2016液体活检在胰腺癌中的应用图文课件

液体活检在胰腺癌中的应用 袁 周 上海交通大学附属第六人民医院 普外科 1 胰腺癌流行病学 胰腺癌发病率和死亡率逐年升高 2008年世界癌症死亡统计2012年世界癌症死亡统计 1.CA CANCER J CLIN 2011;61:6990 2.CA CANCER J CLIN 2015;65:87108 2 2011年中国胰腺癌流行病学研究 近年来上海市胰腺癌流行学研究 11.13/10万 17.28/10万 9.91/10万 14.04/10万 1.中国肿瘤, 2015, 24(1): 1-10 2.Cancer Letters 346 (2014) 273277 3 液体活检-胰腺癌诊疗新思路 1. Cancer Discov; 6(5); 113 DOI: 10.1158/2159-8290.CD-15-1483 2. Oncol Rep 2016;35(3):1237-44 4 肿瘤筛查 和早期诊断 实时监 控 治疗反应 评估转移复发 及预后 指导靶向 治疗 指导治疗 干预措施 CTC 和ctDNA Exosomes 胰腺癌CTC研究 5 预后判断 治疗监测 胰腺癌诊断 CTC cluster 转移机制 耐药性 Int J Cancer 2014; 1;134(1):1-8 CTC：胰腺癌诊断 6 利用数学模型对全基因组测序结果分析表明，胰腺癌发生到最 后肿瘤转移死亡过程需要经过数十年 1 CTC可能在肉眼可见肿瘤形成之前进入外周血，是肿瘤 转移的“种子” 2 IPMN和MCN作为PC癌前病变，这些患者可检测到CTC3 通过筛查高危人群CTC，加强随访，CTC阳性COPD患者最后发展 为肺癌，能否实现胰腺癌早期诊断需要进一步验证 4 1. Nature. 2010 Oct 28;467(7319):1114-7 2. Cell 2012;148(1-2):349-61 3. Gastroenterology 2014;146:647-51 4. PLoS One. 2014 Oct 31;9(10):e111597 CTC：胰腺癌治疗监测 7 动物实验表明：药物有效治疗后CTC 数量显著降低 胰腺癌患者术后CTC先下降后上升 ，可能是因为潜伏的disseminated tumor cells 再次被激活 PLoS One. 2014 Feb 19;9(2):e89474 Int J Cancer. 2015 Mar 1;136(5):1228-33 CTC：胰腺癌预后 8 CTC阳性患者：总生存时间较差，HR=1.23；无进展生存期更短，HR=1.89 Tumor Biol. (2014) 35:24732480 CellSearch检测CTC判断预后 9 16名b期PC患者，8名检出CTC CTC阳性MST：52.5天 CTC阴性MST: 308.3天 J Hepatobiliary Pancreat Surg (2008) 15:189195 Annals of oncology, 2013, 24(8): 2057-2061 79名局部晚期PC，9名患者在基 线或治疗后2月检测出CTC，检出 率11% CTC阳性OS较差 P=0.01 CellSearch联合表面分子标记物更 准确判断预后 10 经典的CellSearch检测CTC对转移 性PC的预后价值判断有限 结合MUC-1更好的对患者进行危 险分层 Pancreas. 2016 Mar 10 DOI: 10.1097/MPA.0000000000000619 CellSearch检测CTC评估肿瘤转移 在PC患者术后2-3年，术中门静脉CTC阳性提示较高的较高肝转移发生 率（ 53 vs. 8 %, p=0.038 ） CTC的数量变化辅助判断不同手术方式效果，术前两组门静脉CTC无差 异，术后标准手术组CTC升高而非接触术式组CTC不变 11 (Medicine 95(16):e3407) Tumor Biol. (2015) 36:991996 Medicine (Baltimore). 2016 Apr;95(16):e3407. doi: 10.1097/MD.0000000000003407 JAMA Surg. 2014 May;149(5):482-5 胰腺癌CTC检测-CellSearch 12 CTC检出率较低 晚期PC检出率 5%-42% 检出数量较少 1-10个/7.5ml 无法进行后续培养在EMT过程中CK、EpCAM等上皮标记物表 达减少或消失，上皮表型细胞减少，间质 表型细胞增多 胰腺癌为乏血供组织，血流量较正常胰腺 组织减少约60% CTC通过门静脉系统在肝脏内被清除 基于大小的胰腺癌CTC检测 13 优势：检出率高，检出数量多；细胞完整性好；不受细胞表面标记物影响； 可检出CTM；可进行后续分析 不足：不易检出小于8m的肿瘤细胞 胰腺癌：ISET、ScreenCell等 ISET-结合多种表面标记物确定CTC 根据肿瘤细胞形态学确定的CTC对PFS (P=0.85)和OS(P=0.36) 无判断作用 利用表面标记物研究CTC Epithelial CTC： CK+/CD45-/15m（78%），提示预后不良 Mesenchymal CTC：CK+/Vim+/ CD45-/15m（52%），提示术后复发 更多标记物值得去探究，如EMT过程中表达不下调的Plastin3 14 British Journal of Cancer (2012) 106, 508 516 Ann Surg. 2016 Jan 7, DOI: 10.1097/SLA.0000000000001600 Cancer Res. 2013 Apr 1;73(7):2059-69 ScreenCell-结合KRAS突变鉴别CTC 15 联合细胞形态和 KRAS突变检测胰腺 癌CTC，KRAS突变 可以作为判定CTC 分子学特征 可在不同分期PC患 者检测到，检出率 较高，分别为73%- 86% 67%-73%的CTC检 出KRAS突变 KRAS突变CTC与预 后有关 Pancreas 2015;44: 547550 Tumour Biol 2016; 37(6):7547-54 SE-iFISH方法检测CTC 16 SE-iFISH：差相富集技术联合免疫荧光染色及染色体荧光原位杂交技术 CTC鉴定方法 CK是上皮细胞来源标记物，免疫染色为绿色 CD45白细胞表面的共同抗原，免疫染色为红色 DAPI用于标记细胞核，染色呈现蓝色 8号染色体多倍性是胰腺癌一个重要特征，FISH染色为橙色 CTC 的表型： CK+/CD45-/DAPI+/CEP8=2， CK+/CD45-/DAPI+/CEP82，CK-/CD45-/DAPI+/CEP82 白细胞的表型为CK-/CD45+/DAPI+/CEP8=2； 未定性细胞表型为CK-/CD45-/DAPI+/CEP8=2 17 典型细胞图像 白色箭头所示为CTC，红色箭头所示为白细胞，绿色箭头所示 为未定性细胞 18 CTC计数诊断胰腺癌ROC曲线 ROC曲线下面积0.954 当CTC计数临界值为2个/7.5ml， 约登指数最大，为1.78 CTC2个/7.5ml 定义为CTC阴性 ，CTC2个/7.5ml 定义为CTC阳性 19 CTC阳性率与临床病理学参数关系 20 联合CTC计数与CA19-9诊断胰腺癌 21 CTC计数与胰腺癌生存时间关系 本组患者中位时间生存时间为10.2月（3.9-21.6月） CTC3个/7.5ml的患者中位生存时间15.2月（8.4-21.2月） CTC3个/7.5ml的患者中位生存时间10.2月（3.9-16.4月） 22 Cox比例风险回归模型 CTC3个/7.5ml（HR=4.547；P=0.016）和-期肿瘤（HR=2.742；P=0.012） 是胰腺癌不良预后的独立判断因素 J Exp Clin Cancer Res. 2016 Apr 12;35(1):66 23 CTC：肿瘤耐药性 在NSCLC中，CDX小鼠模型 (CTC derived xenograft)对化 疗药物反应类似提供CTC的患者，便于检测化疗耐药性 在乳腺癌中，培养CTC细胞系，进行药敏试验，难治性 肿瘤的提供新治疗药物，进行个性化治疗方案 通过对接受和未接受AR (androgen receptor)抑制剂治疗 的前列腺癌患者CTC，发现非经典Wnt信号通路激活， Wnt5a异常表达抑制药物疗效 24 1.Nat Med. 2014 Aug;20(8):897-903 2. Science. 2014 Jul 11;345(6193):216-20 3. Science. 2015 Sep 18;349(6254):1351-6 CTC在肿瘤转移发中的作用 25 Nature. 2016 Jan 21;529(7586):298-306 CTC：肿瘤转移机制 在前列腺癌中，CTC全外显子组测序揭示70%的CTC突变与 肿瘤组织一致 在乳腺癌CTC中分离出MIC（ metastasis-initiating cells ）， 证实EPCAM+/CD44+/CD47+/MET+类型细胞具有肿瘤干细胞 特性 在胰腺癌中，利用RAN-Seq分析鉴定出非经典Wnt途径在 胰腺癌中的作用，抑制Wnt2基因有可能抑制转移 肿瘤可以通过CTC进行自我种植（self-seeding），进而促 进肿瘤增大，血管生成等 26 1. Nat Biotechnol. 2014 May;32(5):479-84 2. Nat Biotechnol. 2013 Jun;31(6):539-44 3. Nature. 2012 Jul 26;487(7408):510-3 4. Cell. 2009 Dec 24;139(7):1315-26 CTC：肿瘤转移机制 27 胰腺癌CTC的RNA-Seq 分析发现： CTC高度表达间质来源的 胞外基质蛋白 SPARC促进胰腺癌的转移 前列腺癌CTC的RNA-Seq分析发现CTC中 的相关信号通路 1. Cell Rep. 2014 Sep 25;8(6):1905-18 2. Science. 2015 Sep 18;349(6254):1351-6 CTC cluster 在乳腺癌中，CTC cluster 转移能力大 约是单个CTC的50倍， plakoglobin(斑 珠蛋白)在形成中其关键作用，表达 降低后肿瘤转移能力显著下降 CTC cluster与血小板、白细胞、成纤 维细胞及内皮细胞共同构成特有微 环境，可以抑制失巢凋亡 CTC cluster提示患者预后较差 28 1. Cell. 2014 Aug 28;158(5):1110-22 2. Trends in Cancer, 2015, 1(1): 44-52 ctDNA：临床应用前景广泛 29 早期诊断，检 测残余病灶 动态监 测治疗反 应；指导 靶向用药 判断预后 Clin Chem. 2015 Jan;61(1):112-23 ctDNA：检测方法日新月异 30 数字PCR计数提高稀有突变检出率，提高检测的深度 NGS计数可以性检测多个靶基因，尤其是靶向深度测序，提高检测广度 J Clin Oncol. 2014 Feb 20; 32(6): 579586 Kras基因为胰腺癌重要驱动基因 31 Trends in biochemical sciences, 2014, 39(2): 91-100 液体活检检测KRAS对PC预后有 更强的判断能力 32 KRAS来源液体活检检肿肿瘤组织组织总总突变变新鲜肿鲜肿 瘤组织组织FFPE 风险比3.161.371.622.011.29 Med Oncol(2016)33:61 DOI 10.1007/s12032-016-0777-1 ddPCR检测ctDNA 105例PDAC手术患者，肿瘤组织KRAS突变率82%，ctDNA 突变率33%，与肿瘤在组织符合率100% 肿瘤组织KRAS突变无判断预后作用（P=0.18），ctDNA的 KRAS突变可判断预后（13.6月 vs 27.6月，P0.001） 不同KRAS突变亚型的患者OS无显著差别 33 Br J Cancer. 2016 Jun 28;115(1):59-65 ctDNA动态监测病情变化 ctDNA与CA19-9水平有 很好的相关性(Spearmans rho=0.786, P=0.021) ctDNA较影像学平均提前 6.5月发现肿瘤进展 34 Mol Oncol. 2016 Apr;10(4):635-43 Nat Commun. 2015 Jul 7;6:7686 ctDNA指导靶向用药 35 Sci Rep. 2015 Dec 16;5:18425 Nat Commun. 2015 Jul 7;6:7686 ctDNA反映胰腺癌突变基因类型 ，可使更多患者有可能得到靶向 治疗 大约三分之一患者有可用靶向药 胰腺癌靶向深度测序Panel 36 基于ctDNA的靶向用药结果 EGFR外显子19缺失与厄洛替尼敏感有关 ctDNA提前检测到该突变，后经活检证实，予以厄洛替尼 治疗 结果CA19-9正常，肿瘤缩小，病情缓解 37 Cancer Discov. 2015 Oct;5(10):1040-8 基于ctDNA的靶向药物试验 BRAF V600E突变在胰腺癌中比例3%，不与KRAS突变共存， 是Vemurafenib批准用于治疗黑色素瘤的靶点 取BRAF V600E突变患者肿瘤细胞进行培养，结果发现和黑 素偶细胞系MNT-1对Vemurafenib有类似敏感性，而KRAS突 变细胞系PL-45则无反应 38 Nat Commun. 2015 Apr 9;6:6744 世界范围内的精准医疗热潮 澳大利亚针对晚期胰腺癌患者进行The Individualized Molecular Pancreatic Cancer Therapy (IMPaCT) 试验， 帅选出HER2 扩增; KRAS野生 型; DNA修复通路基因突变 (BRCA1, BRCA2,PALB2, ATM)患者进行靶向治 疗，有可能通过液体活检辅助精准靶向治疗 美国NCI正在组织进行MATCH (Molecular Analysis for Therapy Choice) 试 验，计划帅选3000名实体肿瘤患者，最终根据突变类型给予靶向药物 治疗 39 Clin Cancer Res. 2015 May 1;21(9):2029-37 Semin Oncol. 2014 Jun;41(3):297-9 我们开展的研究 验证CTC对PC诊断和预后判断作用 探究CTC监测PC的病情变化和治疗反应 CTC ctDNA、CTC、肿瘤组织 的基因突变比较 利用ctDNA研究PC诊断、治疗反应、病情 监测 和预后判断情况 ctDNA 全外显子组检测 胰腺癌肿瘤的突变 研究新发突变的分子流行病学情况 进行相关的靶向药物的临床试验 NGS 40 部分检测结果 41 Sanger法 ddPCR法 部分检测结果 42 ARMS法 外泌体组成 43 外泌体是一种直径为 30 100 nm 的膜性小囊泡，可 由机体中的多种细胞分泌 ，并广泛分布于唾液、血 浆和乳汁等体液中。 相关研究登记在 / Annu Rev Cell Dev Biol. 2014;30:255-89 外泌体分离方法 离心法：收集细胞培养液以后依次在300 g、2 000 g、10 000 g离心 去除细胞碎片和大分子蛋白质，最后100 000 g离心得到外泌体 过滤离心：利用不同截留相对分子质量 (MWCO)的超滤膜离心分 离外泌体 密度梯度离心：将样本和梯度材料一起超速离心，样品中的不同 组分沉降到各自的等密度区，分为连续和不连续梯度离心法 免疫磁珠：包被有单克隆抗体的球型磁性微粒，可特异性地与靶 物质结合 色谱法：利用根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关 系而对溶质进行分离的分析的方法 44 胰腺癌外泌体研究Landmark 45 德克萨斯大学M. D.安德森癌症中心 外泌体早期诊断 46 PKT小鼠模仿人类胰腺癌发展过程 ，4.5周时形成PanIN，8周时死于 PDAC GPC1+ 外泌体的比例随着肿瘤体 积增大和组织学分化变差而不断 升高 外泌体的浓度与大小同样与病情 进展相关系较差 外泌体含有KRAS突变且在胰腺癌 早期阶段升高，可以作为理想的 胰腺癌早期诊断标记物 Nature. 2015 Jul 9;523(7559):177-82 外泌体用于胰腺癌诊断 47 GPC1+ 外泌体比例在鉴别胰腺导管腺癌与胰腺良性疾病和正常人群的灵敏 度和特异度为100%。 GPC1+ 外泌体比例对于不同分期（原位癌、和期肿瘤的灵敏 度和特异度均为100%） 外泌体浓度及大小无法有效鉴别 外泌体提示肿瘤负荷 48 28/29的PDAC和全部PCPL术后GPC1+ 外泌体均下降 19/29的PDAC和0个PCLC患者术后CA19-9水平下降 外泌体变化判断胰腺癌预后 49 GPC1+ 外泌体下降