CR原理与操作--王.ppt

1 聚 合 酶 链 式 反 应 Polymerase Chain Reaction PCRPCR 博士生导师：王斌 2012.10.29 病原生物学 2 生命现象是自然界最复杂的现象 What is life? The feature of the life The life on the Earth 科学认识生命 3 现代生命科学研究的里程碑之一 1839年 细胞学说 19世纪30年代，德国植物学家 施莱登（Matthias Jacob Schleiden，1804- 1881）首先指出，所有植物体都是由细胞构成 的。他的这个观点被德国动物学家施旺（ Theodor Schwann，1810-1882）在动物组织和 细胞研究中证实，所有动物也是由细胞构成的 。施旺指出：“细胞是有机体，整个动物或植物 体乃是细胞的集合体。它们依照一定的规律排 列在动物体内。”在此基础上他们创立了细胞学 说。 4 细胞学说将植物学和动物学联系在一起， 论证了整个生物界在结构上的统一性，以 及在进化上的共同起源，有力地推动了生 物学向微观领域的发展。 尽管细胞学说的某些部分已成为历史的陈 迹，然而其中心思想仍广泛而深刻地影响 了后来生物学的发展，任何生物学的重要 问题都必须从细胞中寻求最后的解答. 5 现代生命科学研究的里程碑之二 1859年 Darwin进化论： 达尔文（Charles Darwin ，1809-1882）发表物 种起源指出生物变异的 普遍性、变异与遗传的关 系， 提出了生存竞争和自然选 择学说，系统地论述了物 种形成的机制。 生物变异的普遍性、变异与遗传的关系，提出了生存竞争和自然选择学说，系统地论述了物种形成的机制。 6 达尔文在1859年出版的物种起源一书中系统 地阐述了他的进化学说。其核心自然选择原理的 大意如下：生物都有繁殖过剩的倾向，而生存空 间和食物是有限的，所以生物必须“为生存而斗争 ”。在同一种群中的个体存在着变异，那些具有能 适应环境的有利变异的个体将存活下来，并繁殖 后代，不具有有利变异的个体就被淘汰。如果自 然条件的变化是有方向的，则在历史过程中，经 过长期的自然选择，微小的变异就得到积累而成 为显著的变异。由此可能导致亚种和新种的形成 。 7 达尔文的进化理论还存在着若干 明显的弱点： 他的自然选择原理是建立在当时流行的“融合遗传”假说 之上的。按照融合遗传的概念 ，父、母亲体的遗传物质 可以像血液那样发生融合；这样任何新产生的变异经过若 干世代的融合就会消失，变异又怎能积累、自然选择又怎 能发挥作用呢？ 达尔文过分强调了生物进化的渐变性；他深信“自然界无 跳跃”，用“中间类型绝灭”和“化石记录不全”来解释古生物 资料所显示的跳跃性进化。他的这种观点近年正越来越受 到间断平衡论者和新灾变论者的猛烈批评。 8 1871年，达尔文又发表了人类的由来及其性 选择，描述了人类进化的过程。他的结论是 ：“人类和其他物种同是某一种古老、低级、早 已灭绝了的生物类型的同时并存的子孙”。 伟大革命导师马 克思对进化论给予了很高的评 价，把它与能量守恒和转换定律、细胞学说并 列为19世纪的三大自然科学发现。 9 一、基因及DNA双螺旋结构 二、DNA复制、转录及翻译 三、PCR原理 四、PCR操作 10 一、基因及DNA双螺旋结构 1、基因（gene）：遗传因子，是DNA或RNA分子上具 有遗传信息的特定核苷酸序列，基因通过指导蛋白质 的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物 个体的性状表现。 2、基因概念的提出：19世纪60年代，遗传学家孟 德尔提出了生物的性状是由遗传因子控制的观点。 20世纪初期，遗传学家摩尔根通过果蝇的遗传实验 ，认识到基因存在于染色体上，并且在染色体上是 呈线性排列，从而得出了染色体是基因载体的结论 。 11 1865年，孟德尔发表了 植物杂交实验，首次 阐述了生物界有规律的遗 传现象。“遗传因子” 1900年，孟德尔遗传规 律被证实，成为近代遗传 学基础。 遗传学是分子生物学发展的基础 12 3、DNA双螺旋结构的提出：1953年，James Watson和Francis Crick发现了DNA双螺旋的结构，开 启了分子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次 ，“生命之谜”被打开，人们清楚地了解遗传信息的构 成和传递的途径。1962年，共同荣获了诺贝尔生理学 或医学奖。 13 14 中 心 法 则 (The central dogma) microRNA 小分子RNA NcRNA 非编码RNA tRNA & rRNA 复 制 二、遗传信 息的传递： 15 1、复制：是以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。实质是在酶 促作用下，单个的脱氧核苷酸通过3，5-磷酸二酯键聚合的过程 。在复制过程中，DNA双螺旋解开成为两条单链(亲代链)，以每一 条单链为模板，按照碱基配对规律，各自合成一条与之互补的新 链（子代链），形成两个结构和碱基序列完全一致的子代DNA，其 中每一个子代DNA分子中都保留一条来自亲代的链。 复制 亲代DNA 子代DNA （一）DNA的复制：半保留复制 16 1958年，Meselson 和 Stahl 证明DNA半保留复制 Meselson-Stahl实验(米西尔逊-斯塔尔实验 ) 被称为“生物 学中最漂亮的实验 ” 17 复 制 过 程 简 图 18 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基 序列一致。 2、半保留复制的意义 遗传的保守。 物种的稳定。 决定后代的生物学性状和代谢类型。 19 （二）转录：RNA的生物合成 1、转录：生物体以DNA为模板合成RNA的过程，即以双链DNA中 的一条链为模板，以ATP、CTP、GTP和UTP4种核苷三磷酸为原料 ，在RNA聚合酶催化下合成RNA的过程。是mRNA、tRNA、rRNA等 的合成步骤，包括起始、延伸、终止3个步骤。 20 翻译：即蛋白质的生物合成，是将核酸RNA中密码 子破译的方式解读为蛋白质一级结构中20种氨基酸的 排列顺序 。翻译过程从5-AUG开始，按mRNA模板 三联体密码的顺序延长肽链，直至终止密码出现。 （三）翻译：蛋白质的生物合成 21 22 1、定义：聚合酶链反应（PCR）是在DNA聚合酶催化下， 以母链DNA为模板以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延 伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目 的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因 多态性研究等许多方面。 三、PCR原理 PCR是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 23 l1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构及半保留复制模型 。 l1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA半保留复制模型。 l70年代以来，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体 系，一是基因克隆技术，二是体外扩增技术。 l1971年，Khorana（美国，1968年诺贝尔医学奖得主）：“经过 DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重 复该过程便可克隆tRNA基因。” l核酸体外扩增最早设想被遗忘原因:（1）很难进行测序和合成 寡核苷酸引物；（2）1970年Smith等发现了II型限制性内切酶 ，体外克隆基因已成为可能。 2、PCR技术的发展历程 24 l1976年，台籍科学家钱嘉韵（Alice Chien）从黄石国家公园 的嗜热菌Thermus aquaticus中分离出对热稳定的Taq DNA聚 合酶。 l1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的Mullis发明PCR， Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人-珠蛋白的DNA，并应 用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。 l1985年，Science杂志报道了耐热性DNA聚合酶 Taq酶（ 生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合 酶），整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改 善，操作大为简化。此酶的发现,预示着分子时代的到来。 l1989年被誉为“分子年”，列PCR为十余项发明之首。 l1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。 25 3、PCR的原理 l遗传物质：细胞核 染色体 DNA（脱氧 核糖核酸、磷酸链和碱基构成) 碱基（A、T、C、G）是按双链螺旋排列的， 碱基序列的长度和排列顺序决定了生物的多 样性。 lPCR的基本工作原理：以拟扩 增的DNA分子为模板，以一对分 别与模板互补的寡核苷酸片段为 引物，在DNA聚合酶的作用下， 按照半保留复制的机理沿着模板 链延伸直至完成新的DNA合成。 26 lPCR反应的基本成分 ：模板DNA、特异性引物 、热稳定DNA聚合酶、脱 氧核苷三磷酸（dNTP） 、Mg2+等。 基本反 应步骤：变性-退火- 延伸，最后通过染料， 如EB染色DNA后在紫外灯 下显色检出 27 温度与时间的设置： 4 4、PCR PCR 的反应流程：的反应流程： l变性温度与时间：一般9394，1min足以使模板变性，若 低于93则需延长时间，但温度过高对酶的活性有影响。 l退火(复性)温度与时间：取决于引物的长度、碱基组成及其浓度 ，还有靶基因序列的长度，对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引 物，55作为选择最适退火温度的起点较为理想。 按下公式计算：Tm（解链温度）4(G+C)+2(A+T)； 复性温度=Tm值（510） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物 和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。一般为30 60s。 28 延伸温度与时间： 延伸温度：一般选在7075之间，常用温度为72，过高的延 伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间： 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min；34kb的靶序列需3 4min；扩增10kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增，但是对低浓度模板的扩 增，延伸时间要稍长些。 循环次数：循环次数决定PCR扩增程度，主要取决于模板 DNA的浓度，一般选在3040次之间循环次数越多，非特异性 产物的量亦随之增多。 29 12345 22 55 72 94 时间（min） 温度 （） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1-3步 25-35轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 30 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反 应最终的DNA 扩增量的计算： Y(1X)n Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效 率，n代表循环次数。 平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达 不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随 着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而 进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平 台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性 产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免 的。 5、PCR的反应动力学 31 PCR反应曲线 32 6、标准的PCR反应体系 10扩增缓冲液10l 4种dNTP混合物各200mol/L 引物10100pmol 模板DNA0.12g Taq DNA聚合酶2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至100l 33 7、PCR产物的检测 将反应产物取3-8l作2.0琼脂糖凝胶电泳，定性 检测目的基因的扩增水平。 34 四、PCR反应特点： 特异性强：遵循碱基配对原则，忠实的复制模板链； 灵敏度高：指数方式增加的，能将pg (10-12 ) 量级的起始待测 模板扩增到ug (10-6)水平，可从 100 万个细胞中检出一个靶细 胞； 简便、快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将 反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸 反应，一般在2-4h完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不 一定要用同位素，无放射性污染、易推广； 对标本的纯度要求低：不需分离病毒或细菌及培养细胞， DNA 粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板； 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、 活组织等粗制的DNA扩增检测。 35 五、PCR技术的局限性 为了构建特定引物，使特定DNA序列的选择性扩 增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。 聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素 需要优化反应条件。 PCR技术扩增产物的长度有限。 36 六、PCR技术的注意事项 防止污染，建立良好的质量控制。操作时避免气溶 胶产生，特别注意阳性样品的拿放，使用一次性耗 材，穿戴手套并经常更换，永远在最后一步才加核 酸，液体分装使用等。 引物设计合理。 Taq酶扩增错误率较高，大约1/100对碱基/20个循 环。 镁离子浓度对反应效率的影响。 仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等。 37 38 39 电泳技术 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相 反的电极移动，称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同 而达到分离的技术称为电泳技术。1809年 俄国物理学家Pece首先发现了电泳现象， 但直到1937 年瑞典学者 A.W.K.蒂塞利乌斯 设计制造了移动界面电泳仪 ，分离了马血 清白蛋白的3种球蛋白，创建了电泳技术。 40 本世纪60