树脂吸附法脱除一种中药搽剂中带色杂质的研究.doc

目 录摘 要.1Abstract. 21前言31.1 课题的研究背景及意义31.2 大孔树脂脱色研究现状及原理41.3 中药搽剂中有效成分的性质61.4 本论文的研究内容与目的62 实验部分72.1 实验仪器及药品72.2 实验方法与过程82.2.1 中药搽剂制备82.2.2 大孔树脂预处理82.2.3 静态吸附筛选树脂82.2.4 温度对大孔树脂脱色效果的影响92.2.5 树脂用量对大孔树脂脱色效果的影响92.2.6 解吸剂的选择及静态解吸92.2.7 动态吸附102.2.8 动态解吸102.2.9 再生树脂的静态吸附性能102.3 分析与测定方法112.3.1吸光度的测定112.3.2脱色率和保留率的计算112.3.3盐酸小檗碱含量测定112.3.4苦参碱含量测定113 实验结果与讨论133.1 静态吸附筛选树脂结果133.1.1脱色率133.1.2盐酸小檗碱保留率143.1.3苦参碱保留率153.2 静态吸附曲线163.3 温度对静态吸附的影响173.4 树脂用量对静态吸附的影响183.4.1树脂用量对脱色率的影响183.4.2树脂用量对盐酸小檗碱保留率的影响193.4.3树脂用量对苦参碱保留率的影响203.5 解吸剂的选择213.5.1不同解吸剂的影响213.5.2 水-乙醇体系解吸223.6 静态解吸曲线263.6.1 60%乙醇静态解吸曲线263.6.2 5%氢氧化钠溶液解吸283.7 动态吸附曲线293.7.1 流速对动态吸附的影响293.7.2 树脂装柱高度对动态吸附的影响323.8 动态解吸曲线343.9 再生树脂的静态吸附曲线363.9.1 再生树脂的静态吸附曲线363.9.2 新树脂与再生树脂吸附性能比较384 结论415 致谢42参考文献43目 录树脂吸附法脱除一种中药搽剂中带色杂质的研究摘要：本文系统地研究了大孔树脂法脱除一种中药搽剂中的带色杂质。以脱色率和盐酸小檗碱及苦参碱保留率为考察指标，采用静态吸附实验对AB-8、D001、D101、D301、D280、X-5、NKA-9七种大孔树脂进行考察，并通过静态吸附和动态吸附的单因素影响实验，对筛选树脂或树脂组合的最佳脱色和解吸工艺条件进行考察。结果表明：由大孔树脂D001先对中药水煎液进行脱色后与中药醇提液混合再用大孔树脂D280进行脱色效果最佳。静态脱色最佳条件为：D001脱色时间60min，温度30，中药水煎液与树脂用量比为7.5ml：1.0g；D280脱色时间360min，温度30，药脂（树脂）比50ml：3.0g。静态解吸最佳条件为：采用5%NaOH水溶液为解吸溶剂最佳，对D001解吸10min、D280解吸40min解吸液达饱和。动态脱色最佳条件为：D001树脂装柱5cm处理25ml水煎液，流速3.0BVh-1；D280树脂装柱7cm处理60ml中药，流速3.0BVh-1。动态解吸最佳条件为：5%NaOH水溶液为解吸溶剂，D001树脂装柱量与解吸溶剂比5cm：20ml；D280树脂装柱量与解吸溶剂比5cm：40ml。关键词：大孔树脂，中药搽剂，脱色，解吸再生Decoloring a Chinese traditional medicine cha agent with the macroporous resinAbstract: This paper systematically studies decoloring a Chinese traditional medicine cha agent with the macroporous resin. AB-8, D001, D101, D301, D280, X-5 and NKA-9 seven kinds of macroporous resin was selected by studying the decoloration rate and the recovery rate of Berberine Hydrochloride and Matrine. Throgh the static and dynamic separateness factor experiments，the optimum conditions of decoloration of the Chinese medicine cha agent and resin regeneration were obtained.The results showed that decoloring the water extraction fluid of the Chinese traditional medicine cha agent with macroporous resin D001 which mixed with ethanol-extraction liquid, then decolorized with macroporous resin D280 had the best effect. The optimum process of static decoloration was as follows: rationem of the water extraction fluid and macroporous resin D001 as 7.5ml:1.0g,adsorption at 30 for 60min; rationem of the phamacon and macroporous resin D280 as 50ml:3.0g, adsorption at 30 for 360min .The highest static desorption ratio could be gotten by using 5%NaOH aqueous as eluting solvent ,desorption time of D001 was10 min, of D280 was 40 min. The best conditions of dynamic decoloration were: every 5cm macroporous resin D001 decolorized 25ml water extraction fluid at the flow rate of 3.0 BVh-1; every 7cm macroporous resin D280 decolorized 60ml the cha agent at the velocity of 3.0 BVh-1.The optimum conditions of dynamic desorption were:each D001 resin and D280 resin 5cm which desorbed by 20ml and 40ml 5%NaOH aqueou respectively. Keywords：Macroporous resin，Chinese medicine cha agent ，Decoloration，Desorption regeneration1 前言1.1 课题的研究背景及意义中药的发明和应用，在我国有着悠久的历史，有着独特的理论体系和应用形式。中药材主要来源于天然药物及其加工品，包括植物药、动物药、矿物药及部分化学、生物制品类药物，以植物药居多。中药采集按不同部位分成全草、叶类、花粉、果皮、种子、根茎、树皮，由于药材外皮部分多带有颜色，常用煎煮法用水作溶剂，药材经加热煮沸浸提液中除有效成分外，还提取出淀粉、树胶、果胶、粘液质、色素等无效成分，浸渍法用乙醇浸提时一些色素不溶于乙醇，浸提液一般着色较浅，大部分颜色对药性没有影响，少量如二色补血草多糖颜色较深，影响多糖的外观以及后续的结构研究。外搽剂则因为涂搽在皮肤表面，特别是治疗面部痤疮、湿疹等药剂，严重影响美观，必须经过脱色处理。某药厂生产的中药搽剂，以十四味中药材复方制备成汤剂，以几种生物碱为主要有效成份，面世后消费者反映着色重、不美观、沾污衣物等，严重影响销售，为此厂方采用了加活性炭等方法脱色，有效成份流失，效果均不理想，厂方不得不停止该产品生产。该中药厂系有影响力的大型中药厂，其产品营销到全国各地，解决了脱色问题，这种药效显著、功能较多的搽剂不仅是该品种天然药的一种有效补充，而且增加地方经济收益。目前应用于中药脱色的方法及工艺很多【1】，但大致可通过以下方法进行分类。一种是根据色素在不同溶剂中的溶解度差别或在两相溶剂中的分配比不同进行除去；絮凝剂法除去色素；石灰乳沉淀法；双氧水氧化脱色；物理吸附和化学吸附法；膜分离去除色素方法；分子蒸馏技术；生物脱色技术等。药厂在制剂过程中通常采用根据色素在不同溶剂中的溶解度差别或在两相溶剂中的分配比不同进行除色、除杂，方法简单效果比较差。如水提醇沉工艺，因为水提液中淀粉、树胶、蛋白质、果胶、多糖、粘液质、色素不溶于乙醇，沉淀析出；乙醇上清液中含有鞣质、生物碱、醇溶性氨基酸、甙类等，常常是有效成份和其他杂质、带色成份混合，有效成份含量不高。石灰乳沉淀法，利用钙与有效成分及杂质结合成钙螯合物、钙盐沉淀，在硫酸作用下黄酮、蒽醌、酚类、皂苷、部分生物碱与钙离子形成的钙盐可以被分解出来，再溶解到水中。但是鞣质、部分蛋白质、有机酸、极性色素、多糖等不能分解出来。絮凝剂法除去色素，明胶与鞣质形成络合物，与水中悬浮颗粒一起沉淀，ZTC1+1天然脱色澄清型，起到去除不稳定成分和脱色助滤作用，甲壳素及壳聚糖是甲壳素乙酰化制得的，是天然的阳离子絮凝剂。双氧水脱色基于氧化机理，一般对多糖类如二色补血草多糖、夏枯草多糖、积雪草多糖、款冬花多糖、鱼腥草多糖等脱色效果明显，但易造成有些中药有效成份流失，而且双氧水脱色成本较高。现在使用较多的是根据色素与有效成分吸附性差别进行分离的方法。物理吸附采用硅胶、氧化铝极性吸附剂，可去除亲水性色素；活性炭、纸浆、滑石粉、硅藻土非极性吸附剂，可去除亲脂性色素。化学吸附采用碱性氧化铝去除一些黄酮、蒽醌等酚酸性色素；也可以用阴离子交换树脂除去。半化学吸附采用聚酰胺与大孔树脂吸附剂，聚酰胺可通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类的酚羟基形成氢键。也可以通过酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键；大孔树脂是以苯乙烯、丙烯酸酯、丙烯腈、异丁烯等做骨架结构，通过交联剂和致孔剂制成大孔网状结构的高分子吸附剂，根据需要可适用多种化合物。其中大孔树脂脱色有如下优点【2】：处理能力大，脱色容量高，选择性强，能除去各种不同的离子和色素，且可以反复再生使用，寿命长， 费用低。故本课题选择用大孔树脂法解决该中药搽剂的脱色问题。1.2 大孔树脂脱色研究现状及原理李洁等【3】研究表明大孔树脂是一种内部具有三维空间立体孔结构，孔径与比表面积都比较大的高分子聚合物，它不溶于酸、碱及乙醇、丙酮和烃类等有机溶剂，对氧、热和化学试剂稳定。主要包括大孔离子交换树脂、大孔吸附树脂和螯合树脂，本实验中主要用到前两者。一般认为，依靠物理界面力作用引起溶液中溶质浓度的减少称为吸附，因化学作用引起溶液中溶质变化的称为离子交换，起离子交换与吸附作用的树脂分别称为离子交换树脂和吸附树脂。大孔离子交换树脂是具有功能基团的高分子化合物，它具有一般聚合物所没有的新功能离子交换功能，本质上属于反应性聚合物。常见的有强酸性阳离子交换树脂D001，弱酸性阳离子交换树脂D101，强碱性阴离子交换树脂D280，弱碱性阴离子交换树脂D301。大孔离子交换树脂的分离原理：以弱酸性阳离子交换树脂为例【4】，弱酸性阳离子树脂中含有酸性反应基团，如羧基，能在水中离解出氢离子而呈酸性，树脂离解后的带负电基团，如R-COO-，能与溶液中的其他阳离子（如季铵型氮离子）吸附结合，从而产生阳离子交换作用的原理。大孔吸附树脂是一类分离型功能高分子材料，一般不带有离子交换基团，只存在少量的功能基，但其珠粒内部拥有与分离对象分子尺寸相匹配的吸附场所和扩散通道。由于功能基类型和孔结构存在差异，使它的吸附作用具有一定的选择性，又有很高的比表面积，使得它具有高的吸附值。因此大孔吸附树脂是集吸附作用和筛分作用为一体的分离型功能高分子材料。大孔吸附树脂的分离原理【5】：吸附树脂上有大小不同的孔道。而且这些孔道的最小直径要大于所要分离的物质的最小粒径，最大直径小于被分离物质的最大分子，否则起不到分离的效果。这样当直径大小不等的分子通过吸附树脂的时候，直径大的分子由于无法通过树脂孔径通道而从树脂外部通过，最先被分离出来。不同粒径的分子在树脂中通过的时间不同，从而起到分离的作用【6】【8】。关于大孔树脂的初步选择李崇明等【9】研究表明由于大孔吸附树脂的固有特性，它能富集、分离不同母核结构的药物，可用于单一或复方有效成分和有效部位的分离和纯化，而中药成分又极其复杂，尤其是中药复方其成分更复杂。因此必须根据所需分离有效成分的类别和性质，根据相似相溶原理，对所使用的大孔吸附树脂进行选择，具体有以下两个方面：1、不同极性和含不同官能团的树脂对各类化合物的吸附能力不同，因此需要根据不同的有效成分或有效部位纯化的要求，选择不同型号的树脂，脂溶性成分(包括甾体类、二萜、三萜、黄酮、木脂素、香豆素、生物碱)应选择非极性或弱极树脂，皂苷和生物碱苷成分，应选择弱极性或极性树脂，黄酮苷、蒽醌苷、木脂素苷、香豆素苷等应选择原料中加有甲基丙烯酸甲酯或丙烯腈的树脂等。2、 除了考察不同型号树脂骨架结构，极性，使用条件，树脂处理后有机残量，应用范围等因素。影响树脂吸附的因素：影响大孔吸附树脂吸附作用力强弱的因素有：树脂本身化学结构、溶剂的影响、被吸附化合物的结构、吸附温度等。被吸附的化合物在溶剂中的溶解度对吸附性能也有很大的影响。通常一种物质在某种溶剂中溶解度大，树脂对其吸附力就弱，反之，溶解度小，树脂对其吸附力则强。酸性物质在酸性溶液中进行吸附，碱性物质在碱性溶液中进行吸附较为适宜。被吸附化合物的分子量大小不同，要选择适当孔径的树脂以达到有效分离的目的。在同一种树脂中，树脂对分子量大的化合物吸附作用较大。化合物的极性增加时，树脂对其吸附力也随之增加。若树脂和化合物之间产生氢键作用，吸附作用也将增强。大孔吸附树脂吸附为一放热过程，故一般采用低温吸附，高温解吸的方式。但有些过程相反，温度越高，吸附率越高，吸附速度越快。因此试验研究中，必须重视温度的影响因素。1.3 中药搽剂中有效成分的性质盐酸小檗碱和苦参碱均是极性较大的物质，且均为碱性。小檗碱是一种异喹啉类生物碱，分子式C20H18NO4+存在于小檗科等4科10属的许多植物中小檗碱从乙醚中可析出黄色针状晶体，熔点145，溶于水，难溶于苯、乙醚和氯仿，小檗碱为一种季铵生物碱，其盐类在水中的溶解度都比较小，例如盐酸盐为1:500。盐酸小檗碱即为小檗碱的盐酸盐，为白色结晶粉末，分子式C20H18NO4+Cl-，为芳香族六元环吡啶类化合物。小檗碱本身即为一种有颜色（黄色）的生物碱【10】。苦参碱（吡啶类生物碱）是从豆科槐属植物苦豆子的成熟种子或花期地上部分提取分离得到的吡啶生物碱类化合物。化学式C15H24N2O。分子中均有2个氮原子，一个是叔胺氮，一个是酰胺氮，叔胺氮（N-1），呈碱性；酰胺氮（N-16），几乎不显碱性，所以它们只相当于一元碱。苦参碱的溶解性比较特殊，不同于一般的叔胺碱，它既可溶于水，又能溶于氯仿、乙醚等亲脂性溶剂。氧化苦参碱是苦参碱的氮氧化物，具半极性配位键，其亲水性比苦参碱更强，易溶于水，难溶于乙醚，但可溶于氯仿【11】。1.4 本论文的研究内容与目的本研究工作的主要重点是筛选出合适脱除该中药搽剂带色杂质的大孔树脂以及优化吸附解吸条件。筛选出的树脂应对该种中药搽剂有较好的脱色效果，且对搽剂中有效成分的保留率较高。本研究的主要内容包括：（1）大孔树脂的筛选；（2）获得静态吸附曲线；（3）研究温度对静态吸附的影响；（4）研究树脂用量对静态吸附的影响；（5）解吸剂的选择对解吸效果的影响；（6）获得静态解吸曲线；（7）获得动态吸附曲线；（8）研究树脂用量对动态吸附的影响；（9）研究流速对动态吸附的影响；（10）获得动态解吸曲线；（11）大孔树脂的解吸再生。2 实验部分2.1 实验仪器及药品本论文中所使用的主要仪器和设备如表2.1所示表 2.1 主要仪器和设备仪器与设备名称规格生产厂家电子分析天平BSA224S-CW德国赛多利斯集团百万分之一天平德国赛多利斯集团集热式磁力加热搅拌器DF-江苏宏凯仪器厂电热恒温鼓风干燥箱DHG-9075A上海一恒科技有限公司数显水浴恒温振荡器SHA-C金坛市江南仪器厂离心机TGL-16gR上海安亭科学仪器厂层析柱紫外/可见光光度计UV-2550日本岛津公司液相色谱仪Agilent 1100安捷伦科技有限公司本论文所使用的主要实验药品如表2.2所示表 2.2 主要实验药品试剂名称纯度生产厂家盐酸分析纯上海中试化工总公司氢氧化钠分析纯上海振企化学试剂有限公司十二水合硫酸铝钾分析纯上海试四赫围化工有限公司乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司异丙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司甲醇色谱纯国药集团化学试剂有限公司氨水分析纯国药集团化学试剂有限公司苯色谱纯国药集团化学试剂有限公司乙酸乙酯分析纯国药集团化学试剂有限公司十三味中药合肥大药房大孔树脂D280大孔树脂X-5南开大学化工厂南开大学化工厂大孔树脂NKA-9南开大学化工厂大孔树脂AB-8安徽三星树脂有限公司大孔树脂D001安徽三星树脂有限公司大孔树脂D101安徽三星树脂有限公司大孔树脂D301安徽三星树脂有限公司2.2 实验方法与过程2.2.1 中药搽剂制备苦参等7种中药加一定体积分数的乙醇密闭浸渍二次，每次24h，滤过，合并滤液得该中药搽剂的醇提液；乌梅等5种中药加水煎煮三次，每次1小时，滤过，合并滤液，趁热加入明矾，搅拌使溶解，沉淀后过滤得该中药搽剂的水煎液。将上述两溶液合并，加氢氧化钠溶液调节pH值，静置24小时，滤过，滤液加苯甲酸钠，搅拌使溶解，加水至规定量，滤过，即得。2.2.2 大孔树脂预处理取上述七种大孔树脂，用乙醇浸泡24h，充分溶胀后装柱，用乙醇洗至流出液加3倍体积的蒸馏水无白色浑浊现象，再用蒸馏水洗至无醇备用即可【12】【15】。2.2.3 静态吸附筛选树脂分别精密称取上述各型号预处理过的干燥树脂1.0g，置于100mL具塞锥形瓶中，分别加入50mL中药搽剂溶液密塞，放入恒温（30），转速为150rmin-1的振荡器中振荡24h，静置，离心，取滤液测定吸光度，并按2.3.2的计算方法计算各脱色率和保留率，筛选出脱色率和保留率均较大的树脂或组合并用其进行后续试验。并绘制筛选出的树脂的静态吸附脱色动力学曲线（脱色率-脱色时间）和树脂静态吸附有效成分保留率曲线【16】。2.2.4 温度对大孔树脂脱色效果的影响取筛选出的树脂D001大孔树脂1.0g5份，各加入7.5mL中药搽剂溶液于100mL具塞锥形瓶中，分别在30、45、60的恒温水浴振荡器中振荡脱色一定时间（根据静态吸附动力曲线获得），离心后取滤液测定吸光度，并按2.3.2计算脱色率和保留率，以确定最佳温度【17】。取筛选出的树脂D280大孔树脂按上述方法分成5份分别处理50ml中药搽剂溶液，以确定最佳温度。2.2.5 树脂用量对大孔树脂脱色效果的影响取筛选出的树脂D001大孔树脂0.1g、0.3g、0.6g、1.0g、1.5g各一份，各加入7.5ml中药搽剂水煎液于100ml具塞锥形瓶中，在30恒温水浴振荡器中振荡脱色一定时间（根据静态吸附动力曲线获得），离心后取滤液测定吸光度，并按2.3.2计算脱色率和保留率，以确定最佳树脂用量。再取筛选出的树脂D280大孔树脂0.5g、1.0g、3.0g、5.0g各一份按上述方法分别处理50ml中药搽剂溶液，以确定最佳树脂用量。2.2.6 解吸剂的选择及静态解吸分别取蒸馏水50ml、30%乙醇水溶液50ml、60%乙醇水溶液50ml、纯乙醇50ml、5%氢氧化钠水溶液20ml、5%盐酸水溶液20ml置于100ml具塞锥形瓶中，每个锥形瓶中加入1g处理过7.5ml中药水煎液的D001大孔树脂或1g处理过50ml中药搽剂溶液的D280大孔树脂，在30恒温水浴振荡器中解吸5.5h后测定解吸液吸光度，得到最佳解吸剂。绘制筛选出的最佳解吸剂的静态解吸曲线，静态解吸的条件为30恒温水浴振荡。2.2.7 动态吸附取25ml中药水煎液上柱（大孔树脂D001装柱5cm），控制流速分别为1. 5、3. 0、6. 0、9. 0 BV /h（BV为大孔树脂体积倍数），在不同处理量取样测定脱色率，并绘制脱色率-处理量曲线选择最佳流速。取60ml中药搽剂溶液上柱（大孔树脂D280装柱5cm），控制流速分别为1. 5、3. 0、6. 0、9. 0 BV /h，进行动态吸附实验。取25ml中药水煎液上柱（流速为3.0 BV /h），大孔树脂D001装柱分别为2cm、5cm、7cm、9cm，在不同处理量取样测定脱色率，并绘制脱色率-处理量曲线选择最佳流速。取60ml中药搽剂溶液上柱（流速为3.0 BV /h），用大孔树脂D280分别装柱2cm、5cm、7cm、9cm进行上述实验。所有的动态实验均在室温下进行。2.2.8 动态解吸取25ml5%氢氧化钠水溶液上柱（处理过流速为1. 5 BV /h的中药水煎液25ml的大孔树脂D001装柱5cm）， 控制流速1. 5 BV /h，在不同处理量取样测定解吸率，并绘制解吸液吸光度-处理量曲线。取60ml5%氢氧化钠水溶液上柱（处理过流速为1. 5 BV /h的中药搽剂溶液60ml的大孔树脂D280装柱5cm），控制流速1. 5 BV /h，在不同处理量取样测定解吸率，并绘制解吸液吸光度-处理量曲线。2.2.9 再生树脂的静态吸附性能取解吸再生过的D001大孔树脂1g加入到100ml具塞锥形瓶中，并加入7.5ml中药水煎液在30恒温水浴振荡，每隔一定时间测定吸光度，计算脱色率并绘制树脂静态吸附脱色动力学曲线。另取解吸再生过的D280大孔树脂1g对 50ml中药搽剂溶液在上述条件下静态吸附获得数据。2.3 分析与测定方法2.3.1吸光度的测定测定吸光度时最大吸收波长的确定：将脱色前、后的中药搽剂溶液于200800nm波长范围内进行全波长扫描，以确定其最大吸收波长。2.3.2脱色率和保留率的计算脱色前溶液的吸光度用A1表示，脱色后的吸光度用A2表示，则脱色率【18】为： （2-1）脱色前盐酸小檗碱或苦参碱的含量用m前表示，脱色后盐酸小檗碱或苦参碱的含量用m后表示，则保留率【18】为： （2-2）解吸率【19】的计算公式如下：解吸率= 解吸液吸光度/(脱色前吸光度-脱色后吸光度) 100% （2-3）2.3.3盐酸小檗碱含量测定先采用薄层色谱法【20】【21】将待测样品中的盐酸小檗碱分离出来，吸取供试品溶液、对照品溶液各10l，分别点于同一硅胶G薄层板（100活化1h后的）上，以苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-水（6:3:2:1.5:0.5）为展开剂，置氨蒸汽饱和的展开缸内，展开，取出（展开剂在氨蒸汽饱和的展开缸内存放半小时后方能将硅胶薄层板放入以保证氨蒸气饱和）。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。将样品与对照品相应位置上的斑点全部刮下来置于10ml容量瓶中，各加入2.8ml甲醇进行溶解【22】。精密称取盐酸小檗碱对照品5mg并定溶于10ml容量瓶中，并分别配制成0.005、0.01、0.02、0.03、0.05mg/ml的标准溶液。用紫外/可见分光光度计在200800nm范围内进行全波长扫描，找出最大吸收波长，测定最大吸收波长处各浓度标准溶液的吸光度，绘制标准曲线。测定最大吸收波长处的样品吸光度，即可得样品中盐酸小檗碱含量【23】【24】。2.3.4苦参碱含量测定高效液相色谱法【25】测定苦参碱含量操作方法：色谱条件 仪器：高效液相色谱仪。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液(pH6.86)-三乙胺(15:25:65:0.1)为流动相，流速0.8ml/min；检测波长为220nm。理论板数按苦参碱峰计算应不低于1500。柱温：40。采用外标一点法【26】定量。标准品溶液：取苦参碱对照品0.538mg，精密称定于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容配成标准溶液。精密吸取20L注入液相色谱仪，找出苦参碱的停留时间并得到标准溶液的峰面积。样品测定。精密量取待测液20L在上述色谱条件下测定。通过与标准溶液对比得到样品溶液中苦参碱含量。已知峰面积，苦参碱含量的计算方法：WACB （2-4）式中W与A分别代表在样品溶液进样体积中所含i组分的浓度及相应的峰面积。C及B分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的浓度及相应峰面积。3 实验结果与讨论3.1 静态吸附筛选树脂结果3.1.1脱色率对中药搽剂原液进行紫外/可见全波长扫描后发现没有最大吸收峰，在紫外波段不同树脂处理过的中药吸光度值变化不大，而在530nm左右的波段变化明显；且该中药搽剂为橙色系与红色系的混合色，脱色后溶液呈橙色，故脱掉的杂质为红色系物质，而红色的最大吸收波长范围为500560nm。综合以上两种因素，后面均考察待测液在530nm处的吸光度。首先对AB-8、D001、D101、D301、D280、X-5、NKA-9七种大孔树脂进行静态吸附试验（30恒温水浴振荡24h）结果是D001、D301、D280三种大孔树脂脱色效果较好，如表3.1所示，但是通过薄层色谱法的初步判断D001树脂对该中药搽剂中有效成分盐酸小檗碱几乎没有保留。而盐酸小檗碱是中药黄连中的主要成分，仅存在于醇提液中，故可用D001树脂先对水煎液进行处理再与醇提液混合后用其它树脂进行脱色。故对两种树脂联合使用进行考察，即先用D001处理水煎液后与醇提液混合后分别用D280、D301进行脱色，还有中药搽剂溶液先后用D301、D280大孔树脂处理，最终结果是D001/D280的联合使用脱色率最高。故考虑脱色率筛选出的最佳脱色树脂为D001与D280的联合使用。根据大孔树脂的分离原理及盐酸小檗碱的性质可知【27】【28】，强酸性及弱酸性树脂均为阳离子交换树脂，而盐酸小檗碱溶于乙醇电离后以阳离子的形式存在，所以酸性离子交换树脂D101、D001对有效成分盐酸小檗碱均没有保留。而且盐酸小檗碱为弱极性，故弱极性树脂AB-8也会吸附有效成分盐酸小檗碱。表3.1 不同树脂的脱色率树脂种类D101D001D301D280X-5初始吸光度0.7130.7130.7130.7130.713吸附24h后吸光度0.5140.3020.4900.4060.612脱色率/%27.9157.6431.2843.0614.17盐酸小檗碱无无有有有树脂种类AB-8NKA-9D001/D280D001/D301D280/D301初始吸光度0.7130.7130.7130.7130.713吸附24h后吸光度0.5720.6120.3790.5110.383脱色率/%19.7814.1746.8428.3346.28盐酸小檗碱无有有有有3.1.2盐酸小檗碱保留率（1）盐酸小檗碱标准曲线的绘制用紫外/可见分光光度计对盐酸小檗碱标准溶液进行全波段扫描，得到最大吸收波长为429nm，故盐酸小檗碱标准及样品溶液吸光度值的测定均在429nm处。表3.2 盐酸小檗碱标准曲线数值浓度/mgml-10.0050.010.020.030.050.10.150.20.25吸光度0.0740.1510.2850.4250.7061.3642.0992.8353.672图3.1 盐酸小檗碱标准曲线由盐酸小檗碱浓度与吸光度关系曲线拟合的方程为：y=14.05x+0.0042 （3-1）（2）不同树脂处理过的中药搽剂中盐酸小檗碱含量及保留率的计算盐酸小檗碱浓度的计算公式为： 其中c代表样品溶液中盐酸小檗碱的浓度，A代表样品溶液在429nm处的吸光度。盐酸小檗碱保留率的计算公式为： （3-3）其中脱色前盐酸小檗碱或苦参碱的含量用m前表示，脱色后盐酸小檗碱或苦参碱的含量用m后表示。表3.3 不同树脂处理过的中药搽剂中盐酸小檗碱含量及保留率浓度/mgml-1原液D301D280X-5NKA-9D001/D280D001/D301D280/D301吸光度0.4920.3690.4070.1920.4280.4150.3830.212含量/mgml-19.807.288.123.928.688.407.564.20保留率/%10074.2982.8640.0088.5785.7177.1442.86由表3.3可知D001/D280大孔树脂联合使用时盐酸小檗碱的保留率最高，故D001/D280的联合使用为脱色最佳树脂。另外由于D001、D101、AB-8大孔树脂处理过的中药搽剂在做薄层色谱时与盐酸小檗碱标准溶液相对应的位置无斑点，故可判断处理后不含盐酸小檗碱。3.1.3苦参碱保留率不同树脂处理过的中药搽剂中苦参碱含量及保留率的计算结果如表3.4所示，仅选取了对盐酸小檗碱保留率较高的几种处理方法测定了苦参碱含量及保留率。由表3.4可看出D001/D280组合的苦参碱保留率虽不是最高，但其处理后的含量已满足国家药品监督管理局的标准（标准号WS-11261(ZD-1261)-2002）要求（每1ml中药搽剂中不少于4.0g），而脱色率又最高，故可判断其为最佳树脂。表3.4 不同树脂处理过的中药搽剂中苦参碱含量及保留率树脂种类D001/D280D280/D301D001/D301D280吸附前含量/gml-172.1272.1272.1272.12吸附后含量/gml-123.3135.0839.7527.11保留率/%32.3248.6455.1237.593.2 静态吸附曲线用1g大孔树脂D001在30恒温水浴振荡处理经过醇沉处理过的中药水煎液7.5ml，间隔一定的时间测定吸光度，计算脱色率，得到静态吸附曲线。之所以对中药水煎液进行醇沉处理，是因为张旭等【29】认为对中药水煎液进行前处理有利于提高大孔树脂的分离效果，而且水煎液性质不稳定，久置后出现沉淀，醇沉后水煎液稳定性良好。 表3.5 大孔树脂D001静态吸附曲线数据时间/min0102030405090120150初始吸光度1.3941.3941.3941.3941.3941.3941.3941.3941.394吸附后吸光度1.3940.9020.8370.8170.8080.8090.8030.7700.768脱色率/%035.2939.9641.3942.0442.0442.4044.7644.91图3.2 大孔树脂D001静态吸附曲线将上述用大孔树脂D001处理过的水煎液7.5ml与42.5ml醇提液混合后，再用大孔树脂D280在30恒温水浴振荡处理，间隔一定的时间测定吸光度，计算脱色率，得到静态吸附曲线。表3.6 大孔树脂D280静态吸附曲线数据时间/min01060120180240300360435620初始吸光度0.5660.5660.5660.5660.5660.5660.5660.5660.5660.566吸附后吸光度0.5660.5360.4990.4640.4580.4500.4380.4230.4210.420脱色率/%05.3011.8418.0219.0820.4922.6125.2725.6225.80注：上表中的吸光度值不是原液的吸光度，因为用的水煎液是经大孔树脂D001处理过的图3.3 大孔树脂D280静态吸附曲线由图3.2可知，大孔树脂D001在60min时已达到吸附饱和。由图3.3可知大孔树脂D280在360min时达到吸附饱和。3.3 温度对静态吸附的影响表3.7 温度对大孔树脂D280吸附性能的影响温度/304560初始吸光度0.7270.7270.727最终吸光度0.4280.4170.422脱色率/%41.1342.6441.95表3.8 温度对大孔树脂D001 吸附性能的影响温度/304560初始吸光度1.3941.3941.394最终吸光度0.7680.9540.967脱色率/%44.9131.5630.63由表3.7可知，温度对D280的吸附性能几乎没有影响，从经济的角度考虑，温度越低越节能，并且强碱性离子交换树脂不能在较高的温度下使用，故30为最佳温度。由表3.8可知，D001的吸附性能随温度的升高而降低，故30为最佳温度。3.4 树脂用量对静态吸附的影响3.4.1树脂用量对脱色率的影响（1）不同量的树脂D280在30条件下恒温水浴振荡处理50ml中药搽剂，脱色率结果如表3.9及图3.4所示，随着树脂用量的增加脱色率增加，但是考虑经济因素的影响，3.0g树脂处理50ml中药脱色率较高且用量合理，为最佳用量。表3.9 树脂用量对D280脱色率的影响树脂用量/g0.51.03.05.0初始吸光度0.7270.7270.7270.727最终吸光度0.6180.4280.3100.285脱色率14.9944.9157.3660.80图3.4 树脂用量对D280脱色率的影响（2）不同量的树脂D001在30条件下恒温水浴振荡处理7.5ml中药水煎液，脱色率结果如表3.10及图3.5所示，随着树脂用量的增加脱色率增加，但是考虑经济因素的影响，1.0g树脂处理7.5ml水煎液脱色率较高且用量合理，为最佳用量。表3.10 树脂用量对D001脱色率的影响树脂用量/g0.10.30.61.01.5初始吸光度2.0602.0602.0602.0602.060最终吸光度1.8081.6041.4121.3081.241脱色率/%12.2322.1431.4636.5039.76图3.5 树脂用量对D001脱色率的影响3.4.2树脂用量对盐酸小檗碱保留率的影响表3.11 大孔树脂D280用量对盐酸小檗碱保留率的影响树脂用量/g0.51.03.05.0吸光度0.4130.4160.4150.401含量/mgml-18.238.298.267.98保留率/%83.9884.5984.2981.43图3.6 大孔树脂D280用量对盐酸小檗碱保留率的影响由表3.11及图3.6可知D280的用量对盐酸小檗碱的保留率影响不大，故选择3.0g树脂处理50ml中药为最佳D280树脂用量合理。D280为大孔强碱性阴离子交换树脂，从结构的角度分析，其对盐酸小檗碱（阳离子形式存在）没有交换作用。3.4.3树脂用量对苦参碱保留率的影响表3.12 大孔树脂D280用量对苦参碱保留率的影响树脂用量/g0.51.03.05.0吸附前含量/gml-172.1272.1272.1272.12吸附后含量/gml-131.9227.1123.9116.56保留率/%44.2637.5933.1522.96图3.7 大孔树脂D280用量对苦参碱保留率的影响由表3.12及图3.7可知，随着D280用量的增加苦参碱保留率降低，但是考虑脱色率需较大的因素，且3.0g树脂处理50ml中药用量下的苦参碱含量可满足国家药品监督管理局的标准要求，故该用量为最佳用量合理。3.5 解吸剂的选择3.5.1不同解吸剂的影响取处理过中药水煎液的D001大孔树脂各1g五份分别用5%氢氧化钠20ml、5%盐酸20ml、蒸馏水50ml、30%乙醇水溶液50ml、60%乙醇水溶液50ml、纯乙醇50ml振荡解吸5.5h，结果如表3.13所示，5%氢氧化钠解吸过的解吸液吸光度值最大，即解吸效果最好，其次是60%乙醇水溶液，故可得D001最佳解吸剂为5%氢氧化钠。同样取相同量的上述5种解吸剂对五份各1g处理过50ml中药搽剂的D280树脂振荡解析5.5h，结果如表3.14所示，5%氢氧化钠解吸过的解吸液吸光度值最大，即解吸效果最好，其次是5%盐酸和60%乙醇水溶液，故可得D280最佳解吸剂也为5%氢氧化钠。其中几种解吸剂的选择依据如下：由于待脱色的中药搽剂为水-乙醇体系，故选择一系列不同体积分数的乙醇水溶液为解吸剂进行解吸；D001、D280均为离子交换树脂，吸附的带色杂质均为离子，水或乙醇可能较难解吸，故采用碱和酸为解吸剂进行解吸（质量分数为大孔树脂使用说明书提供），酸洗和碱洗可除去死吸附的酸碱性成分。由结果可知，5%氢氧化钠解吸效果最好，尤其是对大孔强碱性阴离子交换树脂D280解吸效果明显，故可判断带色杂质多为阴离子杂质。表3.13 不同解吸剂对D001树脂解吸效果的影响解吸液种类5%碱5%酸纯水30%乙醇60%乙醇100%乙醇解吸液吸光度0.1380.0140.0030.0070.0140.003表3.14 不同解吸剂对D280树脂解吸效果的影响解吸液种类5%碱5%酸纯水30%乙醇60%乙醇100%乙醇解吸液吸光度0.3690.0450.0130.0100.0140.0063.5.2 水-乙醇体系解吸由于用5%氢氧化钠解吸得到的解吸液与中药搽剂原液相比体系和浓度均发生变化，不能用式（2-3）计算解吸率，只能用解吸液最终的吸光度值表征解吸效果，考虑到数据体系的完整性，采用与中药原液同体系且解吸效果较好的的60%乙醇水溶液进行一系列静态解吸实验。（1）乙醇浓度对静态解吸的影响取处理过中药水煎液的D001大孔树脂各1g五份分别用蒸馏水、30%乙醇水溶液、60%乙醇水溶液、纯乙醇各50ml振荡解吸5.5h，结果如表3.15及图3.8所示，从最终解吸液吸光度及解吸率均可说明60%乙醇水溶液解吸效果最好。表3.15 乙醇浓度对D001静态解吸的影响乙醇浓度/体积分数%03060100解吸液吸光度0.0030.0070.0140.003脱色前吸光度1.3941.3941.3941.394脱色后吸光度0.7680.7680.7680.768解吸率/%0.481.122.240.48图3.8 乙醇浓度对D001静态解吸的影响同理对D280大孔树脂进行上述解吸实验，结果如表3.16及图3.9所示，从最终解吸液吸光度及解吸率均可说明60%乙醇水溶液解吸效果最好。表3.16 乙醇浓度对D280静态解吸的影响乙醇浓度/体积分数%03060100解吸液吸光度0.0130.0100.0140.006脱色前吸光度0.7270.7270.7270.727脱色后吸光度0.4280.4280.4280.428解吸率/%4.353.344.682.01图3.9 乙醇浓度对D280静态解吸的影响（2）每50ml解吸剂60%乙醇水溶液解吸不同树脂用