药品微生物限度检测技术课件

课前复习 1 药品质量的好坏直接关系到病人的安危，药品微生物限度检 测是全面控制药品质量的一个重要环节 一些中小型企业 在检验过程中对 药品质量溶出 度等把关严，但 对微生物限度的 控制和检验大都 没有严格的要求 受污染的药品中，最为 普遍的是中成药 问题导入：药品中微生物限度检测现状 药品微生物限度检测技术药品微生物限度检测技术 3 重点重点 药品细菌药品细菌酵母菌及酵母菌及 霉菌的检测方法霉菌的检测方法 教学目的 及要求 难点难点 掌握掌握 药品细菌药品细菌酵母菌及霉酵母菌及霉 菌的检测方法菌的检测方法 理解理解 药品大肠菌群药品大肠菌群沙门菌沙门菌 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌铜铜 绿假单胞菌的检测方法绿假单胞菌的检测方法 了解了解 药品微生物限度检测检药品微生物限度检测检 验记录的书写方法验记录的书写方法 药品微生物检查药品微生物检查 无菌检查无菌检查法法 非非无菌产品微生物限度检查无菌产品微生物限度检查 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 非无菌药品的微生物限度非无菌药品的微生物限度 微生物限度检查法 中国药典2015年版修订后将分为三个 附录： 1、非无菌产品微生物限度检查：微生 物计数法 2、非无菌产品微生物限度检查：控制 菌检查法 3、非无菌药品微生物限度标准 非无菌产品微生物限度检查 1.1 总则：环境、要求 1.2 计数方法：平皿法、薄膜过滤法、最可能数 法（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适 用性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性 检查、计数方法适用性试验 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基 非无菌产品微生物限度检查 1.非无菌产品微生物限度检查： -微生物计数法 非无菌产品微生物限度检查 1.1 总则： 微生物计数 法系用于能 在有氧条件 下生长的嗜 温细菌和真 菌的计数 当本法用于检查 非无菌制剂及其 原、辅料等是否 符合规定的微生 物限度标准时， 应按规定进行检 验，包括样品的 取样量和结果的 判断等；除另有 规定外，本法不 适用于活菌制剂 的检查 本检查法可 采用替代的 微生物检查 法，包括自 动检测方法 ，但必须证 明替代方法 等效于药典 规定的检查 方法 1.1 总则： 环境： 非无菌产品微生物限度检查 微生物计数试验环 境应符合微生物限 度检查的要求 (在不 低于GMP现行版要 求的D级洁净环境、 局部洁净度不低于B 级的单向流空气区 域内进行)【10版： 在环境洁净度10000 级下的局部洁净度 100级的单向流空气 区域内】 检验全过程必 须严格遵守无 菌操作，防止 再污染，防止 污染的措施不 得影响供试品 中微生物的检 出 单向流空 气区域、 工作台面 及环境应 定期进行 监测 1.1 总则： 非无菌产品微生物限度检查 如供试品有抗菌活 性，应尽可能去除 或中和；供试品检 查时, 若使用了中 和剂或灭活剂，应 确认其有效性及对 微生物无毒性 供试液制备时如 果使用了表面活 性剂，应确认其 对微生物无毒性 以及与所使用中 和剂或灭活剂的 相容性 平皿法 薄膜过滤法 最可能数法（Most-Probable- NumberMethod，简称MPN 法） MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些 微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合 的方法 供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准 等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样 品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品 是否符合规定；所选方法的适用性须经确认 非无菌产品微生物限度检查 1.2计数方法： 非无菌产品微生物限度检查 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验 供试品微 生物计数 中所使用 的培养基 应进行适 用性检查 供试品的微生 物计数方法应 进行方法适用 性试验【10版 ：方法验证】 ，以确认所采 用的方法适合 于该产品的微 生物计数 若检验程序 或产品发生 变化可能影 响检验结果 时，计数方 法应重新进 行适用性试 验 1.3.1菌液制备及使用 1.3.2计数培养基适用性检查 1.3.3计数方法适用性试验 非无菌产品微生物限度检查 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验 1.3.1菌液制备及使用 菌种 试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌 种为第0代），并采用适宜的菌种保 藏技术进行保存，以保证试验菌株 的生物学特性 非无菌产品微生物限度检查 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验 菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在2 8，可在24小时内使用；稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2 8，在验证过的贮存期内使用 1.3.1菌液制备及使用 非无菌产品微生物限度检查 试验菌株试验菌液的制备 金黄色葡萄球菌 CMCC(B) 26 003) 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨 液体培养基 【10版：营养肉汤或营养琼脂培养基 】 3035，1824小时 铜绿假单胞菌 CMCC（B)10 104 枯草芽孢杆菌 CMCC(B) 63 501 白色念珠菌 CMCC(F) 98 001 沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培 养基，2025，23 天 【10版：改良马丁（琼脂）培养基，2328 ，2448h】 黑曲霉 CMCC(F) 98 003 沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂 培养基 ，2025，57天 ，或直接获得 丰富孢子 【10版：改良马丁琼脂斜面培养基，2328 ，57天】 1.3.2计数培养基适用性检查【15版 】 非无菌产品微生物限度检查 需氧菌总 数计数 金黄色葡萄球菌胰酪大豆胨琼脂培养基 或 胰酪大豆胨液体培养基 3035 不超过3天 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌胰酪大豆胨琼脂培养基3035 不超过5天 黑曲霉 霉菌和酵母 菌总数计数 白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂培养基2025 不超过5天 黑曲霉 每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量不大于100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验 结果判定： 被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落 平均数的比值应在0.5-2 范围内，且菌落形态大小应与对 照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养 基管比较，试验菌应生长良好 非无菌产品微生物限度检查 1.3.3计数方法适用性试验 供试液制备 接种和稀释 抗菌活性的去除与灭活 供试品中微生物的回收 平皿法 薄膜过滤法 最可能数法（MPN 法） 结果判断 1.4.1检验量 非无菌产品微生物限度检查 1.4 供试品检查 检验量即 一次试验 所用的供 试品量（g 、ml 或 cm ） 除另有规定外，一般供试 品的检验量为10g 或10ml ；膜剂为100cm ；贵重 药品、微量包装药品的检 验量可以酌减；检验时， 应从2 个以上最小包装单 位中抽取供试品，大蜜丸 不得少于4丸，膜剂不得少 于4片 一般应随机 抽取供试品 ，取规定容 器数，混合 ，取规定量 供试品进行 检验 按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供 试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养 基用于测定需氧菌总数 沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌 总数 阴性对照试验 以稀释剂代替供试液进行阴性对照试验，阴 性对照试验应无菌生长；如果阴性对照有菌 生长，应进行偏差调查 非无菌产品微生物限度检查 1.4.2供试品检查 供试液制备 非无菌产品微生物限度检查 1.4.2供试品检查 常用的供试液制备方 法如下；如果下列供 试液制备方法经确认 均不适用，应建立其 他适宜的方法 根据供试品的理化特性与生 物学特性，采取适宜的方法 制备供试液；供试液制备若 需加温时，应均匀加热，且 温度不应超过 45；供试液 从制备至加入检验用培养基 ，不得超过 1小时 供试液制备 水溶性供试品 非无菌产品微生物限度检查 1.4.2供试品检查 取供试品，用 pH7.0 无菌氯 化钠-蛋白胨 缓冲液，或 pH7.2 磷酸盐 缓冲液，或胰 酪大豆胨液体 培养基溶解或 稀释制成 1:10 供试液 若需要，调节 供试液 pH 值 至 68；必 要时，用同一 稀释液将供试 液进一步 10 倍系列稀释 水溶性液体 制剂也可用 混合的供试 品原液作为 供试液 非无菌产品微生物限度检查 1.4.2供试品检查 供试液制备 水不溶性非油脂类供试品 取供试品， 用 pH7.0 无菌氯 化钠-蛋白胨缓 冲液，或 pH7.2 磷酸盐 缓冲液，或胰 酪大豆胨液体 培养基制备成 1:10 供试液 分散力较差的 供试品，可在 稀释液中加入 表面活性剂如 0.1%的聚山梨 酯 80，使供试 品分散均匀 若需要，调 节供试液 pH值至 6 8；必要时 ，用同一稀 释液将供试 液进一步 10 倍系列稀释 非无菌产品微生物限度检查 1.4.2供试品检查 供试液制备 油脂类供试品 取供试品，加 入无菌十四烷 酸异丙酯使溶 解，或与最少 量并能使供试 品乳化的无菌 聚山梨酯 80 或其他无抑菌 性的无菌表面 活性剂充分混 匀 表面活性剂的温 度一般不超过 40（特殊情况 下，最多不超过 45），小心混 合，若需要可在 水浴中进行，然 后加入预热的稀 释液使成 110 供试液，保温， 混合，并在最短 时间内形成乳状 液 必要时，用 稀释液或含 上述表面活 性剂的稀释 液进一步 10倍系列稀 释 非无菌产品微生物限度检查 1.4.2供试品检查 供试液制备 需用特殊方法制备供试液的供试品 膜剂供试品 贴膏剂供试品 肠溶及结肠溶 制剂供试品 气雾剂、 喷雾剂供 试品 平皿法 平皿法包括倾注法和涂布法 非无菌产品微生物限度检查 1.4.2供试品检查 除另有规定外 ，取规定量供 试品，按方法 适用性试验确 认的方法进行 供试液制备和 菌数测定，每 稀释级每种培 养基至少制备2 个平皿 培养和计数 ：除另有规定外 ，胰酪大豆胨琼脂培养基平 板在3035培养3天，沙氏 葡萄糖琼脂培养基平板在20 25培养5 天，观察菌落 生长情况，点计平板上生长 的所有菌落数，必要时可适 当延长培养时间至7 天进行菌 落计数并报告；菌落蔓延生 长成片的平皿不宜计数；点 计菌落数后，计算各稀释级 供试液的平均菌落数，按菌 数报告规则报告菌数 若同稀释级 两个平皿的 菌落数平均 值不小于15 ，则两个平 皿的菌落数 不能相差1 倍或以上 菌数报告规则 非无菌产品微生物限度检查 如各稀释级的平皿均 无菌落生长，或仅最 低稀释级的平板有菌 落生长，但平均菌落 数小于1 时，以 1 乘以最低稀释倍数的 值报告菌数 需氧菌总数测定宜选取平均 菌落数小于 300cfu 的稀释 级霉菌和酵母菌总数测定 宜选取平均菌落数小于 100cfu 的稀释级，作为菌 数报告（取两位有效数字） 的依据；取最高的平均菌落 数，计算1g、1ml 或10 cm 供试品中所含的微生物数 薄膜过滤法 非无菌产品微生物限度检查 培养和计数：培 养条件和计数方 法同平皿计数法 ，每张滤膜上的 菌落数应不超过 100cfu 除另有规定外，按计数方法 适用性试验确认的方法进行 供试液制备。取相当于1g、 1ml 或10 cm 供试品的供试 液，若供试品所含的菌数较 多时，可取适宜稀释级的供 试液，照方法适用性试验确 认的方法加至适量稀释液中 ，立即过滤，冲洗，冲洗后 取出滤膜，菌面朝上贴于胰 酪大豆胨琼脂培养基或沙氏 葡萄糖琼脂培养基上培养 菌数报告规则 非无菌产品微生物限度检查 以相当于 1g、1ml 或 10cm2 供试 品的菌落数 报告菌数 若滤膜上无菌落 生长，以 1 报 告菌数（每张滤 膜过滤1g、1ml 或10cm2 供试品 ）,或 1 乘以最 低稀释倍数的值 报告菌数 MPN 法 非无菌产品微生物限度检查 记录每一稀释级 微生物生长的管 数，从表3查对每 1g 或1ml 供试品 中需氧菌总数的 最可能数 取规定量供试品，按方 法适用性试验确认的方 法进行供试液制备和供 试品接种，所有试验管 在3035培养35 天 ，如果需要确认是否有 微生物生长，按方法适 应性试验确定的方法进 行 1.5结果判断 需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落 数（包括真菌菌落数） 霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的 总菌落数（包括细菌菌落数） 若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母 菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素 （如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其 他选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基）进行霉菌和 酵母菌总数测定 使用选择性培养基时，应进行培养基适用性检查；若采 用MPN 法，测定结果为需氧菌总数 非无菌产品微生物限度检查 各品种项下规定的微生物限度标准解释如下： 101cfu： 可接受的最大菌数为20 102cfu： 可接受的最大菌数为200 103cfu： 可接受的最大菌数为2000：依此类推 若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的 检查结果均符合该品种项下的规定，判供试品 符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下 的规定，判供试品不符合规定 非无菌产品微生物限度检查 1.5结果判断 2.1 总则：环境、要求 2.2 培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性 试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、控制菌检查方法适用性试验、 2.3 供试品检查：阴性对照试验、阳性对照试验 、耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌 、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、 白色念珠菌 2.4 稀释液 非无菌产品微生物限度检查 2.非无菌产品微生物限度检查： -控制菌检查法 2.1总则 非无菌产品微生物限度检查 控制菌检查法 系用于在规定 的试验条件下 ，检查供试品 中是否存在特 定的微生物 当本法用于检查 非无菌制剂及其 原、辅料是否符 合相应的微生物 限度标准时，应 按下列规定进行 检验，包括样品 取样量和结果判 断等 本检查法可采 用替代的微生 物检查法，包 括自动检测方 法，但必须证 明替代方法等 效于药典规定 的检查方法 2.1总则 非无菌产品微生物限度检查 供试液制备及 实验环境要求 同“非无菌产 品微生物限度 检查：微生物 计数法”（通 则1105） 如果供试品具有 抗菌活性，应尽 可能去除或中和 ；供试品检查时 ，若使用了中和 剂或灭活剂，应 确认有效性及对 微生物无毒性 供试液制备时 如果使用了表 面活性剂，应 确认其对微生 物无毒性以及 与所使用中和 剂或灭活剂的 相容性 2.2 培养基适用性检查和控制菌检查 方法适用性试验 2.2.1菌液制备 2.2.2培养基的适用性检查 2.2.2 控制菌检查用培养基的适用性检 查 2.2.3控制菌检查方法适用性试验 非无菌产品微生物限度检查 菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在 28，可在24小时内使用；生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌 悬液，稳定的孢子悬液可保存在28，在验证过的贮存期内使用 2.2.1菌液制备 非无菌产品微生物限度检查 试验菌株试验菌液的制备 金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26003)胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆 胨液体培养基 3035，1824小时 铜绿假单胞菌CMCC（B)10 104 大肠埃希菌CMCC（B）44 102 乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）50 094 白色念珠菌CMCC(F) 98 001沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄 糖液体培养基，2025，23 天 生孢梭菌CMCC（B）64 941 梭菌增菌培养基，厌氧条件下30 35，2448 小时或接种于硫乙醇 酸盐流体培养基中3035，18 24 小时 2.2.2 控制菌检查用培养基的适用性 检查 控制菌检查用培养基的适用性检查，检 查项目包括 促生长能力 抑制能力 指示能力 各培养基的检测项目及所用菌株见表1 非无菌产品微生物限度检查 2.2.2 控制菌检查用培养基的适用性检查 控制菌检检 查查 培养基特性试验试验 菌株 耐胆盐盐革 兰兰氏阴性 菌 【15版： 新增】 肠肠道菌增菌液体培养基促生长长能力大肠肠埃希菌 铜绿假单胞菌 抑制能力金黄色葡萄球菌 紫红红胆盐盐葡萄糖琼琼脂培 养基 促生长长能力+ 指示特性 大肠肠埃希菌 大肠肠埃希 菌 麦康凯凯液体培养基促生长长能力大肠肠埃希菌 抑制能力金黄色葡萄球菌 麦康凯琼凯琼 脂培养基 促生长长能力+ 指示特性 大肠肠埃希菌 【10版： 大肠肠菌群 】 乳糖胆盐发酵培养基 促生长能力大肠埃希菌 抑制能力金黄色葡萄球菌 乳糖发酵培养基 促生长能力+ 指示能力 大肠埃希菌 曙红亚甲蓝琼脂培养基 或麦康凯琼脂培养基 促生长能力+ 指示能力 大肠埃希菌 表1控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示特性 非无菌产品微生物限度检查 非无菌产品微生物限度检查 液体培养基促 生长能力检查 分别接种不大于100cfu 的 试验菌于被检培养基和对照 培养基中，在相应控制菌检 查规定的培养温度及不长于 规定的最短培养时间下培养 ，与对照培养基管比较，被 检培养基管试验菌应生长良 好 固体培养基促 生长能力检查 用涂布法分别接种不大于 100cfu 【10版：50100cfu 】的试验菌于被检培养基和 对照培养基平板上，在相应 控制菌检查规定的培养温度 及不长于规定的最短培养时 间下培养，被检培养基与对 照培养基上生长的菌落大小 、形态特征应一致 非无菌产品微生物限度检查 培养基抑制能力检查培养基指示特性检查 接种不少于100cfu 的试验菌于被检培 养基和对照培养基 中，在相应控制菌 检查规定的培养温 度及不短于规定的 最长培养时间下培 养，试验菌应不得 生长 用涂布法分别接种不大 于100cfu 的试验菌于 被检培养基和对照培养 基平板上，在相应控制 菌检查规定的培养温度 及不长于规定的最短培 养时间下培养，被检培 养基上试验菌生长的菌 落大小、形态特征、指 示剂反应情况等应与对 照培养基一致 2.2.3控制菌检查方法适用性试验 非无菌产品微生物限度检查 试验菌 根据各品种项下 微生物限度标准 中规定检查的控 制菌选择相应试 验菌株，确认耐 胆盐革兰阴性菌 检查方法时，采 用大肠埃希菌和 铜绿假单胞菌为 试验菌 上述试验若检出 试验菌，按此供 试液制备法和控 制菌检查方法进 行供试品检查； 若未检出试验菌 ，应消除供试品 的抑菌活性，并 重新进行方法适 用性试验 结果判断 如果经过试验确 证供试品对试验 菌的抗菌作用无 法消除，可认为 受抑制的微生物 不可能存在于该 供试品中，选择 抑菌成份消除相 对彻底的方法进 行供试品的检查 2.3供试品检查 供试品的控制菌检查应按经方法适用性试验确 认的方法进行 供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出 结果为准,不再复试 阳性对照试验 阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查,对照菌的 加量应不大于100cfu；阳性对照试验应检出相应的 控制菌 阴性对照试验 以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，阴性 对照试验应无菌生长；如果阴性对照有菌生长，应进 行偏差调查 非无菌产品微生物限度检查 控制菌检查过程： 使用无选择性增菌培养基（胰酪大豆胨液体 培养基）培养，使受损的细菌得到修复，提 高检出率 增菌培养-选择性增菌-选择性琼脂 非无菌产品微生物限度检查 2.3供试品检查 2.3.1耐胆盐革兰阴性菌【10版：大肠菌 群】 2.3.2大肠埃希菌 2.3.3沙门菌 2.3.4铜绿假单胞菌 2.3.5金黄色葡萄球菌 2.3.6梭菌 2.3.7白色念珠菌 非无菌产品微生物限度检查 2.3供试品检查 2.3.1耐胆盐革兰阴性菌【15版新增】 非无菌产品微生物限度检查 供试液制备和预培养定性试验 取供试品，用胰酪大豆 胨液体作为稀释剂按“ 非无菌产品微生物限度 检查：微生物计数法” （通则1105）制成1： 10 供试液，混匀，在 2025培养，培养 时间应使供试品中的细 菌充分恢复但不增殖（ 约2 小时） 除另有规定外，取相当于1g 或1mL 供试品的上述预培养 物接种至肠道菌增菌液体培 养基中，3035培养24 48 小时后，划线接种于紫红 胆盐葡萄糖琼脂培养基平板 上，3035培养1824 小时。如果平板上无菌落生 长，判供试品未检出耐胆盐 革兰阴性菌 2.3.1耐胆盐革兰阴性菌【15版新增】 非无菌产品微生物限度检查 定量试验结果判断 选择和分离培养 取相当 于0.1g、0.01g 和0.001g （或0.1mL、0.01mL 和 0.001mL）供试品的预培 养物或其稀释液分别接种 至肠道菌增菌液体培养基 中，3035培养24 48 小时；上述每一培养 物分别划线接种于紫红胆 盐葡萄糖琼脂培养基平板 上，3035培养18 24 小时 若紫红胆盐葡萄糖琼 脂培养基平板上有菌 落生长，则对应培养 管为阳性，否则为阴 性；根据各培养管检 查结果，从表查对1g 或1ml 供试品中含有 耐胆盐革兰阴性菌的 最大可能数 非无菌产品微生物限度检查 2.3.1大肠菌群【10版】 取供试液10ml（ 相当于供试品lg 、lml、10cm) ，直接或处理后 接种至适量（不 少于100ml）的 胆盐乳糖培养基 中，培养1824 小时，必要时可 延长至48小时 取上述培养物0.2ml，接种至含5ml MUG（ 4-甲基伞形酮葡糖苷酸）培养 基的试管内，培养，于5小时、24小时 在366nm紫外光下观察，同时用未接 种的MUG培养基作对照。若管内培养 物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧 光，为MUG阴性。观察后，沿培养管 的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈 玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本 色，为靛基质阴性。对照应为MUG阴 性和靛基质阴性 非无菌产品微生物限度检查 2.3.1大肠菌群【10版】 如MUG阳性、靛基质阳性 ，判供试品检出大肠埃希菌 ；如MUG阴性、靛基质阴 性，判供试品未检出大肠埃 希菌；如MUG阳性、靛基 质阴性，或MUG阴性、靛 基质阳性，则应取胆盐乳糖 培养基的培养物划线接种于 曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦 康凯琼脂培养基的平板上， 培养1824小时 若平板上无菌落生长或生长 的菌落与菌落形态特征不符 ，判供试品未检出大肠埃希 菌；若平板上生长的菌落与 菌落形态特征相符或疑似， 应进行分离、纯化、染色镜 检和适宜的鉴定试验，确认 是否为大肠埃希菌 2.3.2大肠埃希菌 供试液制备和增菌培养 取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数 法”（通则1105）制成1：10 供试液。取相当于1g 或 1mL 供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性 试验确定的）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30 35培养1824 小时 选择和分离培养 取上述预培养物1mL 接种至100mL 麦康凯液体培养基 中，4244培养2448 小时。取麦康凯液体培养物划 线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，3035培养18 72 小时 结果判断 若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯 化及适宜的鉴定试验, 确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯 琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定 结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌 非无菌产品微生物限度检查 非无菌产品微生物限度检查 初步鉴别初步鉴别 肠道致病菌和肠道致病菌和 肠道非致病菌肠道非致病菌 肠道致病菌肠道致病菌 多数多数不不发酵乳糖发酵乳糖 肠道非致病菌肠道非致病菌 多数发酵乳糖多数发酵乳糖 乳糖发酵试验重要试验 非无菌产品微生物限度检查 EMB（伊红美兰培养基），乳糖、伊红、美兰 选择作用 （弱选） 大肠埃希菌 （非致病菌） 乳糖 发酵 产酸 伊红 结合 美兰 形成紫黑色金 属光泽化合物 有色的乳糖发酵菌落 伤寒沙门菌等 （致病菌） 乳糖 不发酵 伊红美兰不能结合 无色的乳糖不发酵菌落 非无菌产品微生物限度检查 EMB 非无菌产品微生物限度检查 SS培养基（沙门志贺培养基） 乳糖、中性红指示剂、胆盐、煌绿等抑制剂 选择抑制 作用 （强选） 大肠埃希菌 产酸 伤寒沙门菌 胆盐、煌绿：抑制大肠埃希菌及G+菌，提高肠道致病菌 检出率 乳糖 发酵 中性红 呈红色 乳糖 不发酵 桃红色乳糖发酵菌落 无色乳糖不发酵菌落 非无菌产品微生物限度检查 S S 大肠埃希菌 非无菌产品微生物限度检查 吲哚试验（INDOL, I） 原理： 含有色氨酸酶的细菌（如大肠杆菌、 变形杆菌等）可分解色氨酸生成吲哚， 若加入吲哚试剂（二甲基氨基苯甲醛） ，与吲哚结合，形成玫瑰吲哚，呈红色 ，称吲哚试验阳性 非无菌产品微生物限度检查 大肠杆菌 产气肠杆菌 - 非无菌产品微生物限度检查 甲基红试验（METHYL RED TEST） 原理 ： 某些细菌在糖代谢过程中，将培养 基中的糖先分解为丙酮酸，再将其分解 为甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH下 降，可使甲基红指示剂由桔黄色变为红 色，即甲基红阳性反应 * 甲基红pH5.3以上为黄色；pH4以下为 红色 非无菌产品微生物限度检查 如：大肠杆菌为阳性反应 产气肠杆菌为阴性反应 非无菌产品微生物限度检查 V-P试验（VOGES-PROSKAUER TEST ） 原理 葡萄糖丙酮酸 乙酰 甲基 甲醇 二乙酰 胍缩 二乙 酰 碱 性 条 件 + 胍 基 （红色） 氧化 V-P试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖 产生非酸性或中性产物的能力，如丙酮酸 非无菌产品微生物限度检查 如：产气肠杆菌 + 大肠杆菌 - 非无菌产品微生物限度检查 枸橼酸盐利用试验 （CITRATE UTILIZATION） 原理 能利用枸橼酸盐作为唯一碳源的细 菌如产气杆菌，分解枸橼酸盐生成碳酸 盐，同时分解培养基的铵盐生成氨，由 此使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香 草酚蓝（BTB）由淡绿转为深蓝，此为 枸橼酸盐利用试验阳性 非无菌产品微生物限度检查 大肠杆菌 - 产气肠杆菌 + 非无菌产品微生物限度检查 吲哚（I） 甲基红（M） VP（Vi） 枸橼酸盐利用（C） I I MM V V i i C C 试试 验验 非无菌产品微生物限度检查 大肠杆菌产气杆菌 2.3.3沙门菌 含药材原粉化学药和中药制剂及脏器提取物的口服制剂【10 版：含动物组织及动物类原药材粉的口服制剂】每10g或 10ml不得检出沙门菌 供试液制备和增菌培养 取10g 或10mL 供试品直接或处理后接种至适宜体积（经方法 适用性试验确定的）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30 35培养1824 小时。 选择和分离培养 取上述预培养物0.1mL 接种至10mL RV 沙门增菌液体培养基 中，3035培养1824 小时。取少量RV 沙门菌增菌液体培 养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30 35培养1848 小时。 沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上生长良好，菌 落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针 挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿 刺接种，培养1824 小时，或采用其它适宜方法进一步鉴定。 非无菌产品微生物限度检查 2.3.3沙门菌 结果判断 若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌 落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为 黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行 适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌。如果平板上没 有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或 三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色； 或斜面黄色、底层未见黄色黑色，判供试品未检出沙 门菌 非无菌产品微生物限度检查 非无菌产品微生物限度检查 克氏双糖铁（KIA 、 TSI）试验 KIA琼脂中含有牛肉膏、酵母 浸膏、蛋白胨、乳糖、葡萄糖、枸 橼酸铵铁、酚磺酞指示剂等；乳糖 的浓度为葡萄糖的10倍 非无菌产品微生物限度检查 非无菌产品微生物限度检查 吲哚试验（INDOL, I） 原理： 含有色氨酸酶的细菌（如大肠杆菌、 变形杆菌等）可分解色氨酸生成吲哚， 若加入吲哚试剂（二甲基氨基苯甲醛） ，与吲哚结合，形成玫瑰吲哚，呈红色 ，称吲哚试验阳性 非无菌产品微生物限度检查 大肠杆菌 沙门菌 - 非无菌产品微生物限度检查 尿素酶试验 有些细菌能产生尿素酶，可分解尿 素生成氨和CO2，氨在水溶液中形成 碳酸铵，使培养基呈碱性。将待检菌 接种于尿素培养基中，培养后出现红 色为阳性，不变色为阴性，沙门菌- 非无菌产品微生物限度检查 挑取菌接种于氰化钾(KCN)培养基； 在361培养12d，观察结果 有细菌生长即为阳性(不抑制)，经2d 细菌不生长为阴性(抑制) 注：在作氰化钾试验时，应注意密封管口，夏 天分装培养基宜在冰浴中进行，防止氰化钾分解 ，产生氢氰酸逸出，致使培养基内氰化钾浓度降 低，不能抑制细菌生长 ，造成假阳性 氰化钾为剧毒品，操作时须谨慎，用后 培养基每管加数粒硫酸亚铁和20%氢氧化钾 0.5ml去毒，然后再灭菌、洗涤。 氰化钾试验 非无菌产品微生物限度检查 试验试验 相关培养基中含有赖赖氨酸和葡萄糖，酸 碱指示剂为剂为 溴甲酚紫（中性和碱性时时紫色，酸性 黄色），未用时为时为 紫色 如果待测细测细 菌将赖赖氨酸脱羧羧，则产则产 生胺，为为 碱性，溴甲酚紫保持紫色，如果不脱羧羧，肠肠杆菌 科的细细菌都能分解葡萄糖，产产酸，溴甲酚紫变为变为 黄色 氨基酸脱羧羧的对对照管是葡萄糖发发酵管，对对照 管变为变为 黄色，说说明细细菌接种成功，证实试验证实试验 管 紫色（不变变色）为为阳性，而非未接种好细细菌 由于氨基酸脱羧羧的产产物为为尸胺、腐胺等，遇氧不稳稳定 ，故各管接种完细细菌后，需加入几滴液体石蜡隔绝绝空气， 保持胺的稳稳定性 赖氨酸脱羧酶试验 非无菌产品微生物限度检查 动力试验 非无菌产品微生物限度检查 血清学凝集试验 方法：取一洁净载玻片，用接种环取待检菌培 养物，分别与诊断血清及生理盐水混匀，上下摇 动玻片数次，l-3min后观察结果 结果判断：阳性一待检菌明显凝集，对照菌均 匀混浊；阴性一待检菌及对照菌均匀混浊；自凝 一测定菌、对照菌均凝集 2.3.4铜绿假单胞菌 供试液制备和增菌培养 取供试品，按“非无菌产品微生物限度检查：微生物 计数法” （通则1105）制成1：10 供试液；取相当于 1g 或1mL 供试品的供试液，接种至适宜体积（经方 法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨液体培养基中， 混匀；3035培养1824 小时 选择和分离培养 取上述预培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂 培养基平板上，3035培养1872 小时 取上述平板上生长的菌落进行氧化酶试验，或采用其 它适宜方法进一步鉴定 氧化酶试验 将洁净滤纸片置于平皿内,用无菌玻棒取上述平板上 生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配制的1二盐酸 二甲基对苯二胺试液，在30 秒内若培养物呈粉红色 并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性,否则为阴性 非无菌产品微生物限度检查 2.3.4铜绿假单胞菌 结果判断 若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有 菌落生长，且氧化酶试验阳性，应进一步进 行适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞 菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落 生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验阴性 ，判供试品未检出铜绿假单胞菌 非无菌产品微生物限度检查 非无菌产品微生物限度检查 氧化酶试验 有些细菌具有氧化酶（细胞色素氧化 酶），能将二甲基对苯二胺或四甲基对苯 二胺氧化生成红色的醌类化合物 阳性：紫红色 阴性：无色 2.3.5金黄色葡萄球菌 供试液制备和增菌培养 取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查 ：微生物计数法” （通则1105）制成1：10 供试液；取相当于1g 或1mL供试品的供试 液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确 定的）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀； 3035培养1824 小时 选择和分离培养 取上述预培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼 脂培养基平板上，3035培养1872 小 时 非无菌产品微生物限度检查 结果判断 若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌 落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行 分离、纯化及适宜的鉴定试验, 确证是否为 金黄色葡萄球菌 若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的 菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但 鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡 萄球菌 非无菌产品微生物限度检查 2.3.5金黄色葡萄球菌 非无菌产品微生物限度检查 血浆凝固酶试验 血浆凝固酶是多数致病菌株能产生凝 固酶，能使含有肝素等抗凝剂的人或兔血 浆发生凝固的酶类物质,致病株大多数能 产生,是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要 指标 非无菌产品微生物限度检查 【方法】 （1）玻片法：在1张洁净玻片中央加1滴9gL氯化钠(生理盐水)溶液，用接种环 取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照） 制成菌悬液，若经1020s 内无 自凝现象发生，则加入兔新鲜血浆1环，与菌悬液混合，观察结果 （2）试管法：用生理盐水将新鲜兔血浆4倍稀释，取0.5ml于试管再加0.5ml待测 菌浓菌悬液（需做阳性对照及阴性对照），混匀后置37水浴中，每30min观 察1次结果；若3小时内试验管和阳性对照管出现凝固，阴性对照管（即浓菌液 管）不凝固，为阳性；若阴性，继续观察到24小时，不凝固者为阴性 【结果判断】 （1）玻片法：510s内出现凝集者为阳性 （2）试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳性。4h后无上述现象出现，则放置 过夜后再观察 非无菌产品微生物限度检查 甘露醇发酵试验 【操作】观察接种的甘露醇发酵生化管的 颜色变化，致病性葡萄球菌多含有分解甘 露醇的酶类，能发酵甘露醇产酸，培养基 由紫色变为