超临界流体色谱法.ppt

超临界流体色谱法 超临界流体色谱(supercrical fluid chromatography,SFC)是以超临界流体作为流动相的色谱 方法，是20世纪80年代以来发展迅速的一个色谱分支， 所谓超临界流体，是指在高于临界压力和临界温度时 的一种物质状态。它既不是气体，也不是液体，但它兼 有气体的低粘度、液体的高密度以及介于气、液之间较 高的扩散系数等特性。从理论上说SGC既可以分析GC 法难以处理的高沸点、不挥发性样品，又有比HPLC法 更高的柱效和更短的分离时间，且可使用二者常用的检 测器，也可与MS、FT-IR光谱仪等在线联接，因而可 以方便地进行定性、定量分析。在中药药物分析领域已 有愈来愈多的应用。 一、一、超临界流体色谱的特点与原理超临界流体色谱的特点与原理 principle and character of supercritical fluid principle and character of supercritical fluid chromatographychromatography 1超临界流体的特性。 对于某些纯物质来说，具有三相点 和临界点，如图所示，从图中可以 看出，物质在三相点，气、液、固 三态处于平衡状态，当处于临界温 度和临界压力以上时，则不论施加 多大压力，气体也不会液化，此时 即非气体，也非液体，而是以超临 界流体形式存在。 超临界流体对于分离具有极其有用的物理性质，这些性 质恰好介于气体和液体之间。表对气体、液体、和超临界 流体的有关物理性质进行了比较。 表 气体、液体、超临界流体物理性质的比较 流动相 密度（g/ml） 扩散系数（ cm2/s） 粘度（ g/cm.s） 气体 超临界流 体 液体 约10-3 0.2-0.9 0.8-1.0 1-10-2 10-3-10-4 10-5 10-4 10-4-10-3 10-2 2.原理 SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛 细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC 和毛细管柱SFC； 分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同 而被分离； 通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组 分保留值； 压力效应： SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有影响 （柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）； 超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点， 影响小，超过临界压力20%，柱压降对分离的影响小； 压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响， 超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率， 淋洗时间缩短。 CO2流动相，当压力改变：7.09.0106 Pa，则： C16H34的保留时间 25min 5min。 程 序 升 压 HPLC与SFC 比较 与GC法和HPLC法比较,因超临界流体的粘度接近于气相 色谱的流动相,对溶质的传质阻力小，可以使用更高的流速 洗脱，因此SFC的分离速度快于HPLC而与GC相当；超临 界流体的扩散率介于GC和LC之间，因而峰展宽小于在气体 中。 SFC中的流动相不是惰性的传输介质，这不同于GC而与 LC一样，溶质与流动相间有相互作用，利用此点可调控选 择因子 当考虑溶质分压时，也可利用SFC的两重性，即被测物 质在超临界流体中的溶解性非常接近其挥发性，而发生温 度却较低，因此，在一定压力下，超临界流体溶解的分子 的分压比在气体中高几个数量级，这就可以实现对大分子 、热不稳定性化合物、 高聚物等的有效分离。 二、超临界流体色谱仪的结构与流程 instrument structure and the general process of SFC 1.结构流程 2.主要部件 （1）SFC的高压泵 无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器， 计算机控制流动相的密度和流量； （2）SFC的色谱柱和固定相 可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱； SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或 毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱SFC； v色谱柱 v填充柱 v填充柱与HPLC柱相似，基于分配平衡实现分离，柱长可达 25cm，分离柱内径0.5-4.6mm。使用粒径为3-10m的填料 填充。如硅胶、-NH2、-CN及C18、C8等化学键合相均可用 于SFC。其中以极性填料的分离效果更好。SFC在手性化合 物的分离上效果优于HPLC。 v在实际操作中，往往会因压力变化而产生较大的柱压降，使 柱入、出口处的保留时间有很大差异，所以一般采用高于超 临界压力20%左右的压力以减小影响。在填料的选择上也要 注意与所分析的样品相适应，如分析极性或碱性化合物时， 填料覆盖度小，会产生不对称峰。若使用“封端”填料则会得 到改善。 v填充柱在重现性、载样量等方面要优于毛细管柱， 操作简便，也有用微填充柱的，将3-10m的填料填 充到内径几个毫米或更小的毛细管柱中。 v毛细管柱 v较长用的填充毛细管柱内径0.5mm，柱长为10- 30mm；开管毛细管柱主要是内径为50-100m化学 交连的各种硅氧烷柱或其它类型的交连柱。 vSFC色谱柱必须借助柱箱以实现精确的温度控制， 范围可以从室温至450C，同时配低温控制系统， 可在-50以下工作。 主要部件 （3）流动相 SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3 CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机 物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲 醇等改性； （4）检测器 可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的FID检测器 v使用气相色谱检测器，以FID为多用，应用 时可将色谱柱的流出物分流，部分流出物通 过限流器变为气态进入检测器，若用FID检测 时，流动相中不能加入改进剂，否则改进剂 本身将给出信号干扰测定，FID对小分子量化 合物可得到很好的结果，对分子量大的化合 物常得不到单峰，而是一簇峰。如把检测器 加热可使分子量大于2000的化合物获得满意 的分离。 v在SFC中也可以使用氮磷检测器（NPD）、 火焰光度检测器（FPD）等。 使用液相色谱检测器。在进入检测器之前 应将超临界状态转为液态，可增加检测的灵 敏度，使谱带变窄，而且可以在室温下操作 ，UVD是用改性剂流动相的填充柱SFC的最 常用的检测方法。要求检测器必须耐高压。 如使用毛细管柱，UVD的流通池可由一段熔 融石英毛细管构成，内容积在200nl左右，这 样不会影响柱效；荧光检测器（FD）也可以 如此应用。对于填充柱，蒸发光散射检测器 也是一种常用的通用检测器。 v三、超临界流体色谱的流动相和改性剂 v（一）流动相 vSFC的流动相为超临界流体。超临界流体的主要特点是在不 同压力下对各种样品有不同的溶解能力。其溶解度随超临界 流体密度的增加而增加。当两组分的溶解度常数越接近时， ，其互溶性就越好。有人研究认为，几种常用的超临界流体 的溶解能力在相同的压力条件下顺序是乙烷二氧化碳氧化 亚氮三氟甲烷，在相同条件下其分离能力是：二氧化碳 氧化亚氮三氟甲烷乙烷。 v对于SFC流动相的选择应综合考虑。除溶解性能外，还要与 检测器相适应，CO2是最常用的流动相。其临界温度低、压 力适中，容易操作，相对便宜，无毒无嗅，安全性好，且在 190nm以上无紫外吸收。 （二）改性剂。 在SFC中，弱极性或非极性超临界流体流动相如CO2，对于一些极性化 合物的溶解能力较差。为了加强其对极性溶质的溶解和洗脱能力，常常向其 中加入一定比例的极性溶剂称为改性剂，加入的量一般为1%-5%，以甲醇 最常用，其次是其他脂肪醇，表中列出了部分适于二氧化碳的改性剂及应用 特性。 表 常用CO2改性剂 CO2改性剂 检测方法CO2改性剂检测方法 甲醇 UVD MS FIDC（用量应少 于1%） 脂肪 二甲基亚砜 乙 二氧甲烷 UV UV UV MS UV MS 脂肪醇UV MS甲醇UV MS FID 四氢呋喃UV MS 二氧化碳UV MS FID 2- 基乙醇UV 水UV MS FID在分离酸性或碱性化合物时，也可以向CO2流动相中加入酸或碱，使其峰形变锐。 四、应用与示例 超临界流体色谱法已被广泛应用于天然物，药物，表面活性剂，高 聚物，农药，炸药，火箭推进剂等物质的分离与分析. 1.超临界流体色谱法测定怀牛膝制剂中齐墩果酸的含量 牛膝制剂中含有的齐墩果酸不易挥发，且含有羟基、羟基等相性 基团，用GC法测定须衍生化处理后，才能测定，又因其结构中无发 色团，本自无紫外吸收，也不易被激发产生荧光，若用HJPLC测定 无法用常规检测器检测，而用SFC可直接进样测定，由于SFC对GC 及HPLC的检测器可兼容使用，分辨率也好于HPLC。 色谱条件 色谱柱：石英毛细管交联柱（10m50Mm，ID），固 定相：SB-Cyanopropyl-50；液膜厚度：0.25Mm；流动相：CO2（ 99.995%）；柱温：90；检测点：FID，325；压力程序： 15.20MPa，保持7min后以0.81MPa/min升至20.26MPa,再以 1.22MPa/min升至35.45MPa,分流进样2Ml，分流比100:15，补充气 ：氮气，纸建.0.5cm/min，衰减8。 v标准溶液的配制，取齐墩果酸对照品适量，加二氯甲烷溶解 ，并稀释成浓度为1.921mg/ml的标准溶液。 v标准曲线的绘制 精密量取齐墩果酸标准液（1.921mg/ml） 0.4，0.8，1.2，1.6，2.0及2.6ml，分别置平底烧瓶中，挥 去二氯甲烷后，各加2mol/L盐酸20ml 后按样品分析方法操 作，以齐墩果酸与内标的峰面积比对进样浓度进行回归，其 回归方程主：Y=1.701810-3+0.3392X、=0.9998。 v样品测定 精密称取天麻丸（胶囊内药粉）约1g，每加 2mol/L，HCL20ml,超声振荡15分钟，加热回流水解2小时， 冷却后滤过，弃去滤液，滤液用蒸馏水洗至中性，烘干，加 氯仿20ml振摇后水浴回流1小时，趁热滤过，用少量氯仿（ 23ml）冲洗滤纸，回收并挥干氯仿，备用。测定前精密加 入1ml二氯甲烷及1ml甲羟孕酮内标准溶液，溶解后进样测定 ，计算齐墩果酸与内标的峰面积比，