出血性疾病的实验室检测2011课件

出血性疾病的实验室诊断 瑞金医院 止血过程 BV Injury Platelet Activation Plt-Fusion Blood Vessel Constriction Coagulation Activation Stable Hemostatic Plug Thromibn, Fibrin Reduced Blood flow Tissue Factor Primary hemostatic plug Neural 出血性疾病的诊断流程 凝血因子缺陷症检测 凝血途径 Fg，TT 血友病筛选及诊断试验 PT APT T TT Fg 筛选试验 混合试 验 凝血因子活性检测 病理性抗凝物质检测 FVIII抑制物 类肝素 狼疮抗凝物质 纠正 不纠正 确诊试验 混合试验(mixing test) PT延长3， APTT延长5 患者血浆：正常人血浆 1：1或4：1 即刻检测，37C孵育2h后检测 结果判断： X+2SD 不纠正 Mixing test 结果判断 因子缺陷 APTT参考范围 26-34s APTT 60s APTT1:1mix 32s APTT被纠正 因子缺陷 抑制物 APTT参考范围 26-34s APTT 60s APTT1:1 mix 40s APTT不被纠正 抑制物存在 Mixing test 结果解释 aPTT results Example123 A - normal plasma30”30”30” B - test plasma90”90”90” C - test+normal (incubated)35”70”70” D - test+normal (non-incubated)35”48”70” Example 1 因子缺乏 Example 2 FVIII抑制物 Example 3 即刻反应抑制物 Mixing test 应用 初步判断： 凝血因子缺陷 FVIII抑制物存在 狼疮抗凝物质存在 活性测定 凝固点法 一步法 （One-Stage）-临床测定参比方法 两步法（Two-Stage） 发色底物法 （Chromogenic Factor VIII Assay） 抗原测定 ELISA 凝血因子活性和抗原检测 一步法检测FVIII:C (One-Stage) 原理： 基于 APTT凝固法 乏FVIII血浆倍比稀释参比血浆和待检血浆 APTT时间与FVIII:C对数成线性关系 制备标准曲线 FVIII:C检测 One-stage Factor VIII Assay 试剂因素： 磷脂 激活剂 乏FVIII血浆 血友病A血浆 免疫吸附制备 VWF含量正常 因子缺陷敏感的APTT试剂 发色底物测定原理 发色底物测定原理 直接一步测定 FXa + Substrate Peptide + pNa (measured 405nm) 直接两步测定 (Chromogenic FVIII) FX + FIXa/Ca2/PL+FVIIIa FXa +Substrate Peptide + pNa 间接测定 (AT activity assay) （AT Heparin） + IIaresidual IIa + Substrate Peptide + pNa 发色底物法分类 发色底物法测定F VIII:C 商品化试剂盒 两步法的原理 SSC ISTH推荐为高纯度FVIII:C测 定参比方法 凝固法和发色底物法 抑制物检测方法 Bethesda法 Nijmegen modification 狼疮抗凝物质检测 相关概念 aCL抗心磷脂抗体ELISA法检测抗心磷脂的抗体 抗体依赖或不依赖2GP1 aPL抗磷脂抗体IgG，IgM或IgA抗体，靶蛋白是心磷脂、 2GP1或凝血酶原，靶蛋白与磷脂结合 2GP12-糖蛋白1抗心磷脂抗体与心磷脂结合的桥梁蛋白 LA狼疮抗凝物质功能检测，抗2GP1或凝血酶原抗体，使凝 血时间延长 临床疑似APS APTT延长 混合试验证实有抑制物存在 排除肝素导致的APTT延长 TT RT 狼疮抗凝物质(LA)检测 检测方法 ELISA法检测： 抗心磷脂抗体 抗磷脂抗体 2GPI 抗凝血酶原抗体 功能测定-凝固为基础的检测 用狼疮抗凝物质检测2GPI-磷脂和/或凝血酶原-磷脂复合物 基于PT、APTT、dRVVT 的测定 血管性血友病（VWD） VWD 血管性血友病因子（VWF）数量或者结构 异常引起 3个型（1型、2型、3型） 2型分为2A、2B、2M、2N四个亚型 VWD诊断 FVIII:C VWF:Ag VWF:RCo BT PFA-100 VWF多聚体检测 胶原结合试验 FVIII结合试验 PFA-100 Platelet Function Analyzer Trigger solution container Soft keys LCD screen Built-In Printer Carousel Cassette Test Cartridge 体内止血PFA-100 capillary 200m aperture 150m epinephrine or ADP platelet vWF erythrocyte FLOW - 40 mbar collagen membrane PFA-100 检测原理 lumen fibrinogen platelet collagen fibrils erythrocyte endothelial cell vWF PFA-100 检测原理 堵塞过程 Data scatter of all study groups : 050100150200250300 300 250 200 150 100 50 0 Closure Time for Col/Epi (sec) Closure Time for Col/ADP (sec) To : Meyer, Fressinaud et al. l Normals l vWD Type 1 l vWD Type 2 l vWD Type 3 诊断VWD PFA-100 临床应用 To : Meyer, Fressinaud et al. Sensitivity in vWD Type 1 Comparison of Bleeding Time (BT) and Closure Time (CT) in Type 1 vWD BT (min) 20 5 10 15 0 EpinephrineADP CT (s) 250 200 150 100 50 PFA-100 Clinical Application Sensitivity for vWD - Overview BTCol/EpiCol/ADP Type 153%94%100% (n=36) Type 2 (no 2N)85%100%100% (n=13) Type 3100%100%100% (n=4) Acquired80%100%100% (n=5) PFA-100 Clinical Application To : Meyer, Fressinaud et al. Bleeding Time vs PHC (Col/Epi and Col/ADP closure times) 多聚体电泳 2AN 2M 2 M FVIII结合试验 FVIII结合力降低 血小板功能异常性疾病 血小板功能检测 血小板计数 血涂片检查 血块收缩实验（血小板与Fb的相互 作用） 血小板功能检测 出血时间（BT)：血小板和血管功能 Sensitivity to Hereditary Platelet Defects 0 0 5050100100150150200200250250300300 300300 250250 200200 150150 100100 5050 0 0 Closure Time for Col/ADP (sec) Closure Time for Col/Epi (sec) lNormals lGlanzmann lBernard S. lGiant Pl.S. lStorage P.D. Data scatter of all study groups : To : Mller, Kirchmaier et al. ; Frankfurt aM. PFA-100 检测 血小板聚集试验-原理 常用诱导剂诱导的血小板聚集 ADP 胶原 肾上腺素 瑞斯托霉素 花生四烯酸 正常人不同诱导剂诱导的血小板聚集和释放反应 不同诱导剂诱导的血小板聚集和释放反应 -服用阿司匹林后 流式细胞仪的应用 BernardSoulier syndrome GPIb-, GPIX-, and GPV-特异单克隆抗体 Glanzmann thrombasthenia IIb- 和 3-特异性单克隆抗体 Storage pool disease 5-羟色胺特异的单克隆抗体 血小板无力症流式检测结果 注：A. 先证者