药物制剂的微生物学检查.ppt

药物制剂的 微生物学检查 无菌制剂的无菌检查 v 各种注射剂、手术用滴眼剂要求无菌、 无热原质，尤其是直接注入病人血管内的注 射剂，如被微生物或热原质污染即有可能引 起发热、菌血症、中毒性休克甚至死亡等等 。因此药典规定出厂前都必须做无菌检查以 确保安全。 v无菌检查的基本原则： v 在无菌操作情况下将被检测的药品，按 其剂型的不同分别取一定量加入适合各类微 生物生长的不同培养基（需氧菌、厌氧菌及 真菌培养基）中，在各自适宜的条件下进行 培养。在规定时间内观察有无微生物生长， 以判断药品是否符合要求确为无菌。 v一般注射剂 系指本身不含任何抗菌或抑菌成分，而且 其为水溶性的药品的无菌检查 v特殊注射剂 油剂性药物 含抑菌或防腐成分药物 一般注射剂的无菌检查 v直接接种法 v需氧菌和厌氧菌的培养已全部采用硫乙醇酸 钠培养基检查。在同一培养基中，需氧菌在 培养基表面生长，而厌氧菌在培养基内生长 。 v真菌检查用真菌培养基 硫乙醇酸钠培养基 v硫乙醇酸钠 还原剂 v亚甲蓝 氧化还原指示剂 下层 厌氧 无色 上层 需氧 蓝绿色 v阳性对照： 需氧菌：藤黄八叠球菌 厌氧菌：产芽胞杆菌 真菌： 白色念珠菌 v方法：在培养基中加入对照菌。 v意义：阳性对照必须长菌，证明微生物确实 可在应用的实验条件下生长。 v阴性对照： 用未加药物和对照菌的培养基 意义：证明培养基本身无菌。 v 测试时用无菌操作法吸取一定量的药物加 入各种培养基内在适宜的温度下培养，并每 天观察作出记录。如在规定时间内无任何微 生物生长则可判定待检药品符合标准. v需氧菌、厌氧菌：37 天 v 真菌： 25 天 特殊注射剂的无菌检查 v、油剂性药物的检测 v 油剂性药物因难于和培养基充分混合，往往影 响检出结果。如果加入吐温80，与油剂性药物混 合乳化，再用培养基稀释，可以使药品均匀分布在 培养基中。 v 对照：吐温80 。 v、含抑菌或防腐成分药物的检测 v 有些药品本身含有抑菌成分，或于制作 过程中加入防腐剂等，如按上法检测往往不 能证明它们是否真正无菌 ，必须先经一定的 处理。 v灭活法、稀释法、微孔滤膜过滤法和离心沉 淀集菌法 薄膜滤菌器 口服药及外用药物 的微生物学检查 v口服药：细菌总数、霉菌总数、大肠杆菌、活螨的 检测。 v 外用药：绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和破伤风杆菌 。 v一般眼科制剂：细菌总数、霉菌总数、绿脓杆菌、 金黄色葡萄球菌。 v均不能检出致病菌。 细菌总数测定 v 细菌总数，指每克或每毫升待检药品内含 有的活菌总数。 v 它能判明待检药品被细菌污染的程度，生 产单位的原料、设备及工艺流程的卫生状况 。 v方法：普通琼脂培养基倾注平皿计数法。 37，72小时 v 将一定稀释度的药物和琼脂培养基混合后，培 养一定时间，计数平板内的菌落，根据数得菌落均 值和相应稀释度的乘积，得到每克或每毫升待检药 品中所含细菌总数，判断药品是否符合标准。 v 一般选取菌落数在30-300之间的平板计数。 霉菌总数测定 v 霉菌总数测定是了解待检药品每克 或每毫升内含有的活霉菌总数，借以判 明药品的真菌污染程度。 v琼脂倾注平皿计数法 v虎红培养基 v25，72小时 v选取菌落数在5-50个的平板，根据数得菌落均值和 相应稀释度的乘积，得到每克或每毫升待检药品中 所含细菌总数，判断药品是否符合标准。 病原菌检验 v大肠杆菌 v沙门菌 v绿脓杆菌 v金黄色葡萄球菌 v破伤风杆菌 大 肠 杆 菌 v 大肠杆菌是人、畜肠道主要寄生菌。它随粪便 排出体外，故常作为食品、饮水等被粪便直接或间 接污染的指示菌。 v 如药品中检出大肠杆菌，表明该药品已被粪便 污染，可能有肠道致病菌和寄生虫卵等病原体存在 ，服用后有被感染的危险性。因而，不能用灭菌方 法处理的口服药物，大肠杆菌检测是常规项目之一 。 v 检测时先把一定量药均经增菌后转种到选择 鉴别培养基麦康凯平板或伊红美兰平板 （EMB平板）。 v培养后挑取可疑菌落作革兰染色及生化反应 。生化反应包括 IMViC试验和乳糖发酵试验 。大肠杆菌IMViC试验结果为+、+、 v 大肠杆菌的鉴定主要靠形态和生化反应两方面 的特征。 v 但由于大肠杆菌和产气杆菌在形态和生化反应 方面有相似之处，而产气杆菌一般多存在于水中， 无卫生学意义。因而检测大肠杆菌要与产气杆菌相 鉴别。二者的鉴别一般采用IMViC试验（I吲哚 试验，M甲基红试验，ViVP试验，C 椽枸酸盐利用试验）来鉴定。 v 如检测结果为革兰阴性杆菌，乳糖发酵阳 性及IMViC试验符合，则可判断每克或每毫 升药品检出大肠杆菌。 沙 门 菌 v 寄生于人和动物的肠道内，能引起伤寒、 副伤寒、急性胃肠炎（食物中毒）和败血症 。 1、革兰阴性，杆菌 2、分离培养： vEMB平板上菌落无色或粉红色。 3、生化反应： 4、血清学反应： v凝集反应： v抗原可疑菌， v抗体沙门菌A-F组的多价血清（抗O抗体 ） vO抗原： v细菌细胞壁脂多糖中的特异性多糖，100不被破 坏。至少有58种，可将沙门菌分为多个组。引起人 类疾病的为A-E组。 vH抗原： v鞭毛抗原，不耐热，60 ，30分钟被破坏。 绿 脓 杆 菌 v 绿脓杆菌为条件致病菌，对烧伤、眼科疾 病等病人可因感染后病情加重，造成患者创 伤处组织化脓，严重的可引起败血症、眼角 膜溃疡甚至失明。 v 将被检药品经增菌后转种明胶十六烷三甲 基溴化胺琼脂平板上，经培养后根据菌落特 征、蓝绿色色素、革兰阴性杆菌，氧化酶试 验和绿脓菌素试验均阳性，可得出结论。 v氧化酶试验 细菌的氧化酶能将二甲基对苯二胺脱氨而 成带有红色的醌类化合物。 v绿脓菌素试验 绿脓菌素溶于氯仿内，加入盐酸变成粉红色 金黄色葡萄球菌 v 金黄色葡萄球菌是最常见的化脓性球菌之一，80%以上 的化脓性疾病由本菌引起。 v 它广泛分布于自然界中，常可污染药品及食品，也经常 存在于人的皮肤及某些腔道中。在制药过程中可被混入药品 内，在条件合适时引起疾病。因而目前规定，凡外用药和眼 科制剂不得检出金黄色葡萄球菌。 v 药物在检测时先经亚碲酸钠肉汤增菌， 然后转种选择培养基（如甘露醇高盐琼脂、 卵黄高盐琼脂等）经培养后挑取可疑菌落作 革兰染色及生化反应。根据选择培养基上典 型菌落、革兰阳性菌、发酵甘露醇及血浆凝 固酶阳性。可得出结论，检测到金葡菌。 破伤风杆菌 v 破伤风杆菌广泛存在于土壤及人和牲畜 的粪便中。以根，茎、叶类植物为原料的中 草药制剂特别易受破伤风杆菌污染，在条件 合适时感染伤口引起病变。 v 因此用于深部组织、创面和溃疡面的外 用制剂不得检出破伤风杆菌。 v检测时首先把待检药品加入到0.1葡萄糖庖 肉培养基中进行增菌产毒培养。 v根据培养基所表现出的破伤风杆菌生长特有 的现象（产气、有恶臭味、消化庖肉），再 经革兰染色及动物毒力试验和保护力试验证 实。如找到革兰阳性破伤风杆菌的典型形态 ，毒力试验和保护力试验阳性，可确证存在 破伤风杆菌。 v毒力试验和保护力试验 取破伤风杆菌液体培养物于小鼠后肢肌肉 注射，动物发病时，腿及尾巴强直，肢体痉 挛，最后死亡。 在对照组动物中，先注射破伤风抗毒素， 再注射液体培养物，则该动物得到特异性保 护。 v上述致病菌检测时，皆需同时作相应细菌的阳性对照试验， 即与药品检测同步用阳性对照菌作对照试验。 v目的是检测待检药品本身有无干扰因素（如抑菌或防腐成分 ）；以及所用常规检测方法的灵敏度。 v方法是将所要检测菌的相应阳性对照菌株，稀释成每毫升含 活菌1000个的菌液，将其0.lml吸到待检药品的相应培养液中 ，在同等条件下进行检测。如果阳性对照菌生长良好，说明 检测结果有效。 活螨的检验 v 螨本身带有各种病原菌，除了直接危害 人