《ATP酶活性》word版.docx

河南师范大学本科毕业论文河南师范大学本科毕业论文 学号： 0904314065罗非鱼肝脏ATP酶活性测定及推测其对罗非鱼不耐低温的影响学院名称： 水产学院 专业名称： 水产养殖 年级班别： 09级水产1班 姓 名： 邢 莽 指导教师： 李学军 2013年2月罗非鱼肝脏ATP酶活性测定及推测其对罗非鱼不耐低温的影响 摘 要：本文以罗非鱼为实验对象，在室内可控环境下，研究了不同温度下罗非鱼肝脏ATP酶活性。实验设定的4个温度阶梯组为9（常温）、15、19、22，以及两次极性测试，养殖7天后取样。测定罗非鱼肝脏Na+-K+-ATPase、Mg+-ATPase、Ca+-ATPase、Ca+Mg+-ATPase的活性。实验结果：Na+-K+-ATPase、Ca+Mg+-ATPase在15时活性非常高，与其他温度差异明显；Mg+-ATPase、Ca+-ATPase的活性在9（常温）时比其他温度高，但是差异没Na+-K+-ATPase、Ca+Mg+-ATPase如此明显。结论：Na+-K+-ATPase、Ca+Mg+-ATPase活性可能是影响罗非鱼不耐低温的因素。关键字：罗非鱼；匀浆；线粒体提取，酶促反应；定磷；ATP酶活性；不耐低温。前 言罗非鱼为一种中小形鱼。现在它是世界水产业的重点科研培养的淡水养殖鱼类，且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。原产于非洲，属于慈鲷科之热带鱼类，和鲈鱼相似。通常生活于淡水中，也能生活于不同盐份含量的咸水中，可以存活于在湖，河，池塘的浅水中。它有很强的适应能力，。绝大部分罗非鱼是杂食性，常吃水中植物和碎物。此鱼在面积狭小之水域中亦能繁殖。甚至在水稻田里能够生长。罗非鱼是以植物为主的杂食性鱼类，其次是浮游植物、浮游动物和少量底栖动物。罗非鱼耐低氧能力很强，窒息点为0.070.23毫克/升，水中溶氧1.6毫克/升时，罗非鱼仍能生活和繁殖。罗非鱼性成熟早，产卵周期短，口腔孵育幼鱼，繁殖条件要求不高。罗非鱼的生存温度范围为1535。当水温低于15时，罗非鱼处于休眠状态。罗非鱼最高临界温度约4041，最适宜生长温度为2832，罗非鱼繁殖温度在20以上。笔者对4个实验温度阶梯下罗非鱼肝脏Na+-K+-ATPase、Mg+-ATPase、Ca+-ATPase、Ca+Mg+-ATPase 四种ATP酶进行活性测定，试比较分析ATP酶活性对于罗非鱼不耐低温是否有影响。1 材料和方法1.1 实验试剂与仪器HH系列恒温水浴锅（江苏金坛中大仪器厂）；中佳SC-04低速离心机；中佳KDC-160HR高温冷冻离心机；722S可见分光光度计；ATP酶测试盒50T(南京建成生物工程研究所第一分所)；罗非鱼（河南师范大学水产养殖基地）1.2 实验鱼肝脏提取选择罗非鱼120条，分成4组，每组30条，养于4个鱼池。4个鱼池分别设置温度为15，19，22和常温。 至少养殖一个星期。到达限定时间后，解剖全部30条罗非鱼,取其肝脏放于离心管中，编号1-30，待用。1.3 肝组织匀浆的制备取肝脏在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重取0.5g于烧杯中，用移液管量取0.86%的冷生理盐水，生理盐水的体积总量应该是组织重量的9倍，即4.5g（450ul），用移液枪量取总量的2/3的生理盐水于烧杯中，用眼科小剪刀尽快剪碎肝脏组织块。将剪碎的肝脏组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3冷生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的烧杯中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（68分钟），充分研碎，使肝脏组织匀浆化（10%组织匀浆），放入离心管中待用。将全部离心管编号1-30。1.4 线粒体的提取 将制备好的10%的肝组织匀浆，以1000r/min（中佳SC-04低速离心机）离心10分钟，弃沉淀，取上清液以10000r/min（中佳KDC-160HR高温冷冻离心机）离心15分钟，沉淀物为线粒体。 用移液枪量取1000ul冷生理盐水加到分离的线粒体中，制备成混悬液，将混悬液倒入玻璃匀浆管中，仍然用手工匀浆的方法匀浆，使线粒体破碎，待测酶活力（共30个样本）。1.5 50T试剂组成与配置（南京建成生物工程研究所第一分所）试剂一：液体10ml2瓶，4保存。试剂二：液体10ml1瓶，4保存。试剂三：液体10ml1瓶，4保存。试剂四：粉剂3支，-20以下保存。用时每支加水至5ml，现用现配。余下的-20以下可保存一周。试剂五：粉剂1支。用时加水至5ml，适当加热溶解，4保存。试剂六：粉剂1支。用时加水至10ml，室温保存。试剂七：液体10ml1瓶。用时加水至25ml，4保存。试剂八：粉剂3瓶。用时一支加水至40ml溶解（溶解后4可避光保存一周）。试剂九：粉剂1瓶。用时每瓶加水至100ml溶解，室温保存。试剂十：2.5mol/L硫酸100ml1瓶，4保存。试剂十一：10mmol/L标准磷贮备液10ml1瓶，4保存。1mol/ml标准磷应用液配置：用时将贮备液10倍稀释，即取1ml加蒸馏水至10ml。定磷剂的配制：按H2O:2.5mol/L硫酸:试剂八:试剂九=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂需现用现配。1.6 酶促反应将样本与试剂按表1.1操作 表1.1 加样顺序及用量管号（l）A管B管C管D管E管试机一（l）7070507050试剂二（l）202020 20试剂三（l） 2020试剂四（l）2020202020试剂五（l） 202020试剂六（l）202020 样 本（l） 100100100100混匀，37水浴准确反应10分钟后，按表1.2操作。注：A管为对照管；B管为Na+k+ATP酶管；C管为Mg+ATP酶管；D管为Ca+ATP酶管；E管为Ca+Mg+ATP酶管。表1.2 加样顺序及用量试剂七（l）5050505050样 本（l）100 混匀，离心4000转/分10分钟。 1.7 定磷离心完毕后，按表1.3操作 表1.3 加样顺序及用量管号标准管A管B管C管D管E管1mol/ml标准磷应用液（l）100 上清液（l） 100100100100100定磷剂（l）200020002000200020002000混匀，45水浴20分钟，冷却至室温，在660nm处，1cm光径，蒸馏水调零比色。 1.8 测试原理及计算公式测定原理：ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷，测定无机磷的量可判断ATP酶活力的高低。规定每小时每毫克组织蛋白分解ATP产生1mol无机磷的量为一个ATP酶活力单位，既molPi/mgprot/hour计算公式：ATPase活力=标准管浓度反应体系中样本稀释倍数6蛋白含量式中标准管浓度单位为1mol/ml；蛋白含量单位为mgprot/ml1.9 统计学处理数据以均数标准差表示，各组间比较采用SPSSl10统计软件进行单因素方差分析，各组间的两两比较采用LSD法(最小显著差法)进行统计。用Excel软件绘图。2 实验结果2.1 各个温度下A、B、C、D、E及标管的吸光度平均值与标准差见表2.1 表2.1 四个温度下各管吸光度9（常温）151922A 管0.1410.0600.0940.0580.1430.0600.1460.171B 管0.2860.0620.8720.4760.3280.2280.1570.068C 管0.2960.1300.1940.0980.2730.1950.1750.090D 管0.3140.1280.2180.0380.2570.1270.2270.050E 管0.3170.1010.8690.6210.4000.2450.2330.063标准管0.5070.0420.5510.1130.5760.1240.4190.019注：常温下测的水温为9。为了增加实验的准确性和可判断性，笔者在此实验外额外增加了一个实验：极性测试，既把在常温下养殖的罗非鱼取出，放于0环境中，隔3小时取一批，每批8条鱼，共两批，以此来进行测定，所得数据见表2.2。表2.2 极性测试数据第一批第二批A 管0.1210.0300.0610.027B 管0.2280.0180.1870.052C 管0.2750.0510.2110.033D 管0.2600.0240.2120.130E 管0.2990.0970.2120.061标准管0.4600.0520.4600.0522.2 各个温度Na+-K+-ATPase活性变化表2.21显示，Na+-K+-ATPase活性在15时活性最高，显著高于其他3个温度，而9于19活性差异小，22时活性最低，不足15时的2%。该表可以看出，该品种的罗非鱼在15时Na+-K+-ATPase活性最高，温度升高或者降低都将会使Na+-K+-ATPase活性降低表2.22显示，极性测试中第一批和第二批罗非鱼肝脏的Na+-K+-ATPase活性在温度如此低的情况下并没有多大变化，或者是急剧降低，和表2.21中9时Na+-K+-ATPase活性相比，降低的并不明显。说明温度降低时Na+-K+-ATPase活性会下降，但会稳定在一个水平上。表2.21 四个温度下Na+-K+-ATPase活性变化9（常温）151922Na+-K+-ATPase171.5847.2192.715.8注：常温下测的水温为9。表2.22 极性实验中前后两批Na+-K+-ATPase活性变化第一批第二批Na+-K+-ATPase139.5164.3注：第一批鱼刚从常温中取出，温度低于但接近9，而第二批时温度接近0。2.3 各个温度Mg+-ATPase活性变化表2.31显示，Mg+-ATPase活性在9时最高，在15时有所下降，在19时有有所上升，而在22时又下降，切降至四个温度最低。Mg+-ATPase活性成波浪线状态。表2.32显示，极性测试中，第一批和第二批罗非鱼肝脏的Mg+-ATPase活性相差不大，与表2.31中9相比，Mg+-ATPase活性有些许的提升。表2.31与表2.32对比可以看出Mg+-ATPase活性在一定温度范围内才会有波动，当温度下降到更低是，并没有直线下降，而是稳定在一个挺高的水平。表2.31 四个温度下Mg+-ATPase活性变化 9（常温）151922Mg+-ATPase183.3108.9135.541.5注：常温下测的水温为9。表2.32 极性实验中前后两批Mg+-ATPase活性变化第一批第二批Mg+-ATPase200.8195.6注：第一批鱼刚从常温中取出，温度低于但接近9，而第二批时温度接近0。2.4 各个温度Ca+-ATPase活性变化表2.41显示，Ca+-ATPase活性在9时最高，当温度上升时Ca+-ATPase活性会降低，但表中15，19，22三个温度的Ca+-ATPase活性差异小，说明Ca+-ATPase活性在9左右温度下活性达到最大，当温度上升时，会使活性降低，最后稳定在一个水平。表2.42显示，第一批的Ca+-ATPase活性比第二批的Ca+-ATPase活性略低，与表2.41中9相比，随着温度的下降，Ca+-ATPase活性先是有所降低，然后又回升。表2.41 四个温度下Ca+-ATPase活性变化 9（常温）151922Ca+-ATPase204.7103.5118.8116.0注：常温下测的水温为9。表2.42 极性实验中前后两批Ca+-ATPase活性变化第一批第二批Ca+-ATPase181.3196.9注：第一批鱼刚从常温中取出，温度低于但接近9，而第二批时温度接近0。2.5 各个温度Ca+Mg+-ATPase活性变化表2.51显示，Ca+Mg+-ATPase活性在15时活性最高，随着温度的上升或下降，Ca+Mg+-ATPase活性都会降低，9与19时的Ca+Mg+-ATPase活性接近，22时的Ca+Mg+-ATPase活性最低。表2.52显示，第一批Ca+Mg+-ATPase活性比第二批Ca+Mg+-ATPase活性要略高，与表2.51中9相比，随着温度降低，Ca+Mg+-ATPase活性先是有所上升，然后又有所下降。表2.51 四个温度下Ca+Mg+-ATPase活性变化9（常温）151922Ca+Mg+-ATPase208.3844.0267.8124.6注：常温下测的水温为9。表2.52 极性实验中前后两批Ca+Mg+-ATPase活性变化第一批第二批Ca+Mg+-ATPase233.1196.9注：第一批鱼刚从常温中取出，温度低于但接近9，而第二批时温度接近0。3 讨论将实验结果的数据综合在一起，以15为中轴，列一个活性升降表，表3.11。表3.11 各个温度间ATPase活性升降对比表极性第二批极性第一批9（常温）151922上升（24.8）下降（32）下降（675.7）Na+-K+-ATPase（847.2）下降（650）下降（176.9）下降（36.2）上升（24.8）下降（635.7）Ca+Mg+-ATPase（844）下降（576.2）下降（143.2）上升（15.6）下降（23.4）上升（101.2）Ca+-ATPase（103.5）上升（15.3）下降（2.8）下降（5.2）上升（17.5）上升（74.4）Mg+-ATPase（108.9）上升（26.6）下降（94）注1：表中15下括号中数字为该ATPase在15时的活性，而其他温度下括号中数字为与以15为中轴方向的前一个温度的ATPase活性值之差注2：表中9为常温下所测水温，极性第一批鱼刚从常温中取出，温度低于但接近9，而极性第二批时温度接近0。表3.11显示，Na+-K+-ATPase活性在15时非常高，当温度上升或者下降时Na+-K+-ATPase活性急剧下降；Ca+Mg+-ATPase活性在15时也非常高，当温度上升或者下降时Ca+Mg+-ATPase活性也急剧下降，情况大体和Na+-K+-ATPase相似，而Ca+-ATPase活性和Mg+-ATPase活性在9时最高，温度再降低时，Ca+-ATPase活性和Mg+-ATPase活性都会有不同程度的下降，但是下降的幅度不大。对此，笔者推测，罗非鱼不耐低温与Na+-K+-ATPase活性和Ca+Mg+-ATPase活性有比较大的关系，这两种ATPase活性的急剧降级也许是罗非鱼不耐低温的原因之一；对比而言Ca+-ATPase活性和Mg+-ATPase活性在各个温度间的变化没有Na+-K+-ATPase活性和Ca+Mg+-ATPase活性那么的明显，对于罗非鱼不耐低温也许有影响，也许没有，还有待进一步研究。罗非鱼的生存温度范围为1535，最适宜生长温度为2832，为什么会出现现在这种15Na+-K+-ATPase活性和Ca+Mg+-ATPase活性这么高，而温度上升下降活性都下降的情况，对此，笔者有两种推测：第一种，本次实验鱼皆来自河南师范大学水产养殖基地，河南地处偏北地区，与罗非鱼家乡非洲相比，温度差太多，即使有温池加温，也不能达到罗非鱼所认为的最适温度2832，代代相传，可能对温度的适应性有所改变，使得实验所用这批罗非鱼最适温度在15左右。第二种，罗非鱼为变温动物，在15时，Na+-K+-ATPase和Ca+Mg+-ATPase两种活性程度，能够使罗非鱼在15的情况下生存，当Na+-K+-ATPase活性和Ca+Mg+-ATPase活性降低，若生存环境温度高，则在外界温度的影响下罗非鱼能生存，若生存环境温度低，而酶活性也低，所以罗非鱼不能在低温下生存。参考文献1 杨秀竹，李东华，张西波，崔乃强.中药含药血清对大鼠肝细胞膜ATP酶活性的影响. 中 医药学刊，2005，23（9）：1605-160