植物组织培养的原理及特点.ppt

第二章 植物组织培养的原理及特点 主要内容: 1.植物细胞的全能性及全能性的实现（重点） 2.植物离体分化过程的类型 3.植物组织培养的特点 4.植物组织培养所需营养与环境条件 1. 植物细胞的全能性（totipotency) 及全能性的实现 根据细胞理论，细胞是生物有机体 的 基本结构单位，特别是植物细胞又是在 生 理上，发育上具有潜在全能性的单位。 所谓细胞全能性:是指植物的每个 细 胞都具有该植物的全部遗传信息和发育 成 完整植株的能力。 换句话说，细胞的全能性是一个植 物 细胞产生一个完整植株的固有能力，不 管 是性细胞还是体细胞，在特定环境下仍 能 进行表达，而产生一个独立完整的个体 。 植物细胞的全能性的具体含义 在植物的生长发育中，从一个受精卵，以后可产生具有完整形态和结构 机能的植株，这是全能性，是该受精卵具有该物种全部遗传信息的表现。 植物的体细胞是从合子的有丝分裂产生的，也具有全能性，具备着遗 传 信息的传递，转录和翻译的能力。在一个完整的植株上，某部分的体细胞 只 表现一定的形态，承受一定的功能，这是由于它们受到具体器官和组织的 束 缚，但其遗传潜力并没有丧失 差 异：受精卵的全能性最高 。 受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。 植物细胞在什么条件下表现出全能性呢? 一旦脱离原来所在的器官和组织，处于离体状态时，在一定的营 养 物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成 完 整的植株。 人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。 生物体内的细胞为什么没有表现出全能性,而是分化成不同的组 织、 器官? 基因在特定时间和空间条件下选择性表达的结果。 n高等植物是由无数不同形态、不同生理生化特点及执行不同功能 的细胞构成：一部分细胞继续保持分生能力，如分生组织；另一 部分细胞逐渐分化失去分生能力而执行其他功能，处于不分裂状 态，如永久组织。 n植物组织培养不仅能使处于分生状态的细胞继续保持分裂能力， 同时也可使永久组织恢复分裂能力，如同生殖细胞或合子胚一样 。 n一个已分化的细胞若要表现其全能性： 首先要经历脱分化过程，然后再经历分化过程。 植物细胞全能性的实现 植物细胞的脱分化 一个已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态并形成未分化的愈伤组织 的 现象叫脱分化。即原已分化并具有一定功能的植物细胞脱离原有轨道，失 去 原有状态和功能而回复到能分裂和增殖的愈伤组织状态，这就是植物组织 培 养中的去分化或脱分化过程。组织培养中，利用特定的条件，促进细胞脱 分 化， 脱分化（dedifferentiation): 脱分化过程的难易与植物种类、组织和细胞状态有关 。 u一般单子叶植物和裸子植物比双子叶植物难； u成年细胞和组织比幼年细胞和组织难； u单倍体细胞比二倍体细胞难。 植物细胞的脱分化的难易 植物细胞的再分化 把原已分化的细胞，经脱分化培养后再次进行分化的现象叫再分 化。 再分化有两种方式：一种是器官发生，一种是胚胎发生。 在大多数情况下，再分化过程是在愈伤组织细胞中发生的,但在有 些情况下，再分化可以直接发生于脱分化的细胞中，无须经历愈伤组 织阶段。 再分化（redifferentiation): 植物细胞实现全能性的过程 经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下具有转变 为 各种不同细胞类型的能力。切取的植物组织、器官和细胞 ， 在人工培养条件下，可促进脱分化，产生愈伤组织，然后 经 过继代培养，通过人为控制又可产生分化，即再分化，产 生 分生组织，继而进行形态建成，最终分化出各器官，产生 完 整植株。 图示: 备注：在有些情况下，再分化也 可不经愈伤组织阶段，而直接发 生于脱分化的细胞。 外植体 愈伤组织 生长点 根、茎、叶 或胚状体 小植株 脱分化 再分化 生 长 小结 n应当着重指出的是，对于植物细胞来说，全能性是一个相当基本的属性 ，但全能性只是一种可能性 n要把这种可能性变为现实性必须满足两个条件：一是要把这些细胞从植 物体其余部分的抑制性的影响下解脱出来，即处于离体状态；二是要给 予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的 激素的作用. n一个已分化的细胞若要表现其全能性: 首先要经历脱分化过程，然后再经历分化过程。 2. 植物离体分化过程的类型 1978年，罗士韦根据植物组织培养再分化过程的不同 ， 将其划分为以下五种类型： 无菌短枝型 丛生芽增殖型 器官发生型 胚状体发生型 原球茎发生型 具体做法是：将待繁殖的材料剪成带一叶的单芽茎段，转入 成 苗培养基，一定时间后可成苗，再剪成带一叶的单芽茎段， 继 代又可成苗。 特点：该方法一次成苗，遗传性状稳定，培养过程简单，适 用 范围大，移栽容易成活。 实例：这是葡萄试管苗繁殖最常用的，也是其它方法最后阶 段 的常用方法，但繁殖初期速度较慢。 2.1 无菌短枝型 无菌短枝 切 割 2.2 丛生芽增殖型 n方法：茎尖或初代培养的芽，在适宜的培养基上诱导， 不 断发生腋芽，而成丛生芽，然后转入生根培养基，诱导生 根 成苗，扩大繁殖。 n特点：这种方法从芽到芽，遗传性状稳定，繁殖速度快 ， 是茎尖培养和脱毒苗初期必由之路，但过程较复杂，品种 之 间的差异较大。 芽（单芽、丛芽） 丛生芽 分 离 顶芽 腋芽 丛生芽的发育I 微型扦插 顶 芽 CTK刺激 带芽的 茎切段 侧 芽 接种培养 形成的茎梢节长，直 立向上呈小灌木丛状 获得较多嫩茎梢 茎段培养 继代扩繁 试管苗 生根培养 无愈伤组织产生 初 代 继 代 丛生芽的发育II 2.3 器官发生型 方法：从植物叶片、子房、花药、胚珠、叶柄等，诱导出愈伤 组织，从愈伤组织上诱导不定芽，进一步发育，形成完整植株 特点：这种方法从原来成熟组织上重新诱导出分生组织，发生 单芽或丛生芽，可扩大繁殖，也可创造有益突变体体，但可能 会发生变异，用于良种繁殖时应注意。 愈伤组织培养 愈伤组织 具分裂能力的细胞 已分化细胞 脱分化 继 代 愈伤组织 分 裂 诱导期 分裂期 形成期 愈伤组织诱导期 诱导期是外植体细胞进行细胞分裂的准备时期，是愈伤组织形成的起 点。 特点：处在静止状态的成熟细胞通过一些刺激因素和激素的诱导作 用，使其细胞内合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸物质的合成 ，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大，细胞大小变化不大。 诱导期的长短，因植物种类、外植体的生理状况和外部因素而异。 外源生长物质对诱导细胞开始分裂效果最好。最常用的有2,4-D、 NAA、IAA和细胞分裂素等。 愈伤组织分裂期 指细胞通过一分为二的分裂， 不断增生子细胞，即发生脱分化的 过程。 特征：细胞分裂快，细胞体积迅速 变小当细胞体积最小，细胞核和 核仁最大，细胞内无大液泡， RNA含量最高时，标志细胞分裂 进入了高峰期 愈伤组织形成期 形成期是指外植体细胞经过诱导期和分裂 期后形成无序结构的愈伤组织。 特征：细胞的平均大小相对稳定，不再减 小细胞分裂由原来局限在组织外缘的平 周分裂转为组织内部的较深层局部细胞的 分裂, 形成瘤状结构的外表和内部分化； 出现多种类型的细胞。 脱分化 分 化 愈伤组织 芽、芽丛 切割芽丛 继代培养 大量芽丛 试管苗 生根培养 外植体 初 代继 代 不定芽的发育 2.4 胚状体发生型 指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状 结 构，进而长成完整植株。我们把由愈伤组织的类似薄壁组 织 细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚 状 体。 胚状体 (somatic embryo): 胚状体 在外观上，这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起的形状。 外 植 体 愈伤组织 小孢子 游离单细胞 器 官 胚 状 体 试 管 苗 体细胞胚状体的发育 n特点：这种胚状体具有数量多，结构完整，易成苗和繁 殖速度快的特点，是植物离体无性繁殖最快的方法，也 是人工种子和细胞工程的前提，受到国内外的普遍重视 。 n注意：能诱导胚状体的植物种类及品种还不多，其发生 机理尚不清楚，有的还存在一定变异，应先经试验后才 能在生产上大量应用。 胚状体发生型特点 原球茎特点: 缩短的、呈珠粒状的、由胚性 细胞组成的、类似嫩茎的器官。 2.5 原球茎发生型 原球茎发生型 大部分兰花的培养属于这一类型。原球茎是一种类胚 组织，培养兰花类的茎尖或腋芽可直接产生原球茎，继而 分化成植株，也可以继代增殖产生新的原球茎，这取决于 培养条件和培养基。 3.植物组织培养的特点 3.1 培养材料经济 3.2 培养条件可人为控制 3.3 生长周期短，繁殖率高 3.4 管理方便，利于自动化控制 植物组织培养的特点 3.1 培养材料经济 由于植物细胞具有全能性，故单个或小块组织细胞培 养 即可再生植株，这在研究上有重大价值。 在生产实践中，由于取材少，培养效果好，对于新品 种的推广和良种复壮更新，都有重大的实践意义。 3.2 培养条件可以人为控制 组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质 和 小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的 变 化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极 为 有利，便于稳定地进行周年培养生产。 培养条件可以人为加以控制 3.3 生长周期短，繁殖率高 植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物 不 同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。 另 外，植株也比较小，往往2030d为一个周期。 所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但 由 于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉， 且 能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。 繁殖系数大，培养周期短 3.4 管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的 温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和 高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工 厂化育苗的发展方向。 管理方便，有利于实现工 厂化生产和自动化控制 4.1 植物所需必需元素的生理作用 植物需要若干矿质元素、气体元素及某些生理活性物质等来维持自己 的 生存，这些必需元素有四个方面的生理作用： 作为结构物质参与机体的建造、如C、H、O、N等。 构成特殊的生理活性物质，在代谢中起调节作用， 如VB族等。 维持离子浓度的平衡，电荷平衡，胶体平衡等。 影响器官的形态发生和建成，如K、Fe等。 4. 植物组织培养所需营养与环境条件 4.2 植物组织培养所需营养与环境条件 植物组织培养需要一定的营养及环境条件，主要包括以 下 八方面内容： 4.2.1 无机营养 4.2.5 能源和渗透压 4.2.2 有机营养 4.2.6 其它成分 4.2.3 植物生长调节物质 4.2.7 温 度 4.2.4 琼 脂 4.2.8 光 照 4.2.1 无机营养 无机营养在植物发育中非常重要，镁Mg是叶绿素分子的一部分，钙 Ca 是细胞壁的组分之一，氮N是各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重 要 组成部分。此外，铁Fe、钼Mo、锌Zn等是某些酶的组成部分，植物除了 C、H、O外，已知还有12种元素对于植物的生长是必需的，它们是N、 P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、Cu、Zn、B、AI。 其中前6种元素需要的数量大，因此称为大量元素或主要元素（一 般 指浓度大于0.5mmol/L）；后6种元素需要的数量较小，因此称为微量元 素 或次要元素（一般指浓度小于0.5mmol/L）。 4.2.2 有机营养 n植物组织培养中，经常使用的维生素及其作用： VC： 防止组织褐化； VB1：与愈伤组织的产生和生活力有关； VB6：促进根的生长； 烟酸：促进胚的发育； 肌醇：利于胚和芽的形成。 维生素类 氨基酸：是重要的有机氮源。 (1)甘氨酸 (2)丝氨酸 (3)酪氨酸 氨基酸类 (4)谷氨酰胺 (5)水解酪蛋白(CH) (6)水解乳蛋白(LH) 有机添加物 椰乳 香蕉 马铃薯 酵母提取液 麦芽提取液 苹果汁 番茄汁 柑桔汁 4.2.3 植物生长调节物质 植物生长调节物质包括: u 生长素; u 细胞分裂素; u 赤霉素等。 4.2.3.1 生长素 生长素常用的有： n2,4二氯苯氧乙酸(2,4D)； n萘乙酸(NAA)； n吲哚乙酸(IAA)； n吲哚丁酸(IBA)等。 生长素的作用 n生长素的主要作用是：诱导愈伤组织形成；诱导根的分化;促进根 、茎、芽的生长。 n它们的作用大小为2,4-D NAAIBAIAA。 nIAA为天然植物生长素，也可用化学方法合成，它见光易分解，高 温高压时也易破坏，故应置于棕色瓶中，放在45下保存； IBA、NAA、2,4D都是人工合成的物质，它在120下仍然稳定 。 NAA nA：NAA 0mg/L，芽（少），根（无） nB：NAA 0.1mg/L，芽（少），根（无），愈伤组织（少量） nC：NAA 0.5mg/L，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量） A B C 4.2.3.2 细胞分裂素 细胞分裂素的主要作用： (1)有促进细胞分裂和分化； (2)延迟组织衰老； (3)增强蛋白质合成； (4)抑制顶端优势； (5)促进侧芽生长； (6)显著地改变其它激素作用的特点。 细胞分裂素的种类 细胞分裂素常用的有:激动素(KT);6-苄基氨基嘌呤(6-BA); 玉米素(ZT);2-异戊烯腺嘌呤(2ip)等。 它们作用的强弱顺序为：ZT=2ip6-BAKT。 它们经高温高压灭菌后性能很稳定，只是KT见光易分解， 故应在45低温黑暗下保存。 BA nA：BA(0mg/L) ，芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量） nB：BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量） A B 4.2.3.3 赤霉素 n赤霉素-在组织培养中使用的只有GA3一种，它是一 种天然产物，能促进已分化的芽的伸长生长。 小 结 n2,4-D多用于诱导脱分化，而诱导再分化一般用NAA、IBA 及IAA、NAA有利于单子叶植物的分化，IBA诱导生根效果最好。 n低浓度的2,4-D有利于胚状体的分化，但妨碍胚状体进一步发育。 n通常认为: 生长素和细胞分裂素的比值大时有利于根的形成,这时生 长素起主导作用；比值小时，则促进芽的形成，这时细胞分裂素起 主要作用。 n故应根据植物的种类和培养部位，选择适宜的生长调节物质的种类 和浓度，才能有效地控制器官的分化。 4.2.4 琼脂 n琼脂是一种高分子碳水化合物，从海藻中提取。 n它的主要作用是使培养基在常温下凝固，以作固体培养 用.另外，琼脂还可以吸附某些代谢有害物质。 4.2.5 能源和渗透压 在培养基中添加糖，作为碳素来源和能量物质，同时糖