[自然科学]第九章 蛋白质的测定.ppt

第九章 蛋白质的测定 王建龙 食品科学与工程学院 第九章 重点 1.凯氏定氮法原理、分步、测定方法。 2.双缩脲法测定原理。 3.氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。 一、概述 1、食品中的蛋白质含量 各种不同食品的蛋白质含量各不相同，一般动 物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。 食品中的蛋白质含量(g/100g) 牛肉 猪肉 兔肉 鸡肉 20 9.5 21 20 大豆 米 面粉 菠菜 苹果 40 8.5 10 2.4 0.4 2、蛋白质的生理功用及在食品中的作用 构成人体的重要成分； 构成体内多种具有重要生理功能的物质； 参与调节和维持体内的酸碱平衡及胶体渗 透压； 参与神经冲动的传导、思维活动和遗传信 息的传递 提供能量; 食品的重要营养指标。 3、蛋白质系数 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，一般蛋白质 含氮量为16，即一份氮素相当于6.25份蛋白质， 此数值（6.25）称为蛋白质系数，不同种类食品的 蛋白质系数有所不同。 样品 蛋白质 系数 样品 蛋白质系 数 小麦粉及其制 品 5.70 畜禽肉及其制 品 6.25 全麦5.83芝麻5.30 大米5.95乳类6.38 花生5.46黄豆5.71 二、测定方法 蛋白质测定方法 凯氏定氮法 蛋白质快速测定法 （一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003) 凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量 再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的 含量，由于样品中含有少量非蛋白质,用凯 氏定氮法通过测总氮量来确定蛋白质含量 ，包含了核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉 、以及含氮色素等非氮蛋白质含氮化合物 ，所以这样的测定结果称为粗蛋白。 The Kjeldahl Procedure 凯氏法的程序 1. Digestion step 消化 2. Distillation step 蒸馏 3. Titration step 滴定 1、原理 2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2+12S O2+16H2O 消化 (NH4)2SO4+2NaOH2NH3+Na2SO4+2H2O 蒸馏 浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢 、氮。浓硫酸又具有氧化性,将有机物炭化后的碳化为 二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫。 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2 2、仪器 凯氏烧瓶、可调式电炉、蒸汽蒸馏装置 3、试剂 （1）硫酸铜（CuSO45H2O）； （2）硫酸钾； （3）浓硫酸:密度为1.8419 g/L （4）氢氧化钠溶液:400g/L （5)硼酸溶液:20g/L （6） 0.05 molL盐酸标准滴定溶液 （7）95%乙醇。 （8）混合指示液:1份甲基红乙醇溶液(1 g/L)与5份 溴甲酚绿乙醇溶液(1 g/L)临用时混合。也可用2 份甲基红乙醇溶液(1 g/L)与1份亚甲基蓝乙醇溶 液(1 g/L)临用时混合。 甲基红-溴甲酚绿 pH 5.0 以下为暗红色，pH 5.1 为灰绿色， pH 5.2 以上为绿色。 甲基红-亚甲基蓝混合指示液： 变色点pH=5.4，5.2（红紫） 5.4（灰蓝）5.6（绿）， 4、操作方法 样品消化蒸馏滴定 （1）样品消化 样品+0.2g硫酸 铜+6g硫酸钾 +20ml浓硫酸+ 玻珠数粒 先小火炭化，无泡沫 后，加大火力，液体 变蓝绿透明，继续加 热微沸30分钟 45度角 消化终点 瓶口不能对着人 盖上小漏斗 （2）蒸馏 按下图连接好蒸馏装置图 加水至2/3体积处，加数 滴甲基橙指示剂和硫酸 几毫升，使水呈酸性 夹紧螺旋夹 加热蒸汽发生瓶中的水，检查整套 装置是否有漏气现象，不能漏气 。 水蒸气与生成的氨气共沸，不断 移除氨气，使反应继续。 （2）蒸馏 将消化液全部转移 到100ml容量瓶中 加10ml硼酸溶液和 混合指示剂23d 加入NaOH溶液后颜色 为深蓝色或褐色 通入蒸汽开始蒸馏 冷凝管下口浸入 硼酸溶液中 取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反 应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻 璃塞，向小玻璃杯内加入 10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH缓 慢流入反应室，立即塞紧玻璃塞，并 在小玻璃杯中加水使之密封。 吸收液变蓝色后继 续蒸馏5分钟，将冷 凝管尖端提离液面 再蒸馏1min，用蒸 馏水冲洗冷凝管尖 端，取下接收瓶， 关闭电源 （3）滴定 取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸或硫 酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。 滴定前滴定终点 同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。 5、计算 0.014表示1.0盐酸标准滴定溶液相当氮的含量 F表示蛋白质系数 计算结果保留三位有效数字 6、说明及注意事项 （1） 试剂溶液应用无氨蒸馏水配制 （2）消化时不要用强火，应保持缓和沸腾，消 化中不时转动凯氏烧瓶，以便冷凝酸液洗下 附在瓶壁上的固体残渣，促进其消化完全。 （3）为加速消化，常加入 硫酸钾：可提高消化体系溶液温度 硫酸铜：催化剂、消化终点指示剂、蒸馏 时碱性反应指示剂 硫酸钾的作用 加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解， 它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度其反应式如下 ： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 一般纯硫酸的沸点在340摄氏度左右，而添加硫酸钾 后，可使温度提高到4000C以上，原因主要在于随着消化 过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度 增大 ，故沸点升高。 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高， 又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失： （NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O 硫酸铜的作用 催化剂 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 CO2+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚 铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。 可以指示消化终点的到达 下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。 （4）样品中若含较多脂肪或糖，在开始消化时 应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量 辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意 控制热源强度。 （5）当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏 烧瓶冷却，加入30%过氧化氢23ml后再继续 加热消化。 （6）若取样量较大，如干试样超过5g，可 按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。 （7）一般消化至呈透明后，继续消化30分 钟即可，一般消化时间约4小时，时间延长 可能引起氨的损失。有机物如分解完全， 消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时， 呈较深绿色。 （8）蒸馏装置不能漏气 （9）蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不 生成氢氧化铜沉淀，需再增加氢氧化钠用量 （10）硼酸吸收液的温度不应超过40，否 则对氨的吸收作用减弱，置于冷水浴中使用。 （11）蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离 液面,清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则 可能造成吸收液倒吸。 7、自动凯氏定氮仪法 在凯氏定氮法的基础上发展起来的自动凯氏 定氮仪法，具有安全、高效、准确的优点。 仪器： 消化炉 自动蒸馏装置 FOSS 产品线化学分析仪器 化学分析类仪器：Kjeltec系列定氮仪 FOSS 产品线化学分析仪器 化学分析类仪器：Tecator系列消化 器 Digestion Blocks 消化炉 Auto 20 and Auto 8 250/400ml. 和 100ml. Basic 20 and Basic 8 250/400ml和100ml New Auto 40 100 ml Lift, Exhaust Manifold and Scrubber 消化炉、升降装置、排废罩和涤气装置 New generation of Kjeltec Systems 新一代凯氏定氮仪-前所未有的智能化系统！ 8200 8400 半自动 -到- 全自动 8100 8400/8420或8460 New KjeltecTM 8100 凯氏定氮仪 自动添加稀释液和碱，自动进行 蒸馏和结束蒸馏，自动进行消化 管排空，操作简便。 专利的SAfE*技术保证在消化管 中有酸/盐结晶时的安全蒸馏。 内置的安全系统保证操作者的安 全。 馏出液的温度控制系统保证分析 结果准确可靠。 风箱泵精确添加试剂，保证准确 性。 KjeltecTM 8200 凯氏定氮仪 包含KjeltecTM 8100 所有的特征，另 加： 自动添加接收液 自动安全门 可增加模块升级到全自动凯氏定 氮仪 KjeltecTM 8400 全自动凯氏定氮仪 包括 KjeltecTM 8200的所有特征， 外加： 滴定、计算和报告。 可升级和20或60位自动进样器连 用，进行无人值守的全自动化操 作。 局域网连接方式能够和打印机及 天平进行无障碍连接。 彩色触摸屏。 通过可选计算机数据管理软件 Compass实现完全由计算机控制 样品注册和报告。 KjeltecTM 8420 自动进样器 20位自动进样器，可容纳一 个20位消化管架 250ml和400ml消化管都可用 于系统 将消化管架直接装入进样器 ，不需要转移消化管或消化 好的样品 KjeltecTM 8460 自动进样器 60位自动进样器，可容纳3个 20位消化管架 250ml和400ml消化管都可用 于系统 将消化管架直接装入进样器 ，不需要转移消化管或消化 好的样品 KjeltecTM 自动进样器 可选20 V1用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准 溶液的体积，mL; V2用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准 溶液的体积，mL; m测定用样品溶液相当于样品的质量，g 0.014氮的毫摩尔质量，g/m mol (3) 结果计算 氨基酸态氮 （%） 2.电位滴定法 (1) 原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的 碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电 极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用 氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH 值判断和控制滴定终点。 (2) 仪器 酸度计（附磁力搅拦器）； (3) 试验步骤 吸取含氨基酸约20mg的样品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度 ，混匀后吸取20.0mL烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用 0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2（记下消耗 0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数，可计算总酸含量）。 加入0.1mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴 定至pH9.2，记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数。 同时取80m