组织学与胚胎学的研究方法.ppt

组织胚胎学 -人体发育和功能组织学 组胚教研室 王海涛 欢迎大家学习 组织学与胚胎学的早期研究和发展 现代组织学与胚胎学的研究和发展 我国组织学和胚胎学的研究和发展 组织学与胚胎学的研究方法 内容提要 组织学(histology)：研究机体微细结构及其 相关功能的科学 胚胎学(embryology)：研究个体发生发育及 其有关机制的科学 基础：细胞学 研究方法：显微镜观察 研究水平：细胞、亚细胞 在发展历程中，二者的研究内容相互交叉 和推进 组织胚胎学(histo-embryology)：人体发育和 功能组织学 个体发生起始于受精卵。 受精卵经分裂增殖和细胞分化，形成多种 不同类型的细胞(cell) 。 机体的一种或几种细胞聚集形成一定构型 的组织(tissue)。组织由细胞和细胞间质（ 细胞外基质）组成。组织有多种类型，每 种具有一定的形态结构特征和相关的功能 。基本组织有四种：上皮组织、结缔组织 、肌组织和神经组织。 几种组织相互结合，组成器官和系统 一、组织学与胚胎学的 早期研究和发展 古代-15世纪解剖学组织学胚胎学的发展 古代 中医书中即有解剖、脏腑的记载。 古希腊对胚胎学作出了重大贡献（Hippocrates 和 Aristotle）。 前2世纪，古罗马医生Galen著作中记录了胃肠、 子宫等器官的分层结构，关于胎儿的形成描 述了羊膜、尿囊和胎盘结构。 中世纪（6-14世纪） 发展缓慢。 有些医书中可见解剖资料叙述。 近代解剖学组织学胚胎学的发展 16世纪 意大利da Vinci绘制700多幅解剖图，大多数相当 准确。 比利时医生Vesalius是现代解剖学的奠基者，1543 年发表人体的构造。 英国Harvey发现血液循环，观察鸡胚和哺乳动物 胚胎发生，发表心血管运动论胚胎发生论 ，强调“一切动物皆起源于卵”，认为胚胎由子 宫分泌 17世纪 显微镜发明，打开了新的观察领域。 细胞发现。 脾、肺、肾、皮肤等一些器官结构被揭示。 卵泡发现。 两栖类卵子人工受精实验，提出两性配子的结合 是个体发生的前提 胚胎学流行“先成论”，认为胚胎是在生殖细胞中 预先存在的，发育不过是继续长大。 18世纪 德国人Wolff用显微镜直接观察胚的发育，认为卵 中没有预先形成的物质，也没有组织和器官，否 定“先成论”，主张胚胎是逐渐分化演变而成的 “渐成论”。 清朝王清任1796年写成医林改错。 19世纪 法国人Bichat发现组织(tissue)，1801年发表膜的 研究，将其分为21种。 德国人Mayer于1819年提出histology。 德国人Von Bear提出贝尔定律。 德国Remark在Bear工作基础上，提出三胚层学说 。 达尔文1859年发表物种起源。 德国人Schleiden和Schwann创立细胞学说。 奥地利人Mendel于1865年创立细胞遗传学说。 德国人Weismann于19世纪末提出机体细胞有生殖 细胞和体细胞之说，认为生殖细胞含有决定胚胎 细胞分化为不同组织的“决定子”。 丹麦人Jahanngen于1909年将遗传因子命名为 “gene” 德国人Roux于1887年进行分割蛙卵分裂球试验， 开创了实验胚胎学研究 His最早制作胚胎连续切片并进行三维重建，研究 胚胎各系统和器官的发育 Golgi于1889年发明银染技术，发现神经细胞内的 “内网器”（高尔基体） Altman于1894年作活体细胞染色，在多种动物和 植物细胞中看到线粒体 许多重要的细胞和组织结构在19世纪中、后期发 现和命名 20世纪，是现代组织学和胚胎学蓬勃发展的 时期，新技术和新仪器不断涌现并应用于 细胞学、组织学、胚胎学的研究 二、现代组织学与胚胎学研究和发展 三、我国组织学与胚胎学研究和发展 开始于20世纪初 50年代起，我国组织学与胚胎学事业发展 进入一个新的时期 近20多年是我国组织学与胚胎学事业蓬勃 发展、快速进步的最佳时期 四、组织学与胚胎学的研究方法 一般光学显微镜术 几种特殊显微镜的应用 组织化学和细胞化学术 免疫细胞化学术 原位杂交术 放射性核素示踪术 细胞和细胞化学定量术 电子显微镜术 组织培养术 细胞融合术 显微外科术 1、一般光学显微镜术 切片制备 石蜡切片：最常用 冷冻切片：常用于酶组织化学染色 涂片、磨片、铺片、连续切片 染色 碱性染料：含氨基、二甲氨基等碱性助色团的染料 酸性染料：含有羧基、羟基、磺基等酸性助色团的 染料 嗜酸性、嗜碱性、中性 最常用的染色方法是苏木精和伊红染色法，简称HE 染色法 2、几种特殊显微镜的应用 荧光显微镜：用来观察标本中的自发荧光 物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构 相差显微镜：用于观察组织培养中活细胞 形态结构 暗视野显微镜：用于观察因反应或分辨力 不足的微小颗粒，可分辨0.004-0.2微米 的微粒，适用于观察细胞内线粒体运动及 标本中细菌等微粒的运动 共聚焦激光扫描显微镜：可对细胞的多种 功能进行全自动、高效、快速微量定性和 定量研究等 3、 histochemistry 和 cytochemistry 糖类：显示多糖和蛋白多糖的常用方法是 过碘酸希夫反应（PAS反应），原理 多糖醛紫红色沉淀 过碘酸 氧化 Schiff 试剂 PAS染色示肝糖元 PAS染色 脂类：包括脂肪和类脂。标本用甲醛固定，冷冻 切片，脂类保存较好。常用苏丹染料、油红O， 尼罗蓝等溶于脂类的染料染色 酶：目前有100多种酶组织化学染色法，基本原理 是利用酶对其相应底物的水解、氧化等作用，然 后再使底物的反应产物与某种捕获剂发生反应， 形成沉淀或有色的最终产物，借此检测该酶在组 织切片或细胞内的分布及活性强弱 核酸：显示DNA的传统方法是福尔根反应 (Feulgen reaction)，切片先用稀盐酸处理，使DNA 分子中脱氧核糖与嘌呤之间的联接键打开，形成 醛基，再与希夫试剂作用。原理同PAS反应，使 细胞核DNA显紫红色 4、immunocytochemistry/immunohistochemistry 是应用免疫学原理，通过抗原与抗体的特异 性结合，显示组织内和细胞内的多肽、蛋白质及 膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。 。这种检测技术的特异性强、灵敏度高、应用广 泛，是生物学和医学领域中的重要研究手段。通 常需对已知抗原或抗体进行标记，用相应的显色 和观察方法检测目的抗体或抗原。常用的标记物 有荧光素、铁蛋白、辣根过氧化物酶等 荧光素标记显示皮肤毛细血管内皮细胞 免疫组织化学 免疫荧光技术 5、原位杂交技术(in situ hybridization) 是一种核酸分子杂交技术，通过检测细胞内 mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽 或蛋白质的基因表达。基本原理是用已知碱基序 列并具有标记物的RNA或DNA片段即核酸探针（ nucleic acid probe），与组织切片或细胞内的待测 核酸进行杂交，通过标记物的显示，在显微镜下 观察目的mRNA或DNA的存在与定位。用核酸杂交技 术检测细胞内某一基因在染色体上的定位，称染 色体原位杂交。用核酸杂交技术检测某一基因的 转录物mRNA的细胞定位和转录状况，称细胞原位 杂交 核酸探针：主要有三种 利用大肠杆菌重组带有目的基因的质粒 DNA，制成互补DNA探针（cDNA） 应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA 模板，在体外转录获得反义RNA探针（ cRNA） 依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNA合 成仪合成寡聚核苷酸探针 原位杂交示脐静脉内皮细胞呈心房钠尿肽阳性 6、电子显微镜术 透射电镜术 Transmission electron microscopy，TEM 是用电子束穿透标本，经过电磁场的会聚 、放大后，在荧光屏上显像，或将影像投 射到照相底片 由于电子束穿透力弱，故经过固定的电镜 标本需制成超薄切片（5080 nm） ，并 用重金属盐如柠檬酸铅和醋酸铀等染色 扫描电镜术 Scanning electron microscopy，SEM 用于观察细胞、组织和器官表面的立体细 微结构 需将小块组织经固定、脱水、干燥后，在 其表面喷镀薄层碳膜和金属膜 图像清晰，富有立体感 电镜扫描图 肺巨噬细胞吞噬大肠杆菌 电镜扫描图 电镜图（冷冻蚀刻） 7、组织培养技术(tissue culture) 是将离体细胞或组织放置在适当的环境 条件下进行培养的一种技术方法，可用以 检测各种理化因子、细胞因子等对细胞增 殖、分化、代谢、运动、吞噬、分泌等生 命活动和细胞行为的影响，还可用细胞培 养技术研究细胞癌变、逆转的机制。 子宫内膜上皮细胞 体外培养的大鼠肝细胞 8、细胞和细胞化学定量术 显微分光光度定量术：应用显微分光光度计 测定组织化学和免疫组织化学染色标本的反 应强弱，进行化学成分的定量分析 形态定量术：运用数学和统计学原理对组织 和细胞进行二维和三维的形态测量研究。其 中三维立体结构的研究又称体视学 流式细胞术：应用流式细胞仪对单个细胞生 物化学和生物物理特性进行快速定量测定 流式细胞术 应用流式细胞仪对单个细胞进行生物化学和生物物 理特性的快速定量测定，可进行细胞周期各时相细 胞的比例和细胞内DNA、RNA、蛋白质的含量分析， 淋巴细胞亚群的分离和定量，血细胞增殖情况的分