矿产资源微生物技术3微生物技术基本实验

资源微生物技术 第三章 微生物技术基本试验 第三章 微生物技术基本试验 一、培养基的配制 二、灭菌方法 三、接种方法 四、细菌总数目的显微镜计数方法 五、细菌的生长曲线 六、菌体的红外光谱测定样品制备方法 七、菌体的扫描电镜样品制备方法 八、菌体表面Zeta电位的测试方法 一、培养基的配制 1、氧化亚铁硫杆菌，一般都用西尔弗门(Silverman) 培养基进行培养，这种培养基的配方为： 溶液I：3.0 g (NH4)2SO4 0.1 g KCl 0.5 g K2HPO4 0.5 g MgSO47H2O 0.01 g Ca(NO3)2 700 ml 蒸馏水 西尔弗门(Silverman)培养基配制方法 溶液II： 44.2 g FeSO47H2O 300 ml 蒸馏水， 1 ml 5mol/L 硫酸溶液。 溶液I在0.1 MPa下灭菌，溶液在0.05 MPa下灭菌，在使用前把两种已灭过菌的 溶液混合。因这种培养基中Fe2+的含量为 9 g/L，所以又称为9K培养基。 利瑟恩(Leathen)培养基 纯种的T.f菌： 溶液I： 0.15 g/L (NH4)2SO4, 0.05 g/L KCl, 0.10 g/L KH2PO4, 0.50 g/L MgSO4.7H2O, 0.01 g/L Ca(NO3)2.4H2O 1L H2O 0.1 MPa下灭菌30min 溶液II ： 10mL 10 Fe2SO4.7H2O, pH3.5 0.05 MPa下灭菌30min 在使用前把两种已灭过菌的溶液混合，pH调至3.5。 2号培养基的配制方法 2、草分枝杆菌与诺卡氏菌的培养基为2号培养基 ，其培养基组成为： Beef grease 牛肉膏 3 g， Peptone 蛋白胨 10 g， Sodium chloride 氯化钠 5 g， Distilled water 蒸馏水 1 L， （ Agar 琼脂1520 g ） pH=7.0-7.2。 液体培养基的配制 放入灭菌 锅前的液 体培养基 所配制的培养基是 液态的，其中的成分基 本上溶于水，没有明显 的固形物，液体培养基 营养成分分布均匀，易 于控制微生物的生长代 谢状态。 固体培养基的配制 固体培养基 灭菌后摆斜面 在液体培养基中加入适量 的凝固剂（1.5-3）即成 固体培养基。常用作凝固剂的 物质有琼脂、明胶、硅胶等， 以琼脂最为常用。固体培养基 在实际中用得十分广泛。 在实验室中，它被用作微 生物的分离、鉴定、检验杂菌 、计数、保藏、生物测定等。 把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成 了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.2 0.5%之间。 这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有 时用来保藏菌种。 半固体培养基的配制 培养基的配制 水：配制培养基应使用蒸馏水或相同质量的水，目的 是排除抑制或影响微生物生长的物质。 称量和复水：称量所需的脱水培养基（注意缓慢操作 ，必要时佩戴口罩或在通风橱中操作，以防吸入含有 毒物质的培养基粉末），先加入少量的水，充分混合 （注意避免培养基结块），然后再加水至所需的量。 溶解和分装：脱水培养基加水后适当加热，并不停搅 拌使其快速溶解，必要时，重新溶解。含琼脂的培养 基在加热前应先浸泡几分钟。由多种成分制备的培养 基应将不同成分分别加入适量的水中，并充分溶解， 然后再加水至所需的量。 培养基的配制 pH的测定和调整：用酸度计测pH，必要时进行调整。 一般使用浓度为1mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液进行 培养基pH的调整。值得注意的是，商品化的培养基在 高压灭菌前后的pH可能变化很大，但使用质量好的蒸 馏水或去离子水配制时，灭菌前并不需要调节pH。 分装：将配制好的培养基分装到适当的容器中，应按 使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内 ，分装量不得超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫 有防湿纸的棉塞封堵，制作的棉塞应紧贴管壁，不留 缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或 过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的 2/3在试管内，1/3在试管外。 二、灭菌方法 干热灭菌法 火焰灭菌法 干燥加热空气灭菌法 高温灭菌 巴氏消毒法 常压下 煮沸消毒法 湿热灭菌法 间歇灭菌法 常规加压灭菌法 加压下 (高压蒸汽灭菌法) 连续加压灭菌法 二、灭菌方法 干热灭菌法 1.焚烧：是一种彻底的灭菌方法，但 仅适用于废弃物品或尸体等。 2.烧灼：直接用火焰灭菌，适用于微 生物学实验室的接种环、试管口等 的灭菌。 3.干烤：鼓风干燥箱灭菌。一般加热 至160170经2小时。适用于 高温下不变质、不蒸发的物品， 如玻璃器皿、瓷器等。 二、灭菌方法 湿热灭菌法 1.煮沸法：1个大气压下，煮沸的水温为100，一般 细菌繁殖体煮沸510分钟即被杀死。细菌芽胞常需煮 沸1小时，才被杀死。水中加入2%碳酸钠，可提高 沸点达105，促进细菌芽胞的杀灭。 2.巴氏消毒法：用较低温度杀灭液体中的病原菌、同 时又不影响消毒物品的营养成分及香味的消毒方法。 加热61.162.8半小时即可，常用于牛奶和酒类等 的消毒。 二、灭菌方法 湿热灭菌法 3. 间歇灭菌法：将待灭菌的物品100加热1530分 钟，杀死其中的细菌繁殖体，然后将物品置于37温 箱中过夜使芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸汽 加热，如此连续三次，可将所有细菌繁殖体和芽胞全 部杀死。针对牛奶、糖等在100以上有效成分易被破 坏的产品进行灭菌。 4.高压蒸汽灭菌法：是灭菌效果最好、目前应用最广 的灭菌方法。方法是在一密闭蒸锅高压蒸汽灭菌器 内进行的。通常采用纯饱和蒸汽压为121.5kPa，温度 达125,维持2030分钟，可杀死包括细菌芽胞在内 的所有微生物。适用于各种耐热、体积大的培养基的 灭菌，也适用于玻璃器皿、工作服、耐高温塑料用品 等物品的灭菌。 二、灭菌方法 湿热灭菌法 二、灭菌方法 高压蒸汽灭菌法： 1、用途 （1）无菌水的制备 （2）玻璃器皿的灭菌 （滴管、移液管、锥形瓶、烧杯） （3）培养基的灭菌 2、121.5 kPa 下灭菌 2030分钟。 试管或锥形瓶口的密封方法 不正确的棉塞试管帽 正确的棉塞 棉塞的叠法 棉塞的叠法 高压蒸汽灭菌锅 电加热圈 水位线 压力表安全阀 放气阀 灭菌器 高压蒸汽灭菌锅使用注意事项 首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使 水面与三角搁架相平为宜。 放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以 免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均 不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。 加盖，打开放气阀。再以两两对称的方式同时旋紧相对的 两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。 灭菌所需时间到后，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表 的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出 灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内 压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而 冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。 高压蒸汽灭菌步骤 开始加热时， 打开放气阀； 加热至放气阀冒出蒸汽； 5分钟后，关上放气阀； 开始计时，灭菌30分钟； 关上电源开关，自然冷却； 至压力表指针为零，打开放气阀； 打开锅盖6个密封旋钮。 微孔滤膜过滤法 滤膜孔径0.22m 步骤： 1、接种前将无菌操作台、接种环、培养基紫外线灭菌30分钟 （摆好了斜面的试管装固体培养基、表面皿装的固体培养基、锥形瓶 装的液体培养基） 三、接种方法 接种环 无 菌 操 作 台 2、点燃酒精灯； 3、将接种环的钨丝在酒精灯火焰上加热变红（灭菌）， 4、用接种环在菌种保存试管中轻轻刮少许细菌， 5、快速将带有细菌的接种环浸入液体培养基中； 或在固体培养基中画“之”字形或“井”字形。见下图 三、接种方法 倾注平板菌落培养 接种和分离工具 1 .接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 挑菌落工具 移接斜面时常用的接种方法 ： 划线接种 点接种 穿刺接种 涂布接种 液体接种 注射接种 斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞 四、细菌总数目的显微镜计数方法 特制的载玻片正面图 特制的载玻片侧面图 步骤： 1、将细菌悬液 用蒸馏水稀释A 倍； 2、将配好的细 菌稀释液滴入在 玻片上； 3、盖好盖玻片 。 四、细菌总数目的显微镜计数方法 n1 四、细菌总数目的显微镜计数方法 n2 四、细菌总数目的显微镜计数方法 n3 四、细菌总数目的显微镜计数方法 n4 四、细菌总数目的显微镜计数方法 N1=(n1+n2+n3+n4)/4 N2 N3 N4 N5 载玻片上刻有的大方 格的尺寸： 边长1.0 mm, 盖上盖 玻片，则其间高度为 0.1 mm。 因此，每个大方格的 体积为0.1 立方毫米 。 四、细菌总数目的显微镜计数方法 计算步骤 1、 n （n1 + n2 + n3 + n4 ）4 2、 N1 16n 3、 N （N1 N2 N3 N4 N5）5 4、 一个大方格（0.1立方毫米）中细菌的总数 N25 5、 1 mL 1 立方厘米 1000 立方毫米； 细菌液稀释了A倍。 6、 1 mL 溶液中总的细菌数为(个) 100025NA0.1 原理： 平板菌落计数是将待测 样品经适当稀释后，其中的 微生物充分分散成单个细胞 ，去一定量的稀释样液接种 到平板上，经过培养，一个 菌落就可以看成是由一个细 胞繁殖而成的。 平板菌落计数 操作步骤： 无菌平皿编号制备菌悬液 倾注平板 培养(48h) 计数 注意事项： 倒平板时要注意控制培养基的温度。 稀释操作时，要尽量减少样品稀释误差，而且每个稀 释度的菌液应各用一支无菌吸管。 为使菌落能在平板上均匀分布，样品液加入平皿后， 应尽快倾注培养基并旋转混匀。 五、细菌的生长曲线 在HZQ-C空气浴震荡器中、在28C、160 r/min的震 荡频率下培养细菌； 每隔24 h取出100 mL菌悬浮液，采用转速为16000 r/min TGL16台式高速离心机离心分离10 min后测 细菌的湿重。 然后绘制细菌生长时间（h）与细菌生长量（每100 mL菌液中菌体湿重量）曲线。 空气浴震荡器 草分枝杆菌的生长曲线 六、菌体的红外光谱测定样品制备方法 操作步骤： 1、离心分离菌体； 2、用蒸馏水洗涤； 3、在50 C的恒温烘箱中干燥； 4、取干燥的菌体与光谱纯溴化钾一起在玛瑙研体中研磨； 5、将适量的粉末放入压片机中，进行压片； 6、用红外光谱仪（510P FTIR型）对样品进行分析测定。 *溴化钾在红外区无吸收* 红外光谱的基本概念 * 红外光谱是一种吸收光谱。在4000400 cm1的红外 线照射下，有机物分子选择性地吸收其中某些频率后，用 红外光谱仪记录所形成的吸收谱带，就称为红外光谱。 * 红外光谱的横坐标是波数（cm1）或频率；纵坐标是 光线的透过率（T），或摩尔吸收系数来表示： 1/（CL） * lg（I0/I） C浓度 L比色池厚度 I透过光的强度 I0入射光的强度 为什么不同有机基团会产生不同的红外光谱？ -OH、-SH、-NH等化学键存在振动。 振动形式有：伸缩振动、弯曲振动。 弯曲振动包括： 面内弯曲（剪式振动 、平面摇摆振动） 面外弯曲（ 非平面摇摆振动、扭曲振动） 伸缩振动包括： 对称伸缩振动、不对称伸缩振动 化学键振动存在振动频率、存在振动能级。没 有外界干扰时，分子处于最低的振动能级。 当红外光线照射到有机基团的化学键上时，分 子发生振动能级跃迁，跃迁需要吸收一定的能 量，该能量通常由照射的红外光线来供给。 化学键的键能、键长、键角、种类如单键、双 键、叁键、共价键、离子键等是决定吸收多少 能量的内在因素，也就是决定红外光谱的峰位、 形状、峰强的内在因素。反过来说，红外光谱 可以提供分子内部键参数的信息。 红外光谱基本原理 红外光谱基本原理 红外光谱所提供的能量与有机基团结构的振 动能级差相吻合； 紫外光线、可见光线提供的能量则不与有机 基团结构的振动能级相匹配； 红外光线提供的能量不与无机物的分子结构 振动能级相匹配！ 红外光谱识谱法 1、三个重要特征 * 谱带位置：基团的最有用的特征，给出基团的信息 * 谱带形状：给出基团信息 * 谱带的相对强度：给出两个信息， 一是定量的概念；二是指示某特殊基团或元素存在 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 苦味诺卡氏菌的红外光谱 Wavenumber cm-1 Transmittance % Transmittance % 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wavenumbers cm-1 吸附了Pb2的诺卡氏菌 红外光谱图 吸附了Zn2的诺卡氏菌 红外光谱图 诺卡氏菌的红外光谱 红外光谱分析表明，诺卡氏菌细胞成分中含有OH、SH 、NH2、OP、CO、PO、SO等大量基团。当细菌表面 遇到重金属离子时，这些基团都含有大量的孤电子对，可以成 为电子供体。 * 吸收谱带区：分子中各键的振动频率常常受到整个分子 的影响，但是有些键如羰基、OH、NH等因吸收峰 位于高频区，故受分子中其他结构的影响较小，高频 区40001333 cm1的吸收峰比较稀疏，易于辨认， 通常也叫特征谱带区、该区能用来鉴定官能团存在的 吸收峰称作特征吸收峰。 * 指纹区：低频区1333667 cm-1，这一区域谱带特别 密集，犹如人的指纹，各种化合物在结构上微小差别 在指纹区都会得到反映，因此，对鉴别有机化合物很 有用处。 * 相关峰：一个基团常有数种振动形式，每种红外活性的 振动通常都相应地产生一个吸收峰，习惯上把这些相 互依存而又相互佐证的吸收峰叫做相关峰。 红外光谱识谱法 （三个区） 七、菌体的扫描电镜样品制备方法 微生物样品在用于扫描电镜观察之前，需经过清洗、 固定、脱水等步骤。 固定是指用化学固定剂迅速杀死细胞的过程。固定 的目的是尽可能使细胞中的各种物质保持生活状态 的结构，并且牢固地固定在它们原来所在的位置上。 经过良好固定的细胞物质，不会由于后序的脱水处 理而发生移位或丢失。 扫描电镜样品制备方法 扫描电镜生物样品的制备步骤如下： (1) 1戊二醛溶液的配制：取50 mL 0.2 mol/L磷酸缓 冲溶液于100 mL容量瓶中，加入4 mL 25戊二醛 （市售的常见浓度）水溶液，加蒸馏水至满刻度。 (2) 把离心分离后的细菌放入10 mL配制的1戊二醛溶 液中固定2030 min，固定时采用搅拌，使材料均 匀地分布在固定液中。 (3) 离心分离（16000 r/min），使固定液与 细菌分开，弃去上清液。 (4) 用磷酸盐缓冲溶液（0.1mol/L， pH 7.2）漂洗并 重新离心，弃去上清液，反复离心几次。 (5) 用逐级上升浓度的乙醇，从30%5070 % 8