《CR质控及问题分析》PPT课件.ppt

PCR质量控制 及常见问题分析、对策 临床检验技术历经了 一、化学试剂检验 二、酶促生化检验 三、抗原-抗体免疫反应等三个主要技术阶段 四、近年来人类基因组计划的完成也推动了临床检验进 入基因检测-分子诊断时代 血糖 检测 一 PCR技术最根本特征 二 PCR系统外的质量控制 三 PCR体系内的常见问题、原因分析及对策 1.传统诊断: 靶A+试剂B 信号C, 均为信号相加模式。 2.PCR: 1,2,4,8-230(109)- 2n -靶分子指数增加模式。 PCR极高扩增放大倍数亦带来非特异性过度放大! 1. 硬件建设: 2. 软件控制: 标准操作SOP, 人员操作培训,质量追踪体系。 分室/分区实验室, 安全柜,仪器,螺盖管/胶膜96孔板, PCR反应液加矿物油封闭,UDG酶消除气雾胶。 PCR体系问题 、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略 临床PCR检测 的常见问题 实时荧光PCR定量检测 的关键问题 PCR体系内的常见问题、原因分析及其对策 PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2浓度 dNTPs dH2O 耐热聚合酶 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板 纯 度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓 度 加量过多导致非特异性扩增增加 引 物 特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体PD 完整性 避免反复冻融 浓 度 应适当,过高导致非特异性增加, 过低则扩增产物 太少 反应体系对PCR扩增的影响 过高非特异性严重 过低无扩增产物 浓度适当 避免反复冻融 pH值适当 避免污染 pH值,盐离子浓度 稳定剂,增强剂 反应缓冲液 dNTPs dH2O Mg 2浓度 如何选择最合适的DNA聚合酶 PCR用耐热 DNA聚合酶 Taq酶 pfu酶 Hotstart Taq酶 混合酶 Taq plus Long Taq Taq platinum 特异性-基因组扩 增、RT-PCR 保真性-基因筛选 、测序、克隆 长长片段扩扩增-构建基因图谱 、测序等 扩扩增效率-复杂模板扩增（GC含量高、二级结构 ） PCR试剂试剂 盒-复杂模板扩增、大规模基因检测 如何选择最合适的DNA聚合酶 -根据PCR实验需求 PCR常见问题之一-无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无 M 1 2 正对照 原 因 模板含有抑制物，含量低 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间 对 策 PCR常见问题之二-非特异性扩增 现象： PCR扩增后出现的条带与预计 的大小不一致，或大或小，或者同时出 现特异性扩增带与非特异性扩增带。 原 因 对策 引物特异性差 模板或引物浓度过高 退火温度偏低 循环次数过多 重新设计引物或者使用巢 式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当提高退火温度或使用 二阶段温度法 减少循环次数 PCR常见问题之三-拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状 态 M 1 2 原 因 对策 模板不纯 退火温度偏低 循环次数过多 纯化模板 适当提高退火温度 减少循环次数 PCR常见问题之四-假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原 因 靶序列或扩增产物的交叉污染 对 策 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪 内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材 均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应 一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 提高PCR反应特异性策略 巢式PCR（Nest-PCR） 递减PCR（TouchDown PCR） 热启动PCR（HotStart PCR） 使用PCR增强剂 策略之一巢式PCR PF1PR1 PF2 PR2 u 巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点 的可能性，因为同多套引物都互补的靶 序列很少。 u 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀 有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难 PCR（如5 RACE）的特异性。 策略之二递减PCR u 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严 谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的 Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循 环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。 u特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些 产物在随后的循环中继续扩增占据优势。 u递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同 源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指 纹分析等。 策略之三热启动PCR u 热启动主要是通过抑制一种基本成分延 迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度； u现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售 ，该酶具有热启动的性能，使用简单方便 ，适合于高通量应用； u热启动PCR是除了好的引物设计之外， 提高PCR特异性最基本的方法之一。 策略之四使用PCR增强剂 u 甲酰胺、DMSO、TMA、甜菜碱等 都可充当PCR的增强剂。 u其可能的机理是降低熔解温度，从而 有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸 通过二级结构区。 u增强剂浓度要适当。 实时荧光定量FQ-PCR 通过实时监测扩增产物量（荧光信号）与起始靶基因量相 关而定量, 扩增产物荧光强度达到对数期的循环数(Ct值,Cycle threshold）与靶模板起始拷贝数的对数存在负相关(右图)。 常规终末PCR问题: 同一样本重复复48管反应PCR终末检测或平台期检 测变化非常大,无法精确定量(左图)。 荧光定量PCR关键问题 扩增曲线：一般任意引物对PCR常见30个循环就有严重PD 非特异性扩增(左图);HANDS ,Nucleic Acids Res.,1997,Vol.25(16): 32153241采用artificial homo引物完全消除PD非特异性,但显 著降低特异性扩增效率。 Copy/pcr: 4108, 4107, 4106, 4105, 4104, 4103, 4102,4101,和4100, 0 Common Ct: 13, 16, 19.5, 23, 26, 29, 30, 30.5, 30.5, 31 Hands Ct: 12.5, 16, 19.5, 22, 25.5, 29, 32.5, 36, 38， Liner Fig 1.Common Primer PCRFig 2. Improved Hands PCR Improved Hands使用Partial-homo引物对荧光PCR不影响靶特 异性效率, 而将PD非特异性扩增推迟至40/45个循环之后(右图) 。 荧光定量PCR常见问题 无Ct值（信号）出现 或出现过晚： 阴性对照出现 明显的扩增： 荧光PCR mix或水污染； 出现引物二聚体：设计特异性引物。 反应循环数不够； 检测荧光信号步骤有误； 引物、探针设计不佳或降解； 模板量少或降解。 扩增片段过长：100200bp。 荧光定量PCR常见问题 溶解曲线不止一个主峰： 引物设计不佳：设计特异性引物； 退火温度低：调整退火温度； 模板中有基因组污染：注意提取过程； 反应体系污染等：设置阳性阴性对照。 荧光定量PCR常见问题 扩增效率低： 重复性不好： 反应体系中部分成分尤其是荧光染料降解； 反应条件不佳：延长退火、延伸时间，改为三步法， 降低退火温度，提高引物浓度，重新设计引物； 反应体系中有抑制物：一般为模板引入。 加样不准确或试剂不稳定； 仪器温度或光