疫学实验一抗二抗的选择与搭配原则和方法.ppt

一抗、二抗的选择 一抗的选择 1.分析实验应用类型 WB（Western Blot 免疫印迹 ） IHC （immunohistochemistry免疫组织化学） ELISA（enzyme-linked immunoadsordent assay 酶联免疫吸附试验 ） 2.样本蛋白的结构性质 样本蛋白的结构域 全长蛋白、蛋白片段、多肽、 细菌、细胞 样本的提取和处理过程 u 某些抗体要求样本经过某些特殊处理 ，例如：许多抗体只识别还原和变性 的、表位已暴露不受二级四级结构阻 碍的蛋白样本， u 某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白 。当选择免疫组化的抗体时，应注意 某些抗体只识别未固定的冷冻的组织 ， u 另一些抗体则适用于无需抗原修复解 交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织 ， 蛋白片断或一种 特殊的同型物或 蛋白全长的某一 区域 用含此片段域 的免疫原制备 出的抗体。 用FACS流式检 测活细胞的表面 蛋白 用含该表面蛋 白的胞外域来 免疫制备的抗 体。 3.样本的物种 选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与 不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸 序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说 明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体 不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种 尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方 法来预测交叉反应，可应用Expasy 和 NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。 4.一抗宿主物种的选择 一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗 宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可 能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本 内源性免疫球蛋白产生交叉反应， 例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一 抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子 （酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。 如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化 外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗 体宿主物种的影响不大，如对不含IgG的细胞裂解物样本 的western blotting检测，尽管如此，含有血清的组织裂解 物和组织培养上清中含有免疫球蛋白，还原变性样本中含 IgG，在western blot检测中则结合出现IgG分子 50 and 25 kDa的重链和轻链条带。 二抗的选择 1.一抗的种属来源 二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源 ， 2.二抗的种属来源 u 一般来说，不同的种属来源与二抗的质量 没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来 源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的 差别。 u在一些特殊的实验里，如双标实验里，如 果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小 鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和 抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择 山羊或者小鼠来源的。 3二抗的偶联标记 主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍 生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC、Rhodamine、 Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等）、生物素、 金颗粒。 选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。 u对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗； u细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流 式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗， u免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的 二抗。 u如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用 Biotin/Avidin检测系统。 u在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记； u金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。 4.是否经过血清吸附过的二抗 为减少二抗与样本的非特异性结合，可选择经过 血清吸附过的二抗 如检测样本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克 隆抗体，二抗就需要选择抗小鼠源的二抗，如果 对实验的特异性要求很高，选择经过人血清吸附 过的抗小鼠源的二抗，这种二抗由于经过人血清 吸附而排除了与人源组织（如IgG等）可能发生非 特异性反应的IgG，因此将非特异性结合降低到最 低。 5.二抗的类别亚型 IgM是体液免疫应答首先产生的Ig。 IgA是机体黏膜防御感染的重要因素。 IgG是初级免疫应答中最持久、最重要的抗 体，它仅以单体形式存在。大多抗菌性、 抗毒性和抗病毒抗体属于IgG IgE是同速发型过敏反应发生有关的Ig。 IgD以膜结合形式存在于B细胞，在B细胞分 化发育中起重调节有作用 IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。 间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或 IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定 IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度 的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使 一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如 用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体， 必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理， 以除去IgG的干扰。 【Anti-IgG还是Anti-IgG, F（ab）2 fragment】 在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞 等细胞内，通常含有较多的Fc受体，这时候选择二抗时最好选择Anti- IgG, F（ab）2 fragment这样的特异性二抗，这样就消除了由于Fc部 分与IgG的非特异性结合。 常规的Anti-IgG （H+L）二抗与IgG的重链和轻链都有结合反应，即 与IgG的Fc的F（ab）2片段都能结合； 由于IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此Anti-IgG （H+L） 与它们都有交叉反应。而Anti-IgG, F（ab）2 fragment经过了IgG Fc 片段的吸附，因此只与IgG的F（ab）2片段结合。 针对某一种属的抗体可能会和其他一些种属有交叉 反应。牛血清白蛋白和奶粉可能含有与抗牛IgG、抗 山羊IgG、抗马IgG、抗绵羊IgG等抗体反应的IgG