单克隆抗体概述

单克隆抗体药物 高熹 168615140001 单克隆抗体药物作为一种具有独特优势 的生物靶向药物，具有特异性高、靶向性强 和毒副作用低的特点，在治疗方面效果显 著。伴随着抗体技术的不断发展以及新型抗 体的不断出现，单克隆抗体药物已成为制药 业发展最快的领域之一，目前正在研究的生 物技术药物中有四分之一都是单克隆抗体药 物，期间又涌现出了各种单抗衍生物，包括 抗体药物偶联物、小分子抗体、双特异性抗 体等。 1986年，FDA批准了第一个鼠源单克隆抗体药物Muromonab-CD3 上市，用于预防肾移植时急性器官排斥。 单克隆抗体药物的发展因人抗鼠抗体反应在1988年到1993年间陷 入低谷。 1997-2007年是全球单抗产业增长的爆发期，十年间CAGR高达 58.6%。 2008年-2015年，全球单抗产业增速放缓明显，CAGR降至14.8%， 但仍要显著高于全球医药行业约5%的增速水平。 根据预测，2016-2020 年，全球单抗产业仍将以9.84%的RAGR快速 发展（同期全球药品市场CAGR约为 5%），2020年市场规模有望 突破1300亿美元。 发展状况 1997年全球单抗药物销售额仅3.7亿美元，2015年全球单抗药物的 销售额已超过980亿美元。1992-2015 年间，国外共批准上市了61 个原研抗体药，其中后有6个退市。 2015年全球最畅销药物TOP 10中有5个单抗，分别是阿达木单 抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、贝伐珠单抗和曲妥珠单抗，它 们占据了单抗药物的半壁江山，销售额约为426.6亿美元，约占 2015年全球单克隆抗体药物总销售额的44%。 根据预测，2016-2020 年，全球单抗产业仍将以9.84%的RAGR快 速发展（同期全球药品市场CAGR约为 5%），2020年市场规模有 望突破1300亿美元。 单克隆抗体药物市场 相比处于上升期的国外单抗产业，我国单抗产业仍处于初创期，单 抗药物仍以仿制为主，单抗药物无论产品种类和销售规模都远低于 欧美发达国家，并且进口单抗药物占据了主要市场。2015年中国单 抗药物市场容量约为70多亿元人民币，约80%的市场被外资制药企 业占据。在单抗药物领域，国内制药企业面临市场快速增长和进口 替代的双重机遇。单克隆抗体研究已被列入863计划和国家重点攻 关项目。十三五期间，生物产业将是国家重点支持的战略性新兴产 业。单抗药物的研究、开发和市场应用必将吸引一大批制药企业的 参与和布局。 目前全国有100多家企业在做单抗，除了中信国健、百泰生物、海正 药业等一些老牌企业之外，近几年还涌现出了很多新兴企业，包括 丽珠单抗、信达生物等。 在2016三生制药集团媒体开放日活动上，三生制药集团董事长娄竞 博士表示三生制药集团的3万升生产线建成后将成为中国规模最大的 单克隆抗体生产线，也是从细胞系、培养基、原液到制剂（多种剂 型和规格）的全球最完整生产线之一。 我国情况 鼠源化单克隆抗体 人鼠嵌和单克隆抗体 人源化单克隆抗体 全人源花单克隆抗体 单克隆抗体药物分类 人用鼠源单抗的生产方法一般分为体内法和体外法2种。 体内法 体内法即腹水法。尽管腹水中抗体浓度比较高(2-10mg/ml),但由于所用 的BALB/c小鼠必须达到SPF级,繁殖、饲养BALB/c小鼠及生产腹水、纯化 抗体的厂房必须符合GMP要求,WHO及我国对体内法生产的人用鼠源单 克隆抗体的质检项目繁多,要求严格,因此限制了体内法在人用鼠源单抗 生产领域的应用。 体外法 体外法(杂交瘤细胞体外培养法)的产品纯度高,可以避免鼠类病毒的污 染,简化质检项目,操作具有可控制性,适用于大规模工业生产,因此是人用 鼠源单抗生产方式的主要发展方向。体外法的制备流程也基本相同，即 从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠获取脾细胞，选育出非分泌免疫球 蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞，待细胞融合后，对单个细胞进行克隆，体外 培养出能分泌单抗的克隆细胞。 鼠源化单克隆抗体 嵌合抗体可将同一个可变区与不同类别的恒定区 链接在一起，比较在相同特异性情况下不同类别的功 能。其制备过程主要包括了可变区的克隆，表达载体 的构建及嵌合抗体的表达。可变区基因的克隆在早期 主要从杂交瘤细胞的基因组文库中克隆出来带有完整 上游转录调控序列的轻重链可变基因DNA片段，组装 到含有人恒定区的表达载体中。 人鼠嵌和单克隆抗体 嵌合免疫球蛋白G 嵌合Fab和嵌合 F（ab）2 嵌合抗体三种应用形式 完全CDR移植抗体 部分CDR移植抗体 特异决定区移植抗体 人源化单克隆抗体 完全CDR移植抗体由于鼠源性抗体VR中的骨架区仍残留一 定的免疫原性，为最大限度的减少鼠源成分，用人FR替代鼠 FR可形成更为完全的人源化抗体，即在此抗体中除了个CDR 是鼠源以外，其余全部是人源结构，这一类型的抗体称为CDR 移植抗体或改型抗体。应用这一策略，将鼠源McAb的CDR区 完全移植，得到了抗磷脂酰肌醇（蛋白）聚糖嵌合抗体。但随 后多项研究发现，简单的CDR移植往往明显降低抗原抗体反 应的亲和力，甚至丧失与抗原结合的能力。其原因在于FR不 仅作为骨架对CDR起到支持作用，FR中的某些非CDR区补充调 控残基还为CDR的回折构象提供必要的支持，其形状和侧链大 小协同决定CDR的基本结构，影响CDR与抗原结合的特异性和 亲和力. 完全CDR移植抗体 在简单CDR移植的基础上又相继发展了部分CDR移植技 术。研究发现轻链的 CDR1、CDR2和重链的CDR3对保证抗体与 抗原特异性结合至关重要，其余三个CDR的作用则较低。因此 只将抗体结合抗原必须的CDR移植到人抗体的FR骨架上即能获 得对人免疫原性更小的嵌合抗体，这类抗体称为部分CDR移植 抗体。 部分CDR移植抗体 正如并非所有的CDR在抗原抗体反应中具有同样的重要作 用，X射线晶体衍射实验提示具体到一个CDR中,不是所有的 蛋白分子都参与抗原的特异性识别。执行抗原识别的CDR 中的一些特定区域称为SDR。由此又产生了SDR移植抗体。 该抗体是将McAb中与抗原结合密切相关的SDR等少数残基 移植到人抗体的相关部位，从而进一步提高抗体的人源化 水平。根据目前的研究，抗体轻链的SDR多位于27d、34、 50、55、89、96位残基，而重链的SDR多位于31、35b、50 、58、95、101位残基. 特异决定区移植抗体 由于免疫原性的存在，人们一直在努力制备全人源化的单 克隆抗体，目前主要有抗体库技术和人源性抗体转基因小 鼠技术两种。 抗体库技术：噬菌体抗体库技术 核糖体展示技术 人源性抗体转基因小鼠技术：HuMAb-Mouse、HuMAb- Mouse、VelocImmuneTM 全人源单克隆抗体 噬菌体抗体库技术：从免疫或未被免疫的B细胞中分离抗体可变区基因 ;PCR 扩增抗体全套基因片段(如VH、VL)，将体外扩增的VH、VL基因片 段随机克隆入相应载体,形成组合文库;将基因组合文库插入噬菌体编码 膜蛋白的基因(g3) 或基因(g8) 的先导系列的紧靠下游，使外源基因 表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋白gp或gp的N端。用固 相化抗原经“亲和结合洗脱扩增”数个循环直接、方便、简捷、高 效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。 核糖体展示技术：将基因型和表型联系在一起，编码蛋白的DNA在体外 进行转录与翻译，由于对DNA进行了特殊的加工与修饰，如去掉3末 端终止密码子，核糖体翻译到mRNA末端时，由于缺乏终止密码子，停 留在mRNA 的3末端不脱离，从而形成蛋白质-核糖-2mRNA三聚体， 将目标蛋白特异性的配基固相化，如：固定在ELISA 微孔或磁珠表面， 含有目标蛋白的核糖体三聚体就可在ELISA 板孔中或磁珠上被筛选出， 对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的mRNA 进行逆转录酶链聚 合反应(RT-PCR)，PCR产物进入下一轮循环，经过多次循环，最终可使 目标蛋白和其编码的基因序列得到富集和分离。 抗体库技术 HuMAb-Mouse：HUMab转基因小鼠整合入人抗体基因450kb(200kb Ig H；230kb Igk，约占人类Ig G的50)，免疫该小鼠可以产生0.1-5nmol L的抗体。虽然该小鼠转入的人抗体基因组还是比较小，但仍获得巨 大成功。 Xcno Mouse: Xeno Mouse转基因小鼠也是目前最为成功、应用最广的转 基因小鼠之一。该转基因小鼠整合入大部分人抗体VH和V基因，大小 分别为1020kb和800kb。重链包含34个V区基因、所有的重链D区和J区 ，以及C2、C和C基因，共66个功能基因；轻链包含18个V区基因、 所有的5个J区和 C基因，共32个功能基因。该转基因小鼠XMG2-KL可以 产生全人IgM和IgG2，亲和力可以达0.11nmolL。 VelocImmuneTM：不同于以往的转基因小鼠抗体筛选平台， VelocImmuneTM产生人可变区与鼠恒定区组成的反向嵌合抗体。小鼠Ig H恒定区通过B细胞胞质区的信号转导区域(如Ig与Ig)传递天然的免疫 信号，并通过与其他类型免疫细胞上的Fc受体的结合促使小鼠产生强大 的免疫反应，并提供半衰期长且亲和力高的抗体。该类转基因小鼠免 疫后产生的抗体可变区编码序列通过基因克隆技术与人源恒定区编码 序列进行构建，反向嵌合抗体即可转变为适宜药用的全人源抗体。 人源性抗体转基因小鼠技术 为了更好地发挥抗体药物的治疗效果，人们构 建各种形式的工程抗体来改善它们的特性和效能。 例如，制备抗体和药物的偶联物，增加对靶细胞的 杀伤；改变抗体分子大小，构建小分子抗体，使之 有较好的肿瘤/血液比；制备双特异性抗体，同时结 合两个不同的抗原表位；增加抗体的亲和力；改进 抗体ADCC或CDC效应；改变抗体的药代动力学，使 半衰期延长。 单抗衍生物 抗体药物偶联物(ADC)是通过一个化学链接将具有生物活性的 小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到 目标细胞中。 基本思路 1、选择合适的抗体 2、选择合适的药物 3、选择合适的链接方式。 抗体偶联药物 小分子抗体具有分子量小、穿透性强、抗原性低、可在原核 系统表达及易于基因工程操作等优点。 Fab抗体 单链抗体 单域抗体 双特异性抗体 小分子抗体 Fab抗体由一条完整的轻链和重链Fd段通过一个链间 二硫键连接组成一个异二聚体，大小为完整抗体的 三分之一，但其仍保持了亲本抗体的fv段结构和与 抗原结合的特异性与活性的能力。并且分子结构比 较稳定具有穿透力强、免疫原性低，可与多种药物 及放射性同位素偶联，可与多种毒素和酶结合，用 作药物的导向治疗载体和显影等特点。 Fab抗体 在DNA水平上用一段 适当的寡聚核苷酸作为连接肽 （linker）将VH和VL连在一起，使之表达成为一条单 一肽链，即为单链抗体（ScFv）。单链抗体大小仅 为全抗体的六分之一，抗原性低，是具有完整抗原 结合部位的最小片段, 但有时构建的ScFv其亲和力明 显低于亲本抗体，并常有聚集的倾向。 单链抗体 由抗体轻、重链可变区基因（VH、VL）间通过一段 连接肽基因拼接后表达形成的重组蛋白，大小为全 抗体的六分之一，抗原性低，是具有完整抗原结合 部位的最小片段。其分子量更小，具有一定的可溶 性和稳定性特点，相较于其它的抗体分子，单域抗 体更容易进入细胞。 单域抗体 双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工 抗体，一个位点可与靶细胞表面抗原结合，另一个 位点则可与载荷物如毒素、酶、细胞因子、放射毒 素等耦合，能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架 起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，其靶向性的 特点可以减少载荷物的毒副作用。 双特异性抗体 随着单克隆抗体的完善与推广，单克隆抗体在农业、食 品、治疗疾病等方面的应用越来越广泛，并取得了良好的效 果。 农业 食品 医学 单克隆抗体的应用 于单克隆抗体的高特异性和高灵敏性，单克隆抗体农业和食品的 应用主要集中在了检测方面。在食品中对动物性食品中兴奋剂、 抗生素和激素等的检测，植物性食品中农药残留物的检测，还可 以检测储存食品中的微生物含量。在农业中，单克隆抗体可以对 牲畜的细菌、病毒和寄生虫的患病情况进行筛选。在植物中，除 了对病虫害的诊断应用以外，单克隆抗体还在药用植物活性成分 定性定量分析、成分分离、培植育种中得到了广泛的应用。 农业及食品 肿瘤 器官移植 自身免疫病 抗感染 医学 据Pharmaprojects V5数据库统计，目前上市与临床在研的约 500种抗体药物中，约有50%用于肿瘤治疗，临床在研的抗肿瘤抗 体药物共约20多种，针对70多个靶点。 目前，销量排名前五的抗体类药物，其中有三个都是用于治 疗肿瘤，其中贝伐珠单抗用于治疗转移性癌症，曲妥珠单抗通过 附着在Her2上来阻止人体表皮生长因子在Her2上的附着，从而阻 断癌细胞的生长，利妥昔适用于复发或耐药的滤泡性中央型淋巴 瘤的治疗。 近年来，利用单克隆抗体靶向治疗肿瘤已经成为全球靶向 治疗药物的主流，免疫检验点靶向抗体药物的研发更是极大地推 动肿瘤免疫治疗，是目前肿瘤治疗的最热点所在。同时抗体治疗 联合其他治疗策略也成为了必然的发展趋势，联用型治疗适用性 更广，临床效果更持久，不良反应更少，病灶去除更彻底，有效 防止肿瘤的复发，显著提高了存活率。 肿瘤 移植排斥是器官移植失败的重要因素之一，而单克隆抗体可 以有效地改善移植排斥反应，其应用也在不断增长，目前的 研究和应用主要集中于清除不同种类的白细胞分化抗（CD） ，例如采用抗CD154单克隆抗体阻断免疫细胞活化信号传导 途径,主要应用于胰腺、心脏、皮肤等多个器官的移植，证明 抗CD154单抗能有效地抑制移植排斥反应，延长移植物的存 活时间。 器官移植 自身免疫性疾病的治疗通常采用的糖皮质激素、免疫抑制剂等, 虽然有一定疗效,但长期使用都会产生严重的不良反应,而且都只 能减缓病情的发展,并不能根治疾病。 三种机制： （1）封闭细胞因子和生长因子的单克隆抗体药物，其中最成功 的便是TNF抑制剂 （2）受体阻滞和受体调节的单克隆抗体药物 （3）耗竭异常免疫细胞及介导细胞信号的单克隆抗体药物，通 过结合细胞表面抗原 自身免疫病 细菌和病毒等病原体感染机体的机制复杂,由于单克隆抗体只 能识别单一抗原表位,限制了抗体药物的抗感染效果。抗感染 领域的抗体药物发展缓慢，目前仅有抗呼吸道合胞病毒的帕 利珠单抗以及抗炭疽杆菌的瑞西巴库单抗两个品种上市。 目前抗感染的单克隆抗体的研究热点集中于埃博拉病毒抗 体、抗呼吸道合胞病毒抗体、抗炭疽杆菌抗体等， 2014年西 非大规模埃博拉病毒疫情爆发后，实验性抗体药物ZMapp第 一个被用于临床治疗，中国研制的抗体药物 MIL77也成功用 于治疗，抗体药物再次显示了在抗感染领域的应用前景。 抗感染 单克隆抗体导致的不良发应主要有皮肤及附件损害、全身反 应、心血管损害等，具体表现为皮疹、瘙痒、寒战、发热、心 慌、心跳加快等，严重可导致急性呼吸衰竭、多器官功能衰 竭、严重出血、脑梗死、过敏性休克等。 单克隆抗体可能存在问题 （1）所用mAb的异源性,特别是当给予mAb而无相关 的免疫抑制剂时。 （2）生理功能的抑制以及mAb的特异性。 （3）mAb与靶点结合后炎症细胞或介导物的活性。 致不良