免疫组织化学技术课件

1 第十二章 免疫组织化学技术 2 免疫组织化学技术的概念 在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组 织化学的呈色反应，借助可见的标记物 ，对相应抗原进行定性、定位和定量检 测。 3 免疫组织化学技术的类型 1.酶免疫组织化学技术 2.荧光免疫组织化学技术 3.免疫电镜技术 4.亲和免疫组织化学技术 4 免疫组化技术要点 标本的制作 抗体的选择 温育 改善标本的透过性 设立对照试验 免疫组化的结果判断 5 标本的制作 标本的类型 1.组织切片：冷冻切片；石蜡切片 2.印片 3.涂片 标本的固定 标本的保存 酶消化处理 6 设立对照试验 阳性对照 阴性对照：空白对照、替代试验、 吸收试验 7 酶免疫组织化学技术的概念 用酶标记已知抗体（抗原）与组织或细 胞标本在一定条件下反应，如果组织或 细胞中含有相应抗原（抗体），抗原抗 体结合形成复合物，复合物中的酶催化 底物显色，对抗原（抗体）进行定性、 定位和定量。 8 酶免疫组化技术的类型 1.酶标记抗体免疫组化染色法 2.非标记抗体免疫酶组化染色法 9 酶标记抗体免疫组化染色法 直接染色法 间接染色法 10 直接染色法原理 用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反 应，形成酶标抗体-抗原复合物，最后加 底物显色，形成有色产物沉积在抗原抗 体反应部位，对组织或细胞抗原定位、 定性和定量。 11 直接染色法技术要点 （1）用0.3% H2O2和80%甲醇室温处理标本 2030min，洗涤。 （2）用正常血清或BSA溶液处理标本。 （3）加酶标抗体，温育，使形成Ag-AbE 复合物，洗涤。 （4）加底物，光镜下观察显色结果。 12 直接染色法方法评价 直接染色法简便、快速、特异性强，非特异性 背景反应低，结果可靠，可精确定位抗原，切 片保存时间较长。常用于检测肾组织活检标本 中的免疫球蛋白、补体等免疫复合物成分。 缺点是不同抗原需分别制备相应的酶标抗体进 行检测，比较麻烦，且敏感性不及间接染色法 。 13 间接染色法原理 间接染色法先用未标记的已知抗体与标 本中的相应抗原反应，形成复合物，再 用酶标抗抗体与之反应，形成抗原-抗体 -酶标抗抗体复合物，通过底物显色，根 据底物显色反应对抗原定位、定性和定 量。 14 间接染色法技术要点 （1）和（2）同直接法。 （3）加稀释的Ab1，温育，使形成Ag-Ab1 复合物，洗涤。 （4）加稀释的酶标Ab2，温育，使形成Ag- Ab1-Ab2E复合物，洗涤。 （5）加底物，光镜下观察显色结果。 15 间接染色法方法评价 间接染色法使用一种酶标抗抗体即可与 多种特异性抗体匹配，可检查多种抗原 ，实用性和敏感性均强于直接染色法， 现已广泛应用于检测组织细胞中的病毒 、细菌、寄生虫和某些肿瘤抗原等。间 接染色法的缺点是敏感性低于酶桥染色 法和PAP法。 16 非标记抗体免疫酶组化染色法 酶桥法 PAP法 双桥PAP法 APAAP法 17 酶桥法原理 利用抗原和特异性抗体（第一抗体）形 成免疫反应系统，用抗抗体（第二抗体 ，又称桥抗体）将抗酶抗体结合在与组 织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合 在抗酶抗体上，经显色对抗原定位、定 性和定量 。 18 酶桥法原理 19 酶桥法技术要点 （1）、（2）和（3）同间接法。 （4）加Ab2，温育，使形成Ag-Ab1-Ab2复合物， 洗涤。 （5）加抗酶抗体，温育，使形成Ag-Ab1-Ab2- Ab(E)复合物，洗涤。 （6）加酶反应液，温育，与Ab(E)反应，洗涤。 （7）加底物，光镜下观察显色结果。 20 酶桥法方法评价 该方法未经化学交联，故避免了抗体和 酶活性的降低，并省去酶标记 抗体需纯 化的繁琐过 程。 21 PAP法的原理 抗过氧化物酶抗体（第三抗体）与过氧 化物酶结合，形成过氧化物酶-抗过氧化 物酶抗体（PAP）复合物，用此复合物代 替酶桥法中的抗酶抗体和酶，把酶桥法 的两步变成一步，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP 复合物，最后通过PAP复合物中的HRP催 化底物显色。 22 PAP法的原理 23 PAP法技术要点 （1）、（2）、（3）和（4）同间接法 。 （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag- Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. （6）加底物，光镜下观察显色结果。 24 PAP法的方法评价 PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性 的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程 。PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子 组成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色 冲洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球 蛋白，不易产生非特异性染色，因而特异性、 敏感性和重复性良好，比直接染色法、间接染 色法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备 过程较复杂。 25 双桥PAP法原理 该法是PAP法的改良法，通过两次连接 桥抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结 合比PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1- Ab2-PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过 PAP复合物中的HRP催化底物显色。 26 双桥PAP法技术要点 （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。 （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2- PAP-Ab2复合物，洗涤。 （7）加PAP，温育，形成Ag-Ab1-Ab2- PAP-Ab2-PAP复合物，洗涤。 （8）加底物（DAB-H2O2），光镜下观 察显色结果。 27 APAAP法 APAAP法与PAP法相似，不同之处是用 碱性磷酸酶（AP）代替HRP。骨髓等造 血组织含有大量类过氧化物酶，染色时 不宜使用HRP结合物，AP可避免上述缺 点，但制备高纯度的AP和APAAP复合物 过程较复杂，且价格较贵。 28 参考文献 Ivan M Roitt.Immunology(6th edition). Harcourt Publoshers imited,2001. 龚非力.医学免疫学.北京：科学出版社，2003. 吕世静.临床免疫学检验.北京：中国医药科技出版社 ，2004. 吕世静.免疫学检验（第2版）.北京：中国医药科技出 版社，2003. 孙汶生 王福庆.医学免疫学.北京：科学出版社， 2004. 吴健民.免疫学检验-理论与临床.北京：人民卫生出版 社，2003. 29 免疫网站 Immunology /imm/ Medweb:Immunology /medweb/medweb.