中，并使溶液微呈浑 浊为止。然后放置，并且非常缓慢地增加盐浓度。操 作要在低温下进行，缓冲液pH要接近酶的等电点。 （2）有机溶剂法 酶液中滴加有机溶剂，有时也能使酶形成结晶。结晶用 溶剂有：乙醇，丙醇，丁醇，乙腈，异丙醇，二恶烷 ，二甲亚砜，二氧杂环已烷。 （3）复合结晶法 有时可以利用某些酶与有机化合物或金属离子形成复合 物或成盐的性质来结晶。 （4）透析平衡 利用透析平衡进行结晶也是常用方法之一。 （5）等电点法 2.结晶条件的选择 （1）酶的纯度 酶只有达到相当纯度后才能结晶。酶的纯度越高，结晶 越容易，长成大的结晶可能性也越大。 （2）酶的浓度 结晶母液尽可能保持高的浓度。酶的浓度越高越有利于 溶液中溶质分子间的相互碰撞聚合，形成结晶的机会 也越大。 （3）温度 （4）时间 （5）pH 有时相差0.2pH，只能达到沉淀，而不能达到晶体。 （6）金属离子 许多金属离子能引起或有助于酶的结晶。 （7）晶种 （8）结晶器皿处理。 （四）酶分离和纯化工作中的注意事项 1.防止酶蛋白变性 2.防止辅因子的流失 3.防止酶被蛋白水解酶降解 第三节 酶类药物 一、药用酶类的概述 早期酶制剂主要用于治疗消化道疾病，烧伤及感染引起 的炎症。 （一）促进消化酶类 （二）消炎酶 （三）与纤维蛋白溶解作用相关的酶类 （四）抗肿瘤的酶 （五）其它药用酶 二、重要的酶类药物 （一）胃蛋白酶 胃蛋白酶广泛存在于哺乳动物的胃液中。 1.组成（结构）、性质 药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的化合物，含有 胃蛋白酶，组织蛋白酶，胶原酶等，为粗制的酶制剂 。 性状：外观为淡黄色粉末，等等 临床上主要用于因食蛋白过多，引起的消化不良及病后 恢复期消化机能减退等。 2.生产工艺 （1）工艺路线 猪胃粘膜 自溶液上清液 成品 自溶，过滤 H2O, HCl 氯仿 脱脂 浓缩干燥 （2）工艺过程 自溶、过滤 在夹层锅内预先加水100L及盐酸，加热至50时，加入 200kg猪胃粘膜，快速搅拌使酸度均匀，保持 4548,消化34小时。用纱布滤去未消化的组织蛋 白，收集滤液。 脱脂、去杂质 将滤液降温至30以下，静防2448h，使杂质沉淀除去 ，得到脱脂酶液。 浓缩干燥 取脱脂酶液，在40以下浓缩到原体积的1/4，真空干燥 ，球磨，得到产品。 （四）尿激酶 尿激酶是一种碱性蛋白酶，由肾脏产生，主要存在于人 和哺乳动物的尿中。人尿平均含有56U/ml。 1.组成性质 （1）尿激酶有多种分子量形式，主要有31300、54700 两种。尿中的尿胃蛋白酶原在酸性条件下可以激活生 成尿胃蛋白酶，后者可以把分子量54700的天然尿激 酶降解为分子量为31300尿激酶。 （2）尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，血纤维蛋白溶 酶原是它唯一的天然蛋白质底物，它作用于精氨酸 缬氨酸键使得纤溶酶原转为纤溶酶。 （3）尿激酶的pI为pH8-9. 临床上，尿激酶已经广泛应用于治疗各种新血栓形成或 血栓梗塞疾病。 2.生产工艺 （1)工艺路线： 男性尿 10pH8.5 上清尿液 沉淀 pH55.5 酸化 酸化尿 硅藻土吸附 硅藻土吸附物 洗涤 硅藻土柱 洗脱 洗脱液 去热源，去色素 pH8.0 流出液 CMC柱 洗脱液 透析液 产品 （2）工艺过程 收尿 收集男性尿 沉淀处理 尿液冷至10以下，用NaOH调pH至8.5,静 置1h，虹吸上清液。用盐酸调至pH5.05.5。 硅藻土吸附 处理好的尿液加入1%尿量的硅藻土，于 5C下搅拌吸附1h。 洗脱 硅藻土吸附物洗涤装柱，先用0.02%氨水加 0.1mol/L氯化钠洗脱，当洗脱液油清变混时开始收集 除热源、去色素 CMC浓缩 透析除盐 （九）超氧化物歧化酶（SOD） 超氧化物歧化酶是一种重要的氧自由基清除剂，作为药 用酶在美国、德国、澳大利亚等国已有产品。由于 SOD能专一性去除超氧阴离子自由基，故引起国内外 生化界和医药界的极大关注。目前临床上应用集中在 自身免疫性疾病上如类风湿关节炎，红斑性狼疮，皮 肌炎等 1.组成性质 SOD属金属酶，其性质不仅取决于蛋白质部分，还取决 于活性中心金属离子的存在。按照金属离子的不同， SOD有Cu，ZnSOD，MnSOD和FeSOD。 SOD是一种金属蛋白，因此它对热，pH及在某些性质上 表现出异常的稳定性。 对热稳定性 SOD对热稳定，天然牛血SOD在75C下加 热数分钟，其酶活性丧失很小。但SOD对热稳定性与 溶液的离子强度有关。 pH对SOD的影响 SOD在pH5.310.5范围稳定。 吸收光谱 金属辅基与酶活性 含金属配基Cu与Zn，Zn仅与酶分子结构有关，而与催化 活性无关，而Cu与催化活性有关，透析法除去Cu则酶 活全部丧失，一旦重新加入Cu，酶活性又可恢复。 2.生产工艺 分离纯化SOD常根据原料，种类和性质的差异而有所不 同。 （1）牛红细胞提取Cu，ZnSOD的生产工艺： 新鲜牛血 收集 除血浆 离心 红细胞 浮选 2NaCl 干净红细胞 溶血 溶血液 去血红蛋白 乙醇、氯仿 上清 分级沉淀 丙酮 沉淀物 热变性 SOD粗酶液 超滤 浓缩液 柱层析 精制浓缩液 冷冻干燥 冻干粉 （2）工艺过程 1）收集、浮选 取新鲜牛血，离心除去血浆。 2）溶血、去血红蛋白：干净红细胞加水溶血30min，然 后加入0.25倍体积的乙醇和0.15倍体积的氯仿，搅拌 15min，离心去血红蛋白，收集上清液。