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实验室生物安全、细菌接种技术 和革兰染色 新乡医学院微生物学教研室 办公电话：3029130 监督电话：3029945 EMail： 实验一（5个学时） 1.课件首页留任课教师的联系方式以及科教科联系电话（3029945） 2.本次实验目的 （1）通过介绍实验室生物安全方面的相关知识，在医学实践中树立 “有菌的意识，无菌操作的观念” 以保证工作的安全顺利。 （2） 掌握细菌接种的无菌操作技术 （3）掌握革兰染色实验方法并进行细菌基本形态和特殊结构的观察。 3.实验内容（3个） （1）实验室生物安全 (0.5学时) 熟悉 （1）微生物学实验室生物安全意义 （2）实验室规则 v例一：1956年，前苏联的一个实验室曾有9支装有感染了委内瑞拉马脑炎病毒 的鼠脑的安瓿被打破。由于没采取必要的措施，结果在几天内造成24名工作 人员感染。 v例二：1998年，我国某大城市的某高校在使用大白鼠进行试验时，有两名学 生被大白鼠咬伤，还有一些学生在给实验老鼠放血、解剖的过程中，未按照 要求戴手套操作，结果在29名实验人员中，有 9人感染了流行性出血热 v可用实验室感染事件的发生引入，说明关注实验室生物安全的重要性，以微生物学实验 室相关规则为主，相关注意事项一定要交代清楚。 医学微生物学实验室规则 v学生进微生物实验室必须穿好工作服，离室需脱下反折， 要经常清洗消毒。 v进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指 定的储物柜内。 v严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。 v手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡手 ；避免有菌材料溅出；破损器材及时处理并报告。 v实验过程中避免一切不良的个人习惯；操作中产生的废料 要扔在指定容器内；实验完毕清理台面，值日生严格认真 打扫卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。 实验室意外紧急处理办法 v1 皮肤破损：去除异物，生理盐水或蒸馏水洗净后2% 碘酊或2%红汞 涂抹。 v2 烧伤：局部涂凡士林，2%鞣酸或2%苦味酸。 v3 化学药品腐蚀伤：若强酸则先用大量清水冲洗，再用碳酸氢钠溶液 洗涤中和；若强碱则先用大量清水冲洗，再用2%硼酸洗涤中和（若伤 处为眼部加用橄榄油或者液体石蜡12滴滴眼）。 v4 菌液入口：立即吐入消毒容器内，1：1000高锰酸钾或3%双氧水漱口 ，根据菌种服用抗菌药物。 v5 菌液污染台面：2%3%来苏尔或0.1%新洁尔灭覆盖30分钟后抹去， 皮肤手指沾染活菌应用上述液体浸泡3分后肥皂和清水洗净。 v6 火警：勿慌，立即关闭电闸和煤气闸。若酒精乙醇乙醚等有机溶剂 起火切不可用水扑救，可用沙土等物扑灭。 （2）无菌操作技术（1.5学时） 实验目的 1 掌握常用的细菌接种方法 2 熟悉细菌生长现象的观察方法 一、培养基 概念:是人工配制的专供微生物生长繁殖的混合 营养物制品。 成分：充足的营养物质（水分、碳源、氮源、无机盐）；合适的PH； 适宜的温度；适宜的气体环境。 用途：用于微生物的繁殖及分离接种，传代或保存，鉴别微生物的类 属，研究微生物的生理及生化特性，制造菌苗、疫苗或其他微 生物制剂等。 二、分类 主要用于增菌 用于检测动力及保存菌种 用于分离鉴定细菌 双糖铁培养基 S-S培养基 普通琼脂培养基 血液琼脂培养基 庖肉培养基 三、细菌的接种技术 v介绍接种环及其无菌操作使用方法 v普通琼脂培养基接种法 1.平板分区划线接种法：分离培养细菌，通过此法可以 获得纯培养为进一步鉴定细菌提供条件。 2.斜面接种法：用于纯菌的移种，可短时间保存菌种。 分区划线 v划线时接种环与平皿约成30-40度角,轻 轻接触,以腕力在琼脂表面轻快滑动,不 能划破琼脂. v第一次划线应占平皿面积的1/10,以后 每次划线约占面积的1/41/5. v划线为连续划线,不能间断.应占满平皿. 划线不能交叉重复. v每次划完后应灭菌. 3.半固体穿刺接种法：保存菌种或观察细菌的动力和生化反应 4.液体接种法：用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体培养基 的接种 四、生长现象的观察 v固体培养基-菌落 一个细菌不断分裂而成的细菌群体称之。观察菌落的形态、 大小、表面、边缘、湿度、透明度；在血平板上还要观察溶血情 况和色素等。 半固体培养基-鞭毛 观察细菌的运动 液体培养基-生长 混浊生长（大多数细菌） 沉淀生长（链球菌） 膜样生长（专性需氧菌， 如结核分枝杆菌、枯草杆 菌） （3）细菌的形态学检查（3学时） 形态学检查分类 一、不染色标本检查(活体）(简单介绍) 悬滴法 压滴法 二、染色标本检查 单染法：简单染色，一种染料 （美兰染色） 复染法：复杂染色，两种以上染料（革兰染色、抗酸染色 ） A.革兰染色(Gram stain)（每个学生一张玻片） 实验目的 1、掌握细菌涂片标本的制备及革兰染色的方法 2、熟悉革兰染色的原理和临床意义 v1884年由丹麦医师Gram创立 v革兰染色是最常用的一种染色方法，可以将细菌 初步分为革兰染色阳性菌和革兰染色阴性菌，在 临床上具有非常重要的意义 实验原理 （重点讲解通透性学说） 器材和试剂 1、菌种 白色葡萄球菌 大肠杆菌 2、试剂 革兰染色液 初染液 结晶紫 媒染液 卢戈氏碘液 脱色液 95%乙醇 复染液 稀释石碳酸复红 3、其它 接种环 载玻片 染色盘 洗液瓶 酒精灯等 冲洗 染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果 若学生没用过油镜观察标本，请示教油镜的使用方法。 方法与步骤 1、细菌涂片的制备 涂片 干燥 固定 2、染色 初染（结晶紫） 媒染（卢戈氏碘液） 脱色 （95%乙醇） 复染（稀释石碳酸复红） 吸水纸 吸干 1min1min 30s 30s 冲洗冲洗 冲洗 结果（图片展示） 意义 注意事项（提醒学生将实验后的玻片放入 指定的消毒缸中） 注：油镜的使用方法 寻找视野：在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后 将需进一步放大的部分移到视野的中心。 增大光照强度：将聚光器上升到最高位置，光圈开到最大。 转高倍镜头、滴加镜油、换油镜头：转动转换器，使高倍镜头 离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢 慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距 离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。 物 镜工作距离(mm) 低倍目镜105.40 高倍目镜400.39 油镜头1000.11 调试观察：观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为 止。如果不出现物象或者目标不理想要重新寻找，在加 油区之外重找时应按：低倍高倍油镜程序。在加油区 内重找应按：低倍油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾 污镜头。 清洗镜头：油镜使用完毕，先用擦镜纸擦去镜头上和标本 上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯（或乙醚）擦去残 余的香柏油，最后再用干擦镜纸擦干净。 透镜 折光率 油 1.515 1.0 空气 玻 1.52 璃 空 气 油镜原理示意图 细菌的特殊结构（示教） （二毛荚一胞） 实验报告 一、目的 二、原理（主要通透性） 三、材料 四、方法 五、结果（2+3幅图） 六、意义 七、注意事项 作业重点 1、绘制所涂片染色的G+及G-菌的形态图并注明放大 倍数（红蓝铅笔） 2、绘制示教片中各细菌特殊结构形态图并注明放大 倍数（铅笔） v预习下周实验内容： v消毒灭菌，内毒素检测，肠道致病菌分离培养 Mub%Ks9!Jq8ZHo6YFn4WDl3UCj1TAi+Ryg-Pxe(Nvd&Mtb$Ks9!Iq7ZHo6XFn4WDl2UCj1SAh+Ryg)Pwe(Nvc&Ltb$Kr9#Iq7ZGo6XFm4VDl2UBj0SAh+Qyf)Pwe*Nuc&Lta$Kr9#Ip7ZGo5XEm4VDk2TBj0Szh-Qyf)Owe*Nuc%Lta$Jr8#Ip7YGn5XEm3VCk2TBi0Rzh-Qxf)Owd*Muc%Lsa!Jr8#Hp6YGn5WEl3VCk1TBi0Rzg-Qxf(Ovd*Mub%Ksa!Jq8ZHp6YFn5WEl3UCk1TAi+Rzg- Pxe(Ovd&Mtb%Ks9!Jq8ZHo6YFn4WDl3UCj1SAi+Ryg)Pxe(Nvc&Mtb$Ks9!Iq7ZHo6XFm4WDl2UBj1SAh+Qyg)Pwe(Nvc&Ltb$Kr9#Iq7ZGo5XFm4VDk2UBj0SAh+Qyf)Pwe*Nuc&Lta$Jr9#Ip7YGo5XEm3VDk2TBj0Szh-Qyf)Owd*Nuc%Lsa$Jr8#Hp7YGn5XEm3VCk2TBi0Rzh-Qxf(Owd*Mub%Lsa!Jr8#Hp6YGn5WEl3VCk1TAi0Rzg-Pxf(Ovd&Mub%Ksa!Jq8ZHp6YFn4WEl3UCj1TAi+Ryg- 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