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精品讲座下载网： .海量管理讲座下载第一章 现代药理学实验方法与技术简介 第一节 分子生物学试验方法与技术 分子生物技术在药理学实验中应用较为广泛，包括核酸分子探针的标记、核酸分子杂交、多聚酶链反应、蛋白印迹杂交技术、cDNA文库、随机分子库技术、外核基因在真核细胞中的表达、转基因动物、人类基因治疗等。现将更为常用的技术介绍如下：一、核酸分子探针的标记 标记核酸分子探针（nucleic acid probe）是进行核杂交的基础，根据核酸分子探针的来源及性质进行选择，选择的基本原则是具有高度的特异性，探针选择直接影响杂交结果的分析。根据检测对象和目的不同，可选择不同的探针种类及标记方法。 探针种类1基因组DNA探针 是克隆化的各种基因片断，也是最常用的核酸探针，探针应尽可能选用基因编码（外显子），避免使用内含子及其它非编码序列。2cDNA探针 与mRNA互补的DNA链称cDNA，是一种较为理想的核酸探针，特异性较高。3RNA探针 RNA与RNA或DNA杂交体的探针稳定性，特异性高。4寡核苷酸探针 人工合成寡核苷酸片段做探针，可根据需要合成相应序列。 标记物 常用的探针标记物有两类：放射性同位素和非放射性同位素。标记物的检测具有高度灵敏性和特异性。标记和探针结合不影响杂交的特异性和稳定性。其中放射性同位素是应用最多的探针标记物，但易造成放射性污染，多数同位素的半衰期短，不能长期存放。常用的放射性同位素有32P3P35S，有时也用14C,125I或131I。二、核酸分子杂交（nucleic acid hybridiazation ） 是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定的条件下，按碱基互补配对原则形成异质双链的过程。核酸分子杂交是分子生物学领域应用最广泛的技术，灵敏度高、特异性强，主要用于特异DNA或RNA的定性定量检测。三、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外酶促扩增特异DNA片段的方法。传统的DNA扩增法是分子克隆法，需经过DNA酶切、链接、转化等步骤构建含有目的基因的载体。然后导入细胞中进行扩增，再用同位素标记的探针进行筛选，操作复杂，耗时。PCR技术灵敏度高，特异性强，操作简便。PCR是本世纪分子生物学研究领域中最重要的发明之一。四、cDNA文库 是指以mRNA为模板，在反转录酶的作用下形成的互补 DNA（complementary DNA,cDNA）。cDNA文库是指一群含重组DNA细菌或嗜菌体克隆。每一个克隆只含一种mRNA的信息，足够数目克隆的总和则含细胞的全部mRNA信息，此种克隆群体叫cDNA文库。五随机分子库技术（random moleculer library） 采用不同技术手段和在不同的分子水平有效地实现分子的多样性。其技术路线，一是利用化学合成的方法生成已知结构的化合物，以某种特定方式和一定规律组合在一起，只要确定某一化合物具有活性，即可根据建库的组合方式确定其结构，围绕此技术发展的随机分子库总称为化学合成库（synthetic chemical library）。二是利用基因工程方法直接合成的DNA或RNA的核酸库（nucleic acid library ）,由DNA随即编码表达的小分子和大分子的混合群体而表达物的表面显露又提供了可从庞大的复杂的群体中快速筛选到目的物，这就是近几年发展起来的极富有应用潜力的核酸编码分子肽库（oligonucleotide-encoded peptide library ）。六真核基因的表达调控技术 真核细胞具有比原核细胞更为庞大的和复杂的基因组。高等真核细胞基因组编码成千上万个基因，基因内遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程，即基因表达过程受不同层次调节机制精密调控，此调控既决定着基因表达的量，又决定基因表达的时空顺序。调控过程精密复杂，涉及到转录前染色质的活化；转录水平的调节；转录后的加工；翻译水平的调节及翻译后的修饰等。基因表达的调控主要发生在转录水平。七转基因动物 是用实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。此种方法可建立转基因动物模型，以研究外源基因在整体动物中的表达调控率；能改变动物基因使其表现更符合人类需要；也可用转基因动物产生人类所需要的生物活性物质。第二节 细胞生物学实验方法与技术细胞生物学是生命科学中的重要分支，它以生命基本单位细胞为研究对象，应用近代物理、化学和实验生物学方法，从显微、亚显微和分子水平来揭示细胞生命活动及规律，其中包括细胞的生长、发育、分裂、分化、遗传、变异（包括癌变）、兴奋、运动、代谢、衰老与死亡等基本生命现象，并且利用与调控细胞的行为活动，已达到为生产实践尤其为医药卫生事业服务。当前细胞生物学与医药保健事业联系的较为紧密的热点问题主要有以下几种：1）真核细胞基因结构及其表达调控；2）细胞膜、膜系、受体与信号传递研究；3）细胞生长、分化、衰老、癌变、死亡，尤其是程序性细胞死亡的研究；4) 细胞工程，包括基因工程及体细胞核移植的研究。一、细胞培养常用方法 1、细胞原代培养（primay culture） 又称初代培养，即直接从机体取下细胞、组织、或器官、让他们在体外维持与生长。原代细胞的特点是细胞或组织刚离开机体，他们的生物状态尚未发生很大的改变，一定程度上可反映他们在体内的状态，表现出来源组织或细胞的特性，因此用于药物实验尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒性或杀伤作用等研究是极好工具。常用的原代培养方法有组织快培养法及消化培养法。前者方法简单，细胞也较易生长，尤其是培养心肌有时能观察到心肌组织块的搏动。细胞从组织块外长并铺满培养皿或培养瓶后即可进行传代。2、细胞的传代培养 当细胞生长至单层汇合时，便需要进行分离培养否则会因无繁殖空间、营养耗竭而影响生长，甚至整片细胞脱离基质悬浮起来直至死亡。为此当细胞达到一定密度时必须传代或再次培养，目的是借此繁殖更多的细胞，另一方面是防止细胞的退化死亡。二、器官培养方法器官培养（organ culture）是指用特殊的装置使器官、器官原基或它们的一部分在体外存活，幷保持其原有的结构和功能。器官培养可模拟体内的三维结构，用于观察组织间的相互反应、组织与细胞的分化以及外界因子包括药物对组织细胞的作用。器官培养方法很多，最经典的方法即表玻皿器官培养法；一种最常用的方法是不锈钢金属网格法及Wolff培养法和扩散盒培养法，实验者可根据情况选择采用。三、放射自显影术测定放射自显影术（autoradiography）是利用放射性同位素电离辐射对核子乳胶的感光作用，显示标本或样品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在紧密接触的感光乳胶中记录下它存在的部位和强度，准确显示出形态与功能的定位关系。现已可将放射自显影术与电镜以及生物分子结合起来。不但可以研究放射性物质在组织和细胞内的分布代谢，而且可以揭示核酸合成及其损伤等改变，目前已在生命科学各领域被广泛应用。四、染色体分析技术 染色质或染色体是遗传物质在细胞水平的形态特征。前者是指当细胞处于合成期时遗传物质经碱性染料着色后，呈现出细丝状弥漫结构；当细胞进入分裂期时，染色质细丝高度螺旋化凝聚为形态有特征的染色体。特别是在分裂中期，复制后的染色体达到最高程度的凝聚，称为中期染色，是进行染色体形态观察分析的最佳时期。染色体分析应用领域越来越广，主要用于以下几方面：1）为临床诊断提供新手段；2）研究不育和习惯性流产发生的遗传基础；3) 通过检查胎儿的染色体，预防有染色体异常患儿出生（先天愚型）；4）根据染色体的多肽性进行亲子和异型配子的起源研究；结合DNA重组技术可以将基因定位于染色体的具体区带上。五、电镜技术 早在1940年，英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜，但因分辨率低无实用价值。1965年英国剑桥科学仪器有限公司开始生产出商品扫描电镜，其以显著优点广泛用于生物学、医学、物理学、化学、电子学及勘探、冶金、国防、公安、机械与轻工业等诸多领域，并已成为非常有用的研究工具。电镜主要特点：1）景深大，较光学显微镜大几百倍；2）图像富有立体感，是一个具有真实感的三维结构立体图象；3）图像放大范围大，光学显微镜有效放大倍数为1000倍左右，透视电镜的放大倍数为几百倍至100万倍，扫描电镜可放大十几倍至几十万倍；4）分辨率高，扫描电镜可达63nm；5）样品可在三度空间平移和旋转，聚焦后可以任意放大倍数，而不需调整重新聚焦。六、细胞、细胞器、及细胞间质的分离技术、 1、 细胞的分离 分离不同的细胞及亚细胞组分在现代生物学研究中起着重要的作用。如研究某种药物治疗白血病的机理，需要分离培养人或动物的骨髓细胞，观察药物的细胞作用；研究与细胞生长分化有关的生长因子的作用，需将与此类因子有关的细胞分离出来；分离细胞膜，线粒体等细胞的亚组分，对于研究信号传递，某些遗传疾病，也都是必不可少的手段。 2、细胞膜的分离 细胞内的膜系统与细胞质膜统称为生物膜（biomembrane）,他们都有共同结构和特征。首先要分离出形状完整的、具有生物活性的、高纯度的细胞膜，用于研究细胞膜的结构和功能，以利于观察膜在细胞与环境进行能量交换及信息传递的过程。3、细胞核的分离 细胞核作为一个功能单位，完整的保存遗传物质，幷指导RNA合成，后者为蛋白质及其它细胞组分合成所必需。因此细胞核分离是研究基因表达及细胞核形态结构的首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后，用分级离心或超声波处理等方法进行纯化。4、溶酶体的分离 溶酶体是处理细胞吞噬物的细胞器，含有高浓度的各种水解酶类，调控细胞内的消化过程。溶酶体的分离常用于研究因溶酶体功能缺陷而引起的多种疾病。5、线粒体的分离 线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需要的能量，主要由在线粒体内进行氧化所产生的能量供给。制备线粒体关键是保持其完整性及高纯度。 6、细胞DNA、RNA分离与纯化 核酸是遗传信息及基因表达的物质基础。核酸的提取与纯化关键是保持核酸的完整性，但较困难，主要因为：一是细胞内有活性很高的核糖核酸酶；二是酸碱等化学因素；三是高温机械损伤等物理因素，需严格遵守操作规程。七、细胞凋亡研究方法 细胞凋亡(apoptosis),又称为程序性死亡（programmed cell death,PCD）指的是有核细胞在一定条件下，通过激活其自身内部机制，尤其是开启与关闭某些基因以及内源性DNA内切酶活化，导致产生细胞自然性死亡的过程。可以认为细胞死亡的这种方式是一种生理性的自发过程。为此有人也称其为细胞自杀。目前认为程序性死亡几乎和细胞的增殖同样重要，如果没有细胞凋亡，个体不能形成与存活，或者发生疾病。只有通过细胞凋亡的发生，使特定细胞群体在特定的时间和特定的部位死亡。从而使机体在总体上保障其细胞数量，以及形态与功能的平衡。近年来如何用药物诱导癌细胞死亡也成为细胞凋亡的热点之一。透视电镜观察是研究细胞凋亡的首选方法。八、原位杂交 原位杂交技术是将分子杂交与组织化学相结合，用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特异互补的DNA或RNA序列。它分为三类：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA。已广泛用于生物学的各个领域。原位DNA末端标记可以用于细胞凋亡的定量研究。原位杂交技术和PCR技术结合用于检测人乳头瘤病毒（HPV）九、单克隆抗体是1975年被描述的一种可产生无限量，并可预测其性质的抗体制备技术。该技术的关键步骤在于淋巴细胞之间的融合，所以称为“淋巴细胞杂交瘤技术”；由于杂交瘤经过筛选可产生针对单一抗原决定簇抗体的细胞克隆，故称为单克隆抗体技术。该技术的问世使得免疫学研究与实践发生了革命性的改观，同时还为生物学和医药学的许多领域提供了前所未有的研究工具。人们利用其可精确地识别出极为复杂的分子，测定出无法测定的物质，识别出新的细胞群体，揭示了以往未曾了解的细胞分化途径，为肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病等的诊断和治疗创造出令人兴奋的前景。十、神经细胞培养 神经细胞培养是指从体内取出某一种神经组织，在无菌、适当温度和一定营养条件下模拟在体生理环境，使之存活和生长，幷保持其结构和功能。神经细胞培养按培养前切割程度分为器官培养、组织快培养和细胞分离培养。1、器官培养 （organ culture ） 是切割最少型的培养。全器官或器官大片放在保温的营养液中可保存数日。这类培养切断了正常的血供，器官的营养交换取决于简单的灌流。2、组织块培养 （explant culture） 是真正最小器官培养。组织块通常厚度为0.51mm，一个或几个组织块放在一个培养皿内存活数周。实验在其组织块周围生长出的边缘细胞上进行。3、细胞分离培养 （dissciated cell culture ）是由分散其原始组织至其组成的细胞。常用酶进行消化。第三节 信息传递的研究方法与技术一、受体与配基结合试验技术 受体与配基结合试验是一种在体外直接观察受体的实验手段。随着各种高比活度的特异性受体配基的合成，此方法已成为药理学的基本技术之一，幷广泛用于生理、生化、细胞生物等许多相关学科。二、G蛋白的纯化分离技术 G蛋白是细胞膜上一类结构和功能都非常相似的蛋白质。其主要功能是偶联受体及其效应器。受体与激动剂结合并被激活时，先激活其相应的G蛋白，然后G蛋白再与相应的效应器（酶离子通道等）发生反应，改变效应器的活性。与G蛋白偶联的受体种类繁多，受G蛋白调控的效应器包括腺苷酸环化酶，磷脂酶C，cGMP磷酸二酯酶，离子通道等。因此，G蛋白的研究对阐明跨膜信息传递机理有非常重要的意义。三、环核苷酸测定技术 环核苷酸是重要的细胞内信使物质，参与调控各种激素、神经递质和调质所导致的各种细胞生命活动。常用的测定方法有：cAMP蛋白质竞争结合法；cGMP放射免疫测定技术；腺苷酸环化酶测定技术等。四、花生四烯酸代谢产物测定技术细胞内磷脂、甘油三酯及胆固醇经酰基水解酶的作用释放出花生四烯酸（arachidonic acid ,AA）。而AA通过环加氧酶和脂加氧酶途径分别代谢转化为一系列活性物质，如前列腺素、前列环素、血栓素、白三烯等。这些物质在体内含量少，但有极强的生物活性。能调节多种系统（神经、内分泌、消化、呼吸、生殖、血液、心血管、肾等）,并在炎症、免疫、过敏、凝血、肿瘤和心血管等一系列的病理过程中发挥作用而具有重要的临床意义。常用的检测方法：生物测定法、高效液相测定法、放射免疫分析法、酶免疫测定法、放免配基受体结合法。五、肌醇磷脂及其代谢产物的测定技术 肌醇磷脂是细胞膜中的一种脂质，能被磷脂酶C水解生成三种重要的细胞内信使物质，都已成为药理学和生物化学等学科中研究的热点。常用实验方法有：肌醇磷脂的测定、磷酸肌醇的分离及测定、甘油二酯的测定、同位素标记测定肌醇磷脂等。六、蛋白激酶C的纯化和测定 蛋白激酶C是一种普遍存在于生物体内的磷脂依赖的激酶家族。在细胞的信息传递和生长调节中起到重要作用。蛋白激酶C参与多种激素、神经递质及生长因子调控过程。测定蛋白激酶C活性及纯化该酶成为跨膜信息传递研究的重要技术。七、离体器官受体生物测定 使用某些离体器官进行受体激动剂、拮抗剂的生物检定，是一项目前仍在广泛应用的经典的药理学方法。可以测定药物对受体的亲和力，对特定亚型的选择，能决定药物是激动剂还是拮抗剂，并能分析药物与受体的构效关系，反映的是药物在器官水平上的作用，因此，与细胞或分子水平上的实验结果可以互相印证，有其不可替代的意义。第四节 钙研究方法与技术简介钙是人体内极其重要的金属离子，广泛存在于细胞和体液中。它在细胞活动乃至生命过程和疾病的发生、发展中扮演重要角色，已成为化学、生物学、基础和临床医学及其它许多科学研究的一个重要领域。一、细胞内游离钙研究方法与技术（一）钙指示剂钙指示剂是近十多年来发展起来的一类离子指示剂，也称离子探针或染料，已成为观察细胞内游离离子浓度及其动态变化和空间分布极有价值的工具。目前常用钙指示剂根据其物理特性一般可分为两类1、钙荧光指示剂：是指在一定波长的激发光照射下，钙指示剂复合物可发出荧光。属于此类的指示剂有Fura-2 、Quin-2、Fiuo-3、 Indo-1等。2、光吸收指示剂：是指它们与钙离子结合后，其吸收光谱峰值随Ca2+指示剂复合物浓度的不同而变化，据此便可观察细胞内游离钙的动态变化并测定细胞内钙浓度。属于此类指示剂的有Purpurate diacetic acid (PDAA)、Antipyrylazo等。光吸收指示剂一般属于低钙亲和力指示剂。（二）双波长荧光分光光度计测定方法应用双波长荧光分光光度法不仅可以检测细胞悬液，单层培养细胞及单个细胞内游离钙浓度的变化，也可以测定细胞内瞬间平均钙浓度的变化及亚细胞水平钙离子的梯度分布等。各种细胞测定方法差异在于标本的制备过程，其余步骤基本相同。基本方法为制备标本的细胞悬液，加入荧光指示剂，用双光束荧光分光光度计测定荧光。测定条件：激发光光栅5nm，发射光光栅10nm，以300-420nm扫描激发光谱，然后固定激发波长在高峰波长，观察不同实验条件下荧光强度的变化，由公式计算游离钙浓度。二、钙结合蛋白的研究方法钙结合蛋白的研究方法包括钙调素的纯化及测定、钙调素的表达与突变的研究方法、钙调素结合蛋白检测方法及钙依赖性磷脂结合蛋白的研究方法。三、细胞内钙释放研究方法1、放射性标记法测定钙释放：将分离的内质网或线粒体囊胞用放射性标记的钙离子负载，负载后的囊胞置于一滤器上，通过过滤与负载液分离。在滤器中加入各种促钙释放介质后，定时测定滤器中残留的放射活性即可推断内钙释放情况。2、三磷酸肌醇刺激内钙释放的研究方法制备细胞或细胞器悬液，加入钙离子荧光指示剂负载，再加入一定浓度的三磷酸肌醇（IP3）刺激内钙释放，观察荧光强度的变化即可反应钙释放情况。四、钙离子受体测定方法从牛或人甲状旁腺细胞的cDNA文库中筛选出编码钙离子受体的cDNA，将其mRNA注入爪蟾卵细胞，使其表达，在细胞膜上形成具有天然活性的钙离子受体。当细胞培养液中存在一定浓度的钙或其它阳离子时，激活钙受体，使胞内钙离子浓度增加，打开氯离子通道，测定氯离子通道电流的变化，便可用于筛选钙离子受体激动剂或拮抗剂。第五节 放射配体受体结合实验方法与技术一、基本概念1、受体（ receptor） 一类介导细胞信号转导的功能蛋白质，可与周围环境中微量化学物质发生特异性结合，通过信息放大系统，触发后续的生理或药理效应。2、配体（ligand） 能与受体特异结合的物质，如神经递质、药物或激素等。3、判断受体的标准 真正的受体必须具备：饱和性、特异性、可逆性、高亲和性、结构专一性、立体选择性、区域分布性、亚细胞或分子特征、有内源性配体等。4、受体的基本分类 化学门控离子通道受体； G蛋白耦联受体。5、受体调节的方式 1）共价调节（covalent modification） 尤其是蛋白磷酸化反应在受体的脱敏过程中起了非常重要的调节作用。以乙酰胆碱受体为例，细胞内cAMP升高所引起的蛋白磷酸化可使乙酰胆碱受体对乙酰胆碱的脱敏速度增加810倍。2）非共价调节（non-covalent modification）影响受体功能的非共价调节机制包括膜电位的变化；机械性改变受体的分布（斑片钳技术）；受体和其他膜蛋白（如G蛋白）或某些小配体（阴离子，阳离子，核苷酸）之间的变构影响；膜脂质环境的改变等。3）协同性调节（coordinate regulation）已知不同受体可含有同源受体区如胰岛素受体和上皮生长因子-抗溃疡素受体中的酪氨酸激酶区。由此可推测一种受体被激活后可能通过一共同密码（code）来调节同一细胞上的其他许多受体。4）链锁反应（receptor cascades） 另外一种可能的调控机制，即一个受体被激活之后，可能会释放一种细胞外信使，激活第二个细胞表面受体。称之为放大性的链锁反应。二、放射配体结合法的应用领域1、阐明药物作用机制；2、新药设计和药物筛选；3、探讨疾病的病因、发病机理，提高临床合理用药和诊断水平；4、测定组织或血液中药物浓度；5、探寻新的受体、受体亚型和内源性配体。三、放射受体结合实验技术简介1、放射配体的选择 需要非常高的选择性，并要求与靶受体有很高的亲和性，解离常数最好小于10nmol/L，还要考虑配体的生物学以及生物化学特征。拮抗剂性配体必须能阻断激动剂与靶受体结合引起的生物学效应。放射性受体结合试验中，最常用的放射性同位素是氚，3H配体的主要优点是氚化过程不影响配体的生物活性，使用较安全，其信号必须用闪烁技术加以放大。放射配体的另一个重要特性是特异性结合与非特异性结合的比率，理想的配体应有不少于99%的特异性结合。2、组织的选择和制备 用于放射受体结合试验的理想的组织应含有高密度的靶受体和低密度的与配体非特异结合的受体。用于放射受体结合试验的组织可取自脑、外周组织、天然表达或移植受体的细胞株等。3、缓冲液 最常用的缓冲液是50mmol/L，PH为7.4的Tris-Cl的缓冲液；重碳酸盐、磷酸盐和HEPES缓冲液亦可用于结合试验。 4、非特异性结合的测定 非特异性结合的测定原理是加入大量的对靶受体具有药理活性的并可使受体饱和的非放射性配体。特异性结合量是指配体与靶受体结合量，可由总结合量中减去非特异性结合量求出。5、孵育条件 结合实验应该用能产生最大特异结合和适宜的孵育条件。需要经过大量的实验才可摸索出最佳的测定条件。6、放射配体-受体复合体与游离放射配体的分离最常用的最有效的分离方法是过滤，结合试验中最常用的滤纸是玻璃纤维滤纸。通常用25ml冷缓冲液冲洗23次就足够了。过滤完成后，滤纸置于盛有闪烁液的闪烁瓶中进行液闪测定。当放射配体解离较快时，可用离心的方法将放射配体-受体复合物从游离配体中分离出来。其它方法还有：凝胶过滤色谱法、凝胶过滤透析术、免疫沉淀法等。第六节 免疫药理学实验方法与技术简介免疫药理学是介于免疫学和药理学间的边缘学科，主要研究药物对机体免疫系统和免疫功能的作用及其机制，为某些疾病药物治疗提供理论基础。免疫药理学方法一般是采用体外的试管内研究和体内的整体研究相结合，体外试验研究可澄清药物对免疫应答某一特定环节如T细胞增殖、细胞因子等产生的具体影响，而整体研究则可探讨药物对抗原介导的的免疫应答、正常的体液免疫及细胞免疫功能、同种异体移植排斥反应、异常免疫应答如超敏反应和自身免疫病以及初次及再次免疫应答等的影响。在未来免疫药理学的研究领域中，基因工程、基因治疗、细胞因子治疗以及其它各种生物治疗的研究和应用将是研究的热点和前沿区域。一、免疫细胞的分离与纯化 体内外的免疫药理学实验研究都需要从动物或人的血液或淋巴组织中分离免疫细胞，获得高纯度的免疫细胞是进行本研究的最基本的前提条件。外周血中白细胞的分离常用自然沉降法和高分子聚合物沉降法；外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells，PMNC）分离多采用密度梯度离心法。从淋巴组织中分离淋巴细胞悬液-制备脾细胞悬液、淋巴结细胞悬液、胸腺细胞悬液。淋巴细胞的分离纯化包括：分离PMNC中的淋巴细胞和巨噬细胞 常用方法有玻璃粘附法、磁铁吸引法、羰基铁乳胶分层液法、补体溶解法及葡聚糖凝胶过滤法等。T细胞、B细胞及T细胞亚群的分离纯化 常用技术：E花结分离法、Percoll非连续性密度梯度离心分离法、洗淘法（panning）、补体细胞毒法、尼龙毛分离法、磁性激活细胞分离器（magnetic activated cell sorter，MACS）分离技术及流式细胞术（flow cytometry，FCM）。二、药物对免疫系统功能影响的实验技术简介1、对免疫细胞表面抗原分子的影响 对细胞表面的CD（cluster of differentiation，分化簇）抗原的检测与分析可通过细胞毒法、葡萄菌体蛋白A法、免疫细胞化学法和免疫荧光染色分析法等，借助流式细胞仪进行的免疫荧光染色分析法使该项技术的标准化、定量化和自动化水平大大提高，体内外药理试验均可采用之。2、对免疫细胞功能的影响 常用：3H-TdR掺入试验、固相抗CD3单克隆抗体诱导细胞增殖的检测、混合淋巴细胞反应、抗原刺激的T细胞增殖反应、预激淋巴细胞对抗原的增殖反应等。3、淋巴细胞功能的体内实验 小鼠接触性超敏反应、移植物抗宿主反应（graft-versus-host disease，GVHD）、迟发性超敏反应（delayed-type hypersensitivity，DTH）、体内检测TH细胞活性。4、对B细胞影响的体内外实验 血清中IgG、IgA、IgM的测定（单向免疫扩散法、散射比浊法）；抗体生成细胞检测（溶血空斑试验、溶血分光光度法）。5、对单核巨噬细胞功能的影响实验 巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、白色念珠菌3H葡萄糖掺入实验、单核巨噬细胞对肿瘤细胞的细胞毒反应测定、单核因子测定等。6、对超敏反应影响的体内外实验 总IgE水平测定：酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫单扩散法（radioactive single radial diffusion，RSRD）、免疫斑点法（dot immunobinding assay，DIBA）、反向被动血凝法（reversed passive hemagllutination assay，RPHA）、纸片放射免疫吸附试验（paper radio immunosorbent test，PRIST）。特异性IgE抗体测定：ELISA、放射过敏原吸附试验（radioallergosorbent test，RAST）、P-K试验、被动皮肤过敏反应（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）、皮内试验（intradermal test）。人外周血单个核细胞体外合成IgE的测定：微量固相放射免疫测定法（microtiter solid-phase radioimmunoassay，MSPRIA）和ELISA法。参与I型超敏反应介质的测定：相应介质试剂盒测定，如LTs试剂盒。动物模型：如过敏性哮喘模型等。三、影响免疫功能的药物药效学研究原则根据药物对免疫功能的影响进行分类，可分为免疫增强剂、免疫调节剂和免疫抑制剂。1、免疫增强剂和免疫调节剂的免疫药理学研究免疫增强剂和免疫调节剂可分为两大类：生物类和化学合成化合物类。生物制品类包括菌苗、细菌的某些成分如脂多糖、真菌产物、免疫细胞的产物如细胞因子和免疫球蛋白、免疫细菌如LAK细胞、自然化合物及中草药及其单体成分等。化学合成化合物类包括含硫化合物、多聚核苷酸等。这些药物的药理作用因用药方案不同，如给药途径、用药剂量和用药时间等，会导致不同的药效；另外，药物本身的纯度和药物受试对象的种系、年龄、疾病类型与程度及遗传背景亦会对药效产生一定的影响，因此，在进行实验设计时要全面考虑这些因素。临床上免疫增强剂和免疫调节剂主要用于原发性和继发性免疫缺陷病、自身免疫病、肿瘤及慢性微生物感染的治疗，故选择实验动物模型时，应考虑采用免疫缺陷模型动物、荷瘤动物、自身免疫病模型及相应病原体感染动物模型。2、免疫抑制剂的免疫药理学研究免疫抑制剂的筛选程序一般是先进行体外实验，然后进行体内实验。动物的体内实验多采用实验性过敏性脑脊髓炎和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎的病理模型和新西兰NZB小鼠。在动物实验时，应考虑动物的品系、对免疫应答所影响的环节、治疗指数、给药途径、最佳治疗方案等。在免疫药理学研究之后，还应进行基础药理学研究、药物的急性和慢性毒性研究、药物的动力学研究等。第七节 肿瘤药理实验方法与技术肿瘤药理实验方法无外乎体内和体外实验两种。从实验目的上看，又可以分成抗癌作用和抗癌作用机制研究两种。一、抗癌作用研究（一）体外实验法：用培养的肿瘤细胞系进行。1、噻唑蓝（MTT）法 在培养的活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶可将黄色的四氮唑（MTT）催化成不溶性的蓝紫色的甲替，将甲替用二甲基亚砜（DMSO）溶解后，利用酶标仪（试验波长570nm，参比波长450nm）测定光密度值，按照公式 实验组光密度值肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1 - ）100% 对照组光密度值计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。用系列浓度的药物可制作肿瘤细胞生长抑制率的量效曲线。2、染料排斥法 本方法是根据活细胞具有排斥某些染料的功能，而死细胞因胞膜破坏而易于被染料着色的原理，在培养的对数生长期的细胞悬液中加入伊红、台盼蓝、或苯胺黑等染料，在室温下放置5分钟后，在15分钟用血球计数板计数200个细胞。根据公式未染细胞数活细胞率（%）= 100% 细胞总数3、生长曲线法 本方法是根据肿瘤的Gompertzian生长曲线而设计。培养的肿瘤细胞在初期为指数增殖期，随着细胞密度的增加，因代谢产物的积聚和营养物质的消耗，增殖趋于减缓乃至停止，进入所谓的平台期。在培养后的的即刻、1、2、3、4、5、7天的细胞，用台盼蓝染色，细胞计数，然后取细胞对数对培养时间作图可获细胞生长曲线。1）将生长曲线外延至Y轴可获得截距No，用公式计算药物对增殖细胞的杀伤力（No是对照组的的截距）2）用Nt代表接种后t小时的细胞数， 用公式TD = 0.301t / logNt - LogNo 计算药物对细胞增增时间（TD）的影响。3）取平台期每毫升的细胞均数，比较细胞生长的饱合密度（Ns）。4、集落形成法 本方法利用分裂6代以上的克隆原单细胞子细胞可形成集落成簇（每簇细胞数50）的能力，比较药物对单个肿瘤细胞增殖能力的影响。本方法有贴壁法和半固体培养法两种。1）贴壁法 需要选用贴壁生长的细胞， 按500细胞/ml的浓度接种到35mm培养皿中，培养后弃去培养基，用瑞氏-姬姆萨染色后，在20解剖显微镜下计数含有50个细胞的细胞集落。2）半固体软琼脂培养法 取对数生长的细胞，用含小牛血清的培养液稀释成1000细胞/ml的悬液；溶化5%的琼脂液，并按1：9的比例与含小牛血清的新鲜培养液混合，倒入35mm培养皿（1ml/皿），室温下待琼脂凝固，取0.94ml的细胞悬液，加0.04ml的5%琼脂, 加到已制备的琼脂平皿中，室温下凝固。移入培养箱培养。在16解剖显微镜下计数直径大于75m的细胞集落。以集落形成抑制百分率对对数剂量作图，可得“S”型曲线，从曲线上求取半数抑制浓度IC50；以集落的存活分数与剂量作图，可获得克隆原细胞存活曲线，方程为S=1-(1-e-D/Do)n，S为存活分数， D 为剂量， Do为存活分数每下降1/e时所需的药物剂量， n为外推值。Do越小， 药物的杀伤力越大，N越大杀死细胞的药物剂量越大。5、硫化若丹明B法（SRB）法 硫化若丹明（sulforhamine B）呈粉红色，溶于水，可与生物大分子的碱性氨基酸结合，这种结合物在波长515nm时的读数与细胞表现出良好的线性关系，可用于细胞的定量。测试的细胞先用TCA固定，去除固定液，加入SRB， 室温下静置， 然后去除未结合的SRB， 用非缓冲tris碱液溶解结合的SRB，在自动化分光光度平板读数仪（515nm波长）测定OD值。可根据下述公式计算: T - T0 生长率（%）= 100% C - T0C、T和To分别为对照组细胞，为给药组细胞，另外的对照平板加药时的细胞的OD值。 T - T0杀伤率(%) = 100% T T - T050%生长抑制所需的药物浓度(GI50) = 100% C - T0 T - T0杀死50%细胞所需的药物浓度(LC50)= 100% T0(二) 在体试验法1、小鼠白血病L1210 系用甲基胆蒽诱发DBA/2小鼠而得。取接种于DBA/2小鼠第67天之腹水，制成细胞悬液，每只小鼠（DBF1或CDF1）腹腔接种活细胞1105，观察体重变化，计算平均存活时间T/C（T-治疗组存活时间，C-对照组存活时间）。T/C大于125%，并可重复，认为有抗癌活性，T/C大于150%，并可重复，认为具有显著活性。2、大鼠Walker-256瘤 本瘤细胞接种在皮下或肌肉成为实体瘤，接种于腹腔则成为腹水瘤。取Walker-256瘤体制成瘤细胞悬液，按106个细胞接种于大鼠大腿肌肉。计算瘤重和T/C。重复实验T/C42%，认为有活性。3、Lewis 肺癌 是一个在C57BL/6小鼠上发现的自发性肺内未分化的上皮样癌。该癌细胞恶性程度高，皮下、肌肉接种对药物的敏感性低，但可向肺转移，静脉接种可在肺形成瘤集落。方法是取接种于C57BL/6小鼠肌肉或腋窝皮下的1315天的Lewis肺癌，制成细胞悬液接种2106个细胞于BDF1小鼠皮下或腹腔内，12天后处死动物，作皮下接种者直接摘取肿瘤称重，作腹腔接种者，将双侧后肢从髋关节处剪下，荷瘤肢重减去正常肢重即为瘤重。重复实验T/C42%为有活性。二、抗癌作用机制研究（一）药物作用周期特异性研究进行药物作用细胞周期性实验必须首先制备同步化的细胞，常用的体外培养细胞同步化的方法有机械振荡法、双胸苷同步法、含羞草氨酸俘获法和离心洗脱法。1、机械振荡法 机械振荡法分离同步化细胞是基于单层贴壁生长的细胞在进入有丝分裂期时, 胞形变圆，松散地附在支持物上，利用摇晃或拍击培养瓶可以剥离出这些细胞，利用此方法可以得到较纯的M 期细胞。双胸苷同步法的原理是先以高浓度的TdR处理细胞，使细胞内的dTTP升高，后者抑制CDP 向dCDP的转变，DNA复制受阻，S期细胞停滞在S 期，其它期细胞积聚在G1/S边界；撤TdR，让原处于S期的细胞完全越过S期，再给予TdR，让越过S期的细胞进入G1/S边界，然后撤去TdR，让细胞重新生长，同时进入S期。因此，本方法可以得到较纯的S期细胞。2、含羞草氨酸俘获法 含羞草氨酸可将细胞集结于G1/S边界，阻止细胞进入S期。在撤除含羞草氨酸后，细胞可同步进入S 期。3、离心洗脱法 离心洗脱法的原理是进入细胞周期的的体积呈线性增加。G1期细胞体积最小，离出口最近而被最先洗出。G2/M细胞体积最大离进气口最近而被后洗出。在上述同步化处理尚需配合以同步化程度的检测，检查的方法有两种：流式细胞光度技术和放射性同位素技术。前者通过测定细胞的荧光强度来定量细胞的DNA量； 后者则利用测定掺入到DNA中的3H-胸苷（3H-TdR）或溴脱氧尿苷（BrdU）的量来获知处于S 期的细胞量。（二）药物抗微管作用 利用微管蛋白在37聚合，在冰浴上解聚的特点，测定微管蛋白或微管液的OD值，分别获得S型的聚合曲线和倒S型的解聚曲线， 比较药物对曲线的影响， 用下式计算抑制率。 实验组光密度值抑制率（%）=（1 - ）100% 对照组光密度值（三）药物与DNA结合能力检查 吸收光谱移动法 原理是DNA与药物形成复合物后吸收光谱发生改变，吸收峰产生位移，位移波长随DNA/ 药物复合物的量增加而增加。利用紫外分光光度计进行紫外吸收光谱扫描，可观察到这些改变。荧光光谱移动法 原理是在激发光的激发下，DNA-药物复合物的荧光发射光谱发生改变，谱峰向短波方向移动，荧光强度增强，同时激发光谱说发生改变。用荧光分光光度计测定激发光谱和发射光谱可观察到这些变化。（四）药物造成的DNA损伤彗星（Comet）微凝胶单细胞电泳法 正常的DNA为负超螺旋结构， 在pH12.0时则完全解链。DNA受损后链断裂, 成为一个松散的结构, 在电场的作用下,松散的DNA离开细胞核向正极移动, 形成彗星似的拖尾,变换不同pH缓冲液可检测断裂的是双链还是单链。碱洗脱法 收集细胞于滤膜上，用细胞溶解液裂解细胞并洗去RNA和蛋白质，暴露DNA，用洗脱液进行洗脱，若DNA发生链断裂，则易于经滤膜洗出。（五）药物对DNA拓扑异构酶的影响DNA拓扑异构酶是调节DNA空间结构的动态变化的关键性核酶，分成拓扑异构酶I和II，抑制拓扑异构酶I可以造成DNA的单链断裂，抑制拓扑异构酶II，可造成双链断裂，进而干扰DNA的复制、重组和基因表达。实验的原理是用从肿瘤细胞核提取的拓扑异构酶II处理PBR322DNA，后者是一种质粒DNA，主要存在有超螺旋、缺口状和线性DNA三种形式，琼脂糖电泳上显示出三条带，在拓扑异构酶的作用下超螺旋DNA解旋、断裂，电泳时超螺旋带减弱或消失，相应的缺口环状或线性DNA增加。如果药物对拓扑异构酶具有抑制作用，则可见超螺旋带保留。此方法亦可改进为观察药物对拓扑异构酶功能的促进和抑制作用。方法是选定不能使一定量DNA完全断裂量的拓扑异构酶处理PBR322DNA后电泳可见超螺旋带，同时加入不同浓度的药物，如果药物抑制拓扑异构酶，则超螺旋带增强，若药物增强拓扑异构酶活性，则见螺旋带减弱或消失。（六）药物对细胞核酸代谢的影响 DNA和RNA合成均需要特殊氨基酸，用同位素标记前体物如3H-TdR，3H-UR可分别掺入到细胞DNA 和RNA中去， 用液闪法测定其同位素活性则可知细胞DNA和RNA 的合成情况。（七）药物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用细胞凋亡是一种受基因调控的细胞程序性死亡过程，细胞凋亡时表现为细胞体缩小，染色质浓缩成大小不等的块状，并裂解为小片段。DNA断裂长度为核小体核苷酸长度(180200碱基对)的整倍数，提取后普通的琼脂糖电泳表现为特殊的云梯状，凋亡小体形成。检查细胞凋亡的方法有：1、荧光显微镜的形态学检查 该方法是利用凋亡细胞染色质浓缩，DNA广泛裂解的特征和荧光化合物可嵌入DNA分子或以静电相互作用与DNA分子结合的原理，建立DNA的荧光探针。常用的方法是用Hoechst33342和PI联合染色，然后在荧光显微下用紫外光激发。凋亡的细胞对Hoechst33342具有高摄取比，加之染色质的高度浓缩，呈强蓝色荧光；正常细胞呈微弱荧光，坏死细胞则呈红色荧光（被PI染色）。2、流式细胞光度术 该方法的原理是用DNA结合性的荧光染料标记DNA， 因为细胞发生凋亡时，内源性核酸内切酶降解、断裂DNA，断裂生成的小分子量DNA溢出细胞外，细胞内DNA总量降低，利用流式细胞光度术可以检测出DNA的这种结构和量的变化。3、琼脂糖电泳分析法 利用该方法可检测出呈云梯状的寡聚核小体。第八节 心脑血管药理学实验方法与技术简介 心脑血管药物实验方法很多，择其要者简介如下：一、血压测定及相关模型血压测定法大体分为直接和间接测压法。直接测压可选用颈动脉或股动脉插管，通过压力换能器记录血压变化，一般用麻醉动物作急性实验。常用的间接测压法主要有大鼠尾容积测压及尾动脉脉搏测压法。实验性高血压模型有：1、肾血管性高血压模型（肾动脉狭窄性高血压模型），分为2肾1夹型（两侧肾完整，一侧肾动脉狭窄）、1肾1夹型（一侧肾切除，另一侧肾动脉狭窄）和2肾2夹型（两侧肾完整，两侧肾动脉狭窄），常用动物是狗和大鼠。2、内分泌性高血压模型 常用大鼠，包括DOC盐性高血压模型、肾上腺再生性高血压模型。3、神经原性高血压模型。4、遗传性高血压模型， 根据采用的遗传学方法进行分类：选择性近亲繁殖高血压模型（如自发性高血压大鼠SHR、Dahl盐敏感大鼠DS、米兰种高血压大鼠 MHS、遗传性高血压大鼠 GH、以色列种高血压大鼠 SBH、里昂种高血压大鼠 LH）基因工程高血压模型 高血压转基因动物（transgenic animals of hypertension）、高血压基因敲除动物（geneknockout animals of hypertension）。研究降压药作用机理的实验方法包括:中枢降压(毁髓猫或大鼠模型、减弱神经反射性调节实验等)；外周降压（神经节阻断、对传出神经递质及受体的影响、对在体血管阻力或离体血管平滑肌作用实验等）。二、心脏与血管实验法简介 心脏实验可用在位心脏和离体心脏进行。离体心脏实验最常用的方法是Straub法、八木-Hartung法与Langendorff法。前两种方法主要观察药物直接对心脏收缩力、传导与心输出量的影响，适用于两栖类动物如青蛙、蟾蜍等离体心脏；后者适用于哺乳类动物兔、豚鼠、大鼠等，不仅可观察药物对心肌的直接作用，还可观察药物对冠脉流量的影响。本法虽然排除了神经体液的调控作用，但不能同时控制前、后负荷和心率，故又建立了离体工作心脏实验法。在位心脏实验法有Blbring法、家兔不破坏胸膜记录心收缩力法、狗心肺装置实验法等。 冠脉血管及冠脉血流量实验法 离体实验主要有冠状动脉条实验、Langendorff离体心脏测定冠脉灌流量法；在位心脏测定冠脉血流量及心肌耗氧量、测定区域性心肌血流量、86Rb测定心肌营养血流量法。 心血管药理实验方法中的技术手段还有：清醒大鼠心功能及血流动力学实验、动物心电图、心导管技术等。三、抗心肌缺血与再灌注损伤药物实验法简介首先介绍心肌缺血与再灌注损伤模型的制备：整体动物结扎冠脉后再灌注模型（常用犬、兔、大鼠进行）；离体心脏缺氧造成全心缺氧和其后的在给氧损伤，亦可结扎离体心脏的冠脉，然后松结产生局部心肌再灌注损伤；体外心肌培养缺糖缺氧与再给糖给