银叶蓝钟花茎尖组织培养研究-本科毕业论.doc

科类 农学 编号（学号）20060381 本科生毕业论文（设计）银叶蓝钟花茎尖组织培养研究Study on Meristem Culture of Cyananthus argenteus Marq汪瑞波指导教师 范眸天 职称 教授 云南农业大学 昆明黑龙潭 650201学 院： 园林园艺学院 专 业： 园艺 年级： 2006级论文（设计）提交日期： 2010年5月 答辩日期：2010年6月答辩委员会主任： 李文祥 教授 云南农业大学2010年6月银叶蓝钟花茎尖组织培养研究汪瑞波（云南农业大学园林园艺学院，昆明 650201）摘 要以银叶蓝钟花茎尖为外植体，以期筛选出诱导愈伤组织分化和丛生芽生根的最佳培养基。同时研究了银叶蓝钟花组织培养中材料的消毒时间对消毒效果的影响。试验结果表明，培养基MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.05mg/L是愈伤组织诱导分化相对较好的培养基；培养基MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.6mg/L是银叶蓝钟花生根培养较好的培养基。在以75%的酒精消毒30秒后，用0.1%的升汞消毒8分钟，对实验材料的消毒效果相对较好。关键词：银叶蓝钟花；消毒时间；诱导率；玻璃化Study on Meristem Culture of Cyananthus argenteus MarqWang Ruibo(Department of Horticulture and landscape, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201,China)ABSTRACTThe meristem tip of Cyananthus argenteus Marq as explants to induce callus selected and multiple shoots the best medium for rooting. At the same time of Cyananthus argenteus Marq spent tissue culture material disinfection time disinfectant effect. Design test results showed that the medium MS +6- BA3.0mg / L + NAA0.05mg / L is a relatively good differentiation of callus induction medium; medium MS +6- BA0.3mg / l + NAA0.6mg / L, is a suitable medium for rooting ，75% alcohol at 30 seconds after disinfection with 0.1% HgCl2 for 8 minutes, the experimental materials, sterilization was better.Key words: Cyananthus argenteus Marq; time of disinfecting; inductivity; vitrification银叶蓝钟花茎尖组织培养研究1 前言银叶蓝钟花（Cyananthus argenteus Marq）又名总花蓝钟花，为桔梗科（Campanulaceae）蓝钟花属（Cyananthus Wall）植物。蓝钟花属是中国喜马拉雅区系的典型植物1。蓝钟花属是桔梗科中唯一一个子房完全上位的属。从子房对花萼和花冠来说均上位，其在本科中是一个比较特殊的成员，可能是该科中一个较为原始的类型2。银叶蓝钟花，多年生草本，茎多条簇生，长15-25cm，小枝纤细，叶互生，狭披针形，背面密被银白色棉毛或刚毛。具短柄，花单生于茎顶，花梗极短，花萼管状，萼齿狭三角形，花冠管状，蓝紫色，裂片狭长圆形。习性：生长在海拔2900-3600m的干旱山坡、沙丘、或松林间沙地；其生长的土壤类型为中性或偏碱性的沙壤土或灌丛草甸土；从野生环境来看，该种植物喜光，一般常见于路边向阳坡地，植株具有很好的抗旱能力3。银叶蓝钟花花冠色彩艳丽、花枝繁茂，花期时期仅见蓝花花朵密被于枝十分漂亮，具有很高的观赏价值，将其作为园林植物的开发前景广阔4。目前，对该属植物的研究尚少，仅限于系统学研究5。本实验探讨了银叶蓝钟花脱毒组织培养中消毒处理最佳时间，以及愈伤组织诱导分化和丛生芽诱导生根的培养基配方，以缩短培养周期和降低培养成本，为银叶蓝钟花试管苗的大规模生产提供了科学的依据。2 材料与方法2.1 供试材料材料取自云南农业科学院花卉研究所基地上栽培的银叶蓝钟花。2.2 试验时间 实验于2009年4月到2010年5月在云南农业科学院花卉研究所内进行。2.3 试验方法将采回的生长良好的茎尖进行消毒，接种到培养基中，观察记录。2.3.1 材料的消毒处理用自来水冲洗材料，洗净表面的尘土，置于超净工作台上，以75%的酒精消毒30秒时间，再用无菌水冲洗3次，将材料分组分别用0.1%升汞消毒6分钟、8分钟、10分钟，再用无菌水冲洗4次。2.32 初代培养 将消毒处理过的材料，接种到培养基中。培养基以MS为基本培养基6，添加以6-BA,NAA(双因子)不同浓度组合的植物激素，调节PH到5.7-5.87。设计9个浓度梯度1-9（见表一），在每一种浓度梯度下接种十瓶。培养温度为23，光照强度为3000lx,每日光照14个小时8。表一 （6-BA与NAA双因子不同组合的九个浓度梯度）Table 1 (6-BA and NAA combinations of nine different two-factor concentration gradient)NAA与6-BA配合6-BA3.0(mg/L)6-BA4.0(mg/L)6-BA5.0(mg/L)NAA0.05(mg/L)3NAA0.1( mg/L)NAA0.2( mg/L)统计公式：愈伤组织诱导率=愈伤组织数/接种的外植体数100%；2.3.2 生根培养以初代培养长出的丛生芽作为转接材料。不需经过表面消毒9，直接将丛生芽从初代培养的愈伤组织上切下，接入以MS为基础培养基，6-BA固定浓度为0.3mg/L,NAA配合浓度分别为为0.4，0.5，0.6mg/L(见表二)。调节PH到5.7-5.8。在每一个浓度梯度下接15瓶，每瓶接2个丛生芽10。培养温度为23，光照强度为3000lx,每日光照14小时。表二 生根培养的浓度梯度Table 2 The concentration gradient of rooting6-BA与NAA配合NAA0.4(mg/L)NAA0.5(mg/L)NAA0.6(mg/L)6-BA0.3(mg/L)3 结果和分析3.1 消毒时间对实验结果的影响如表三所示，用相同的消毒方法，不同的消毒时间处理材料，分别是6分钟、8分钟、10分钟。10天后观察消毒结果。消毒6分钟的材料存活率为50%，其污染较为严重，为50%；消毒时间为8 分钟的材料存活率为80%，死亡的材料变褐，但污染率为10%；消毒处理10 分钟的材料全部死亡，发现变为褐色，材料严重受到损伤，但未见到受污染。由于材料茎尖外部叶片茸毛较多且长期暴露在空气中，带菌较多，消毒较困难。增加消毒时间会将外植体杀死，减少消毒时间，污染率会升高11。试验结果表明，75%的酒精消毒30秒时间，再用无菌水冲洗三次，0.1%的升汞消毒8分钟，用无菌水冲洗4次，相对效果较好。表三 消毒时间及效果Table 3 the effect of disinfection time消毒时间接种数成活数成活率%污染率%6分钟301550508分钟3024801010分钟300003.2 银叶蓝钟花愈伤组织的诱导和分化在9个浓度梯度下接种的外植体都有愈伤组织的产生，并且都不同程度的分化出丛生芽。如表4,5所示，浓度、这三组愈伤组织诱导率较高，分别为80%、75%、70%，而且、两组愈伤组织体积较大，生长旺盛；浓度这一组产生的愈伤组织体积较小，结构致密。浓度、这三组诱导率较低，都为15%，愈伤组织体积小，叶片颜色较浅。同时也观察到出现玻璃化的现象。其中在浓度、三组中分化的丛生芽也都有不同程度的玻璃化现象出现，即这一组的玻璃化程度最高。植物生长激素配比不协调，细胞分裂素浓度过高则容易产生玻璃化现象12。在这一组中，6-BA浓度相对较高，可能是使其玻璃化程度较高的原因。所以，综合比较，本实验中以浓度，即MS+0.05mg/L NAA+3.0mg/L 6-BA为银叶蓝钟花愈伤组织诱导分化的最佳培养基。表四 6-BA与NAA配合对银叶蓝钟花愈伤组织诱导分化的影响Table 4 6-BA and NAA on Cyananthus argenteus Marq induction and differentiation of callus浓度梯度接种数诱导数诱导率%20168020315201260201575201365201470203152031520945表五 形成的愈伤组织和玻璃化情况Table 5 callus and vitrification浓度梯度愈伤组织特点丛生玻璃化情况体积较大 疏松成绿色 生长旺盛玻璃化程度较轻体积较大 致密呈绿色 玻璃化较严重体积较大 疏松成浅绿色 生长较旺盛程度轻较小 成绿色 结构致密 程度较轻较小 致密呈绿色玻璃化较严重体积大 疏松成黄绿色 生长旺盛玻璃化最严重体积小 疏松 叶片变褐玻璃化程度较严重较小 疏松成浅绿色玻璃化程度较高体积小 致密呈绿色玻璃化严重3.3 银叶蓝钟花生根培养选取初代培养中长势较好的丛生苗接种到生根培养基上进行生根培养。一般是2-3cm。30天后，观察根的长势，记录如表六所示。结果表明，在这3个浓度梯度下，以培养基MS+0.3mg/L 6-BA+0.6mg/L NAA为较好的生根培养基，生根率达80%，且根的愈伤化程度较轻，根粗，根量适中。表六 6-BA与NAA配合对生根培养的影响Table 6 with 6-BA and NAA on rooting of浓度梯度接种数生根数生根率%生根情况15640基部愈伤化较轻 根粗壮15640基部愈伤化严重 根细长151280基部愈伤化比较轻 根壮4 讨论4.1 不同消毒时间对愈伤组织诱导分化的影响 由于材料茎尖茸毛多，消毒剂不易渗透，茎尖容易污染，延长消毒时间茎尖又会褐变死亡，在消毒液中加入吐温（一种乳化剂）也没有很大作用13。本实验中分别采取用0.1%的升汞消毒处理6分钟、8分钟、10分钟，再用无菌水消毒四次作为对比。消毒时间如果为6分钟，由于消毒不充分而导致材料的污染加剧；消毒10分钟，发现材料有变黑的斑块，刀片切口处严重受伤成黑色。对材料造成不可逆的伤害。试验结果表明，以75%的酒精消毒30秒，再用无菌水冲洗三次，0.1%升汞消毒8分钟，用无菌水冲洗四次，未使材料受到伤害，且保证污染率较低，消毒效果较好。4.2 试验中玻璃化现象在植物生长激素不协调，细胞分裂素浓度过高的情况下会有玻璃化现象的产生12。本试验采用了NAA和6-BA两种外源激素的不同浓度配比诱导银叶蓝钟花愈伤组织产生和分化。在9个不同的NAA和6-BA植物激素浓度配比下对愈伤组织进行诱导分化，都有不同程度的玻璃化现象产生。而在丛生苗诱导生根时，玻璃化现象明显减少。造成玻璃化现象的可能原因有2个：银叶蓝钟花内源激素的干扰、；人为原因造成培养基中的外源激素配比不协调。本试验表明在不排除实验材料的内源激素影响条件下，NAA和6-BA的浓度比为1/60是诱导愈伤组织产生和分化相对较好的浓度配比；在诱导生根培养时NAA和6-BA的浓度比为2/1，为较好的浓度配比。4.3 NAA与6-BA配合对生根培养的影响试验结果表明，NAA与6-BA的浓度比为2/1是银叶蓝钟花较好的生根培养基。根据高的生长激素和细胞分裂素浓度比能够促进生根14，若NAA/6-BA的比例大于2，则可提高银叶蓝钟花的生根率。5 结论 本实验结果为：以75%的酒精消毒30秒，再用无菌水冲洗三次，0.1%升汞消毒8分钟，用无菌水冲洗四次，未使材料受到伤害，且保证污染率较低，消毒效果较好；培养基MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.05mg/L是愈伤组织诱导分化相对较好的培养基；培养基MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.6mg/L是银叶蓝钟花生根培养较好的培养基。参考文献1 洪德元，马黎明.蓝钟花属的系统学研究.植物分类学报，1991,29（1）:25-51 2 洪德元，桔梗科的地理分布：关于分布中心问题.植物分类学报，1995,33（6）：521-5363中国科学院昆明植物研究所.云南植物志（第5卷）.蓝钟花属M.北京：科学出版社.4解玮佳，云南特有植物银叶蓝钟花的引种栽培.江西农业学报，2008,20（8）：33-345康隶善，中国植物志（第73卷）.蓝钟花属(M).北京：科学出版社，1985.5-286巩振辉 申书兴 植物组织培养.化学工业出版社 2007年8月第一版.7石晓东 高润梅 植物组织培养. 中国农业科技出版社 . 2006年5月第