制药或GMP气相和液相色谱柱综合管理文件.doc

一、 概述：1. 高效液相色谱柱构造：色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。色谱柱是高效液相色谱的心脏，在高效液相色谱仪的使用中，保持色谱柱的柱效、容量和渗透粉性，延长柱子的使用寿命非常重要。因此对高效液相色谱柱的维护是关键。高效液相色谱柱的分类：液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。 常见的分配柱填料：碳十八柱（ods/c18)、碳八柱（mos/c8）、碳六柱（hexyl/c6）、 碳四柱（butyl/c4）、碳一柱（methyl/c1）、阴离子交换柱（sax)、 阳离子交换柱（scx）、苯基柱（phenyl）、氨基柱（amino/nh2）、 氰基柱（cyano/cn/nitrile）等。 常见的吸附柱填料：硅胶柱l 正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在310 m的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合cn，-nh2等官能团即所谓的键合相硅胶。l 反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ods)的非极性填料。也有无定型和球型之分。2. 气相色谱柱毛细管色谱柱的组成：毛细管色谱柱由两部分组成管身和固定相。气相色谱柱的种类：有多种类型，从不同的角度出发，可按色谱柱的材料、形状、柱内径的大小和长度、固定液的化学性能等进行分类。色谱柱使用的材料通常有玻璃、石英玻璃、不锈钢和聚四氟乙烯等，根据所使用的材质分别称之为玻璃柱、石英玻璃柱、不锈钢柱和聚四氟乙烯管柱等。按照色谱柱内径的大小和长度，又可分为填充柱和毛细管柱。前者的内径在24mm，长度为110m左右；后者内径在0.20.5mm，长度一般在25100m。在满足分离度的情况下，为提高分离速度，现在也有人使用高柱效、薄液膜的10m短柱。根据固定液的化学性能，色谱柱可分为非极性、极性与手性色谱分离柱等。二、 色谱柱的选型与求购：1. 色谱柱选型1.1高效液相色谱柱如果仪器用来做常规分析，样品种类有限，但分析次数多，则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。 非极性或极性较小的样品可用一般的c18柱 酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的c18柱，ph范围2-9（12） 糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，gpc有专用柱 超快速柱子-填料粒度450：适用于金属填充柱，耐高温，不可重复使用。o-型环 250：适用于玻璃填充柱，低温。2.1.2毛细管色谱柱的切割在聚酰亚胺涂层上轻轻地划出一道划痕，不要尝试割开毛细管玻璃推荐工具: 钻石或人造钻石割刀、蓝宝石切割工具、陶瓷片目镜不可使用: 剪刀、锉刀2.1.3毛细管柱安装前检查项目（1）检查气瓶压力以确保有足够的载气、尾吹气和燃气。载气的纯度不低于99.995；（2）清洁进样口，必要时更换进样口密封垫圈，进样口衬管和隔垫；（3）检查检测器密封垫圈，必要时更换。如有必要，清洗或更换检测器喷嘴；（4）仔细检查柱子是否有破损或断裂。2.1.4毛细管的安装（1）从柱架上将色谱柱两端各拉出大约0.5 m，以用于进样口和检测器安装，避免色谱柱锐折；（2）在柱两端安装柱接头和石墨密封垫圈，向下套柱接头和密封垫圈，离端口大约厘米；（3）标记和切割柱子。在柱距两端大约cm处用标记笔标记，拇指和食指尽量靠近切割点抓牢，轻轻地拉并弯曲柱子, 柱会很容易折断。如果柱子不容易折断，不要用力强行折，换个在离柱端更远的地方再刻一下，使其折断口处光滑。为确保柱两头切口截面没有聚酰亚胺和玻璃碎片, 可用放大镜检查切口；（4）在进样口安装色谱柱时，先查看仪器说明书找到正确的插入距离，并且用涂改液把这个距离标出来。将色谱柱插入检测器，用手指拧紧柱螺帽直到它固定住色谱柱，然后再拧螺帽1/4-1/2圈，这样当加压时色谱柱不会从接头脱出来； （5）打开载气，确定合适的流速。设定柱头压力，分流比和隔垫吹扫至合适的水平。如果使用分流和不分流进样口，检查清洗分流阀至on(开)状态，确认载气流过色谱柱，将色谱柱一端浸入丙酮瓶中检查是否有气泡； （6）将色谱柱安装到检测器上时，查看仪器说明书所提供的正确插入距离； （7）检查有无泄漏。在未仔细检查色谱柱有无泄漏之前对柱子不能加热； （8）清洗系统中的氧气至少数10 min，如果色谱柱被打开暴露到空气中很长时间（几天），那么需要更长时间（12h）来清洗系统以排除所有的氧气； （9）设定正确的进样器和检测器温度； （10）设定正确的尾吹气和检测器气流。点火、打开检测器至on状态下； （11）注射非保留物质甲烷（fid）、乙晴(npd)、二氯甲烷(ecd)、空气(tcd)、氩气（质谱）以检验进样器是否正确安装。如果出现对称峰则安装正确，如果有峰拖尾，重复进样口安装程序。2.2气相色谱柱的良好用法 柱的使用温度要尽量比柱的耐热温度低，这样可以延长柱的使用寿命，减低检测器的噪声级。 除去载气中氧（特别是使用极性柱时）。使用高纯度的气体（99.999%以上）气瓶更换时特别注意不要混入空气。氧气净化器装在gc前面。 不要使难于挥发的成分进入柱内充分做好试样的前处理使用柱衬管和石英棉安短的前置柱，一次性使用（毛细管柱）2.3气相色谱柱的维护2.3.1毛细管柱的老化2.3.1.1平时老化 （1）在比最高分析温度高20或最高柱温（温度更低者）的条件下老化柱子两小时，如果在高温10min后背景不下降，立即将柱子降温并检查柱子是否有泄漏； （2）如果用vespel密封垫圈的话，老化完后重新检查密封程度；（3）注射非保留物质以确定合适的平均线速度。2.3.1.2在新购入气相色谱柱也必须按2.3.1.1方法进行操作。在新柱老化时不得接检测器，以免新柱内的杂质对检测器造成污染。2.3.1.3老化色谱柱后需要在色谱柱使用记录上记录：老化所用温度及老化了多长时间。2.3.2使用注意事项在使用毛细管柱过程中，主要是防止固定液流失，因为固定液流失会使柱效能降低。事实上色谱柱固定液流失是自然的、是热力学平衡过程。色谱柱固定液聚硅氧烷通过聚合物本身的取代基形成环状分子。聚合物碎片之间由于取代基作用也可形成一些短键聚合物碎片。当这些碎片从色谱柱流出，它们会被检测到，从而导致信号的增强。在毛细管柱使用的全过程中这种反应一直发生。因此，所有的色谱柱都有不同程度的流失。氧是导致严重柱流失的主要因素，在色谱分析时尽量减少色谱仪气路系统氧的含量、使用好材料的部件以及选择正确的操作条件，可降低柱固定液的流失，延长柱子使用寿命。 下面介绍几点注意事项：（1）使用高纯度的载气。氧气含量不宜高于1 x10-6g/g；（2）利用净化器可以除去较低级别气体中的氧和碳氢化合物杂质。通常杂质含量可减少到100 x10-6g/g或更少；（3）聚合物材料通常不稳定。因此，调节器主体，阀盘座，密封圈和隔膜应首选金属材料；（4）管线只能使用没有油或其它污染物的铜管或不锈钢管，推荐使用制冷级铜管。（5）形圈或其它聚合物垫圈的阀最好用有焊接金属、波纹形密封垫。（6）整个系统必须无泄露，并且确保样品中不存在非挥发性物质。因氧和污染物对固定液的分解有催化作用，会导致柱流失增强；（7）在柱子安装后加热柱箱之前，柱子必须用干净的载气清洗15 min。如果色谱仪是新的，或进样器和仪器管线进行维护或修理过，仪器应当再清洗15至30 min；（8）各种固定液的热稳定性不一样，柱流失对背景信号的影响随固定液种类和所受温度变化而变化。当柱箱温度接近于柱温的上线时柱流失也会增加。所以应当尽量在较低的温度下工作以延长柱子的使用寿命；（9）一旦柱子损坏，由于固定液降解的程度不同，重新老化后有可能改善柱性能。2.4毛细管柱污染后清洗 2.4.1色谱工作者涉及两种类型污染：第一种不能洗脱的非挥发性物质；第二种最终能从柱子洗脱出来的半挥发性物质。柱子污染的症状为，产生吸附，出现鬼峰、脱尾峰、前延峰，发生分解，造成柱固定相过度流失和柱选择性改变。潜在的污染源包括：注射的样品、橡胶隔膜和金属垫碎屑、载气和捕集器中杂质以及其它来自外部如器皿和注射器中的杂质。2.4.2首先，最容易的补救方式是通过切除前端盘绕的色谱柱（大约50cm）。如果污染物位于柱子前端，那么色谱柱的性能会立即得到改 善。如果柱 性能没有得到改善，则可以判定污染物没有位于柱子的前端，下一步骤就是清洗进样系统。进样口石英衬管将是造成柱子污染的主要原因，要及时更换清洗。如果进样口石英衬管没有污染，而且污染物又不位于柱子的前端，那么，可以判定整个柱子的固定相遭到严重污染。冲洗柱子通常会洗脱出绝大多数非挥发性和半挥发性组分。如果固定相是化学键合性质的，通常用有机溶剂冲洗，色谱柱是安全的。溶剂冲洗并不破坏键合型固定相。不过，要避免在carbowax 或db-wax这样的腊质性固定相上用甲醇和水作溶剂冲洗，在管柱说明书上通常会注明可以使用哪些有机溶剂来清洗。最佳方式是采用一组溶剂依次进行柱冲洗。通常，最佳溶剂组为10ml甲醇，10ml二氯甲烷和10ml正己烷溶剂。如果必须用水去除盐类的话，那么在用甲醇冲洗之前，先用10ml水进行冲洗。冲洗的方式是按照正常载气流速的反方向，从检测器端至进样口端方向进行冲洗。在所有冲洗结束之后，色谱柱重新使用之前，要用氮气通过柱子吹干30min至45min。在柱子加温之前，要用载气慢速吹干以防止损害固定相。2.4.3柱冲洗时应注意：柱固定相膜厚度2m 会出现溶胀现象冲洗时，要将柱子一端插入冲洗溶剂内，加压载气源将冲洗液从柱内洗脱出。冲洗柱子是去除污染物的最佳方式，但一般情况下，绝大多数人还喜欢选择高温老化方式去除柱内污染物。因为高温老化比较简便，因此也是一种去除污染物的有效方法。不过应注意，高温老化色谱柱也不是经常有效的，因为它仅仅去除挥发性和半挥发性组分。如果污染物粘附在进样口或污染物是非挥发性的，那么长期高温老化色谱柱则难以解决这一问题。事实上，高温老化色谱柱所带来的弊病远远大于解决这一问题获得的好处。如果污染物是活性和非挥发性的，那么长期高温老化色谱柱则会缩短柱子的使用寿命。由此，这种高温老化也可以聚合某些污染物，导致色谱柱永久性损伤。高温老化色谱柱一般不超过1h至3h。色谱工作者应当认识到：只有半挥发和挥发性组分可以去除，当认为一根柱子被污染时，首先考虑的是应该对柱子进行冲洗，然后如果必要的话，才考虑高温老化方式。避免污染的方法首先在于预防。所有样品都含有残留物，并且每一个样品组分会经过一段时间后发生改变。无论如何精心操作，每一个样品肯定会比上次注射进样时发生轻微改变。理由是分析样品中含有反应性或挥发性组分。化学催化剂及某些溶质其本身限制了柱子的使用寿命。具体表现为：酯类趋向于发生皂化反应；盐酸和内酯易发生水解反应；环氧化物在酸或碱环境中易发生开环反应。适当的样品制备可最低限度减少色谱系统内的污染。在进样口石英衬管内放置石英棉，可预防柱子非挥发性残留物的污染。应注意在每次分析之前，要确认溶剂是无污染的，注射器是干净的，样品存放器皿和容器是清洁的。如果固定相已经在化学性质上发生改变或损伤，那么没有什么方法可以将柱子恢复到它的原始状态。2.5常见问题2.5.1峰丢失（进样后没有峰出现） 注射器有毛病，采用新注射器做验证 未接入检测器或检测器不起作用，检查设定值。 进样温度太低，检查温度，并根据需要调整。 柱温温度太低，检查温度，并根据需要调整。 无载气流量，检查压力调节阀，并检查泄露，验证柱样品流速。 柱断裂，如果柱断裂是在柱进样口端或检测器末端，是可以补救的，切去断裂部分，重新安装。2.5.2前沿峰 柱超载，减少进样量。 两个化合物共洗脱，提高灵敏度和减少进样量，使温度降低1020，以使峰分开。 样品冷凝，检查进样口和柱温，如有必要可以升温。 样品分解，采用失活化进样器衬管或调低进样器温度。2.5.3拖尾峰 进样器衬套或柱吸附活性样品：更换衬套。如解决不了就将柱进样端截12cm，再重新安装。 柱或进样器温度太低：升温（不要超过柱最高使用温度）。进样器温度应比样品最高沸点高20。 两个化合物共洗脱：提高灵敏度和减少进样量，使温度降低1020，以使峰分开。 柱已损坏：请更换柱。 柱污染：将柱进样端截去12cm，再重新安装。2.5.4只有溶剂峰 注射器有毛病：采用新注射器验证。 不正确的载气流速（太低）：检查流速，如有必要，调整之。 样品浓度太稀：请提高仪器灵敏度，或增加注入量。 柱箱温度太高：检查温度并根据需要调整。 柱不能从溶剂中分离出组分：更换高膜厚的色谱柱或不同极性。 栽气泄露：检查泄露处（肥皂水）。 进样器衬套或柱吸附活性样品：更换衬套。如解决不了就将柱进样端截去12cm，再重新安装。2.5.5宽溶剂峰 由于柱子安装不当，在进样口产生死体积：重新安装柱。 进样技术差（进样太慢）：采用快速平稳进样技术。 进样器温度太低：提高进样器温度。 样品溶剂与检测相互影响二氯甲烷/ecd：更换样品溶剂。 柱内残留样品溶剂：调整或清洗。 隔垫清洗不当：调整或清洗。 分流比不正确分流排气流速不足：调整流速。2.5.6假峰 柱吸附样品，随后解吸：更换衬管，如不能解决问题，就从柱进样口端去掉12圈，再重新安装。 注射器污染：用新的注射器及干净的溶剂试一试，如假峰消失，就将注射器冲洗几次。 样品进样量太大：减少进样量。 进样技术太差、进样太慢：采用快速平稳的进样技术。2.5.7过去工作良好的柱出现未分辨峰 柱温不对：检查并调整温度。 不正确的载气流速：检查并调整流速。 样品进样量太大：减少样品进样量。 进样技术水平太差（进样太慢）：采用快速平稳进样技术。 柱和衬套污染：更换衬套。如不能解决问题，就从柱进口端去掉12圈，并重新安装。2.5.8基线不规则或不稳定 柱流失或污染：更换衬套。如不能解决问题，就从柱进口端去掉12圈，并重新安装。 检测器或进样器污染：清洗检测器和进样器。 载气泄露：更换隔垫，检查柱泄露。 载气控制不协调：检查载气等气源压力是否充足。如压力500psi，请更换气瓶。 载气有杂质或气路污染：更换气瓶，使用载气净化装置清洁金属管。 载气流速不在仪器最大/最小限定范围之内（包括fid用氢气和空气）：测量流速，并根据使用手册技术指标予以验证。 检测器出毛病：参照仪器使用手册进行检查。 进样器隔垫流失：老化或更换隔垫。2.5.9同一根柱保留时间长短不一 柱温太低或太高，检查冰并调节柱温。 载气流速太高或太低，在柱出口处用适当的，经标定气源测量流速。 进样器隔垫或柱泄露，如必要，请检查并修复。 柱污染或损坏，重新老化或换柱。 样品超载，减少进样量。 记录仪出毛病，检查记录仪 载气控制不协调，检查载气源，看压力是否足够。如压力500psi，请更换气瓶。五、 色谱柱的保存1.高效液相色谱柱1.1反相色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用510%的甲醇水以1.0ml/min流速至少冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇以1.0ml/min流速至少冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入510%的甲醇，防止将填料冲塌陷。正相色谱柱每天实验后的保养：可先用所用流动相以1.0ml/min流速冲洗至少1h（无盐份情况下，如所用流动相有盐份可用同比例去除盐作为流动相冲洗），再用正己