王镜岩生物化学（上）课件013蛋白性质分纯

蛋白质的分离、纯化 和表征 顾 黎 Y 山东大学生命科学学院 1 以蛋白质的结构与功能为基础，从分子水 平上认识生命现象，已经成为现代生物学 发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得 到高度纯化并具有生物活性的目的物质。 2 蛋白质的相关性质 3 蛋白质的两性电离 一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质的等电点： 当溶液在某一pH环境中，使蛋白质所带正、负电荷 相等，净电荷为零，在电场中不向阳极也不向阴极 移动，这一pH称为该蛋白质的等电点（pI）。 4 蛋白质pI与所含氨基酸种类和数量有关，若 蛋白质中碱性aa较多,其pI偏碱，如从雄性鱼 类精子中提取的鱼精蛋白含Arg多，其pI 约为 12 ；若含酸性aa较多，则pI偏酸。 蛋白质在等电点时其溶解度、导电性、粘度 、渗透压最小。 5 蛋白质的等离子点： 没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解 离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数 相等时的pH称为蛋白质的等离子点. 6 蛋白质相对分子量在10000 - 1000000之间。 测定分子量的主要方法有: 渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰 胺凝胶电泳等。 二、蛋白质的分子大小与形状 7 1、根据化学组成测定最低相对分子质量 肌红蛋白含铁0.335%，其最低相对分子质量为： 铁的原子量 铁的百分含量 100 55.8 0.335 10016700 真实的分子量是最低相对分子质量的n倍，n为每 个蛋白质分子中某原子的数目。 8 2、渗透压法测定相对分子质量 渗透：溶剂分子由纯溶剂(或稀 溶液)向溶液(或浓溶液)单方向 的净移动现象。 渗透压： 渗透压是溶液的依数性质之一。 在一种溶质的理想溶液中渗透压 是浓度的线性函数。 9 在理想溶液中，溶液的渗透压与溶质浓度的关系可用 vant Hoff公式表示： 实际情况下，渗透压与浓度之间不是 简单的线性关系,用以下公式： =cRT/Mr r 10 优点： 1、装置简单 2、精确度不亚于其他方法 用该法应注意的问题： 渗透压受pH的影响- 唐南平衡造成半透膜两侧 可渗透的无机离子的不均衡分布，从而增加蛋白 质溶液的渗透压。 缺点： 易受蛋白质样品纯度的影响 11 3、蛋白质的扩散和扩散系数 蛋白质的扩散系数与分子大小和形状以及溶剂的 粘度有关。 平移扩散或扩散：由于浓度差引起的溶质分子的 净迁移。扩散的热力学驱动力是熵的增加。 12 扩散系数一般不单独用来决定分子量，而是与沉降系 数结合起来，可以给出蛋白质的精确相对分子质量。 扩散系数D =浓度梯 度为一个单位时， 1s内通过1cm2面积 所扩散的溶质的量 。 D与分子量立方根成反比，因此D对分子量的变化 并不敏感。 13 4、沉降分析法测定相对分子质量 沉降速率与蛋白质的分子大小、形状和密度有关 ，还与溶剂的密度和粘度有关。 沉降分析不仅可以提供关于蛋白质相对分子质量 的数据，还可以作为鉴定蛋白质分子均一性的一 种方法。 14 s = v 2x v =沉降速度（dx/dt） =离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的距离cm） 沉降系数的单位常用S，1S=110-13（s） 1）沉降速度法 沉降界面移动的速度代表蛋白质分子的沉降速度。 沉降系数s:单位离心场的沉降速度 15 蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系 M = RTs D（1V） R气体常数（8.314107ergsmol -1 度-1 ） T绝对温度 D扩散系数（蛋白质分子量很大，离心 机转速很快，则忽略不计） V蛋白质的微分比容（m3g-1） 溶剂密度（20，gml-1） s沉降系数 斯维得贝格方程 16 在较低速度离心场中进行。 当净离心力与扩散力平衡时，在离心池内从液面 到液底形成一个由低到高的恒定浓度梯度。 r 2）沉降平衡法 17 沉降分析法的优点： 不仅可以测分子质量，而且可以鉴定 蛋白质分子的均一性。 18 1） 凝胶过滤的原理 不同大小的分子由于所经过的路径不同而被分离。 5、凝胶过滤法测定相对分子质量 19 2）凝胶过滤的介质 凝胶珠（凝胶颗粒）,凝胶珠的内部是多孔的网状 结构。 排阻极限 常用：交联葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖等。 Sephadex-葡聚糖凝胶G10-G200 Sepharose-琼脂糖凝胶2B,4B,6B Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶S100、S200、S300 20 Vo Vt-Vo = Vi+Vm Vt lgMr =a/b-1/b(Ve/Vo) 21 蛋白质分子通过凝胶柱的 速度(洗脱体积的大小)并 不直接取决于分子的质量 ，而是它的斯托克半径。 优点： 1）比较简便 2）待测样品可以不纯 22 6、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 SDS: CH3-(CH2)10-CH2-OSO3Na 1）使多肽链覆盖上相同密度的负电荷。 2）改变了蛋白质单体分子的构象。 不同蛋白质的SDS复合体具有几乎相同的 荷质比和相同的构象，因而它们的净电荷 量与摩擦系数之比都接近一个定值(具有相 近的自由迁移率)。 23 电泳法测分子量 24 7、蛋白质分子形状 溶液中蛋白质： 借助间接方法。 晶体状态蛋白质： 最精确的方法是X射线晶体结构分析。 25 摩擦比（蛋白质的不对称常数）： 蛋白质分子形状偏离真正球体的程度的一种衡量。 26 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 1、蛋白质的胶体性质 蛋白质在溶液中保持稳定的2个条件： 质点的电荷 质点与溶剂形成溶剂化层 分散系统分为3类： 真溶液：小于1nm 胶体溶液：1100nm 悬浊液：大于100nm 布郎运动、丁道尔现象、 电泳现象，不能透过半透 膜，具有吸附能力 + + + + + + 27 2、蛋白质的沉淀 蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水 膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破 坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为 蛋白质的沉淀作用。 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小 、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的 条件，将影响蛋白质的溶解性质 28 5、加热变性沉淀法：天然结构解体，疏水基团外露，破 坏水化层。 2、有机溶剂沉淀法：脱水化层及降低介电常数加强带电 质点的相互作用。 1、盐析法：脱水化层。 沉淀蛋白质的方法有以下几种： 4、生物碱试剂和某些酸类沉淀法：与生物碱试剂或酸性 负离子生成不溶性盐。 3、重金属沉淀法：与重金属离子生成不溶性盐。 29 蛋白质分离纯化的 一般原则 总目标:增加制品的纯度或比活。 30 分离和纯化的过程中，必须注意保存生物大 分子的完整性，防止酸、碱、高温，剧烈机 械作用导致所提物质生物活性的丧失。 31 根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱 性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 前处理：生物组织的机械破碎 动物材料：除结缔、脂肪组织- 电动捣碎机、匀 浆器、超声波 植物组织：去种皮- 石英砂、玻璃粉 细菌细胞：超声波震荡、砂研磨、高压、溶菌酶 32 3、细分级分离：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、 亲和层析、电泳 2、粗分级分离：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离 4、结晶 粗提目的蛋白质 纯化目的蛋白质、规模较小、分辨率很高 进一步纯化、准备结构分析 33 依据蛋白质的性质不同： 分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、 特异的生物学亲和力 蛋白质的分离纯 化方法 34 透析( Dialysis) ：根据分子量的大小，用透析袋将 大、小分子物质分开。 一、根据分子大小不同的分离方法 常用的半透膜有玻璃纸 或高分子合成材料，截 止分子量一般为一万。 1、透析和超过滤 通透动力为半透膜两侧的物质浓度差。 35 超(过)滤：利用压力或离心力，强行使 水和其他小分子通过半透膜，蛋白质被 截流在膜上，以达浓缩和脱盐的目的。 切向流过滤(交叉流过滤)： 包括有：中空纤维超滤器、圆筒式超滤 器、板式超滤器。 超滤膜的截止分子量有100万、50万、 30万、10万、5万、1万、5千和1千。 36 2、 密度梯度离心 （沉降取决于大小和密度） 常用的密度梯度：蔗糖、聚蔗糖和其他 合成材料的密度梯度。37 3、 凝胶过滤（分子筛层析） 38 影响蛋白质溶解度的外部因素： 1）溶液的pH 2）离子强度 3）介电常数 4）温度 二、 利用溶解度差异的分离方法 溶解度归根结底取决于它们本身的分子结构 蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即 颗粒表面的水化层和电荷。 若无外加条件，蛋白质不致互相凝集; 除掉这两个稳定 因素,蛋白质便容易凝集析出。 39 1、 等电点沉淀和pH控制 pH和离子强度对 -乳球蛋白溶解度 的影响 40 2、蛋白质的盐溶和盐析 盐溶：低浓度的中性盐可增加蛋白质的溶解度。 蛋白质分子吸附某种盐类离子，带电层使其互相排斥。 盐析：蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，如 (NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl，由于水化层被破坏和 表面电荷被中和，容易发生沉淀。 不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析 时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白 质加以分离。 41 半饱和硫酸铵 离心 球蛋白沉淀血清 血清 离心 饱和硫酸铵 白蛋白沉淀 42 3、有机溶剂分级法 在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机 溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏 蛋白质的水化层，降低介电常数使蛋白质的溶解 度降低而沉淀。 有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，低温下或缩 短处理时间可防止或减缓变性。 常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。 聚乙二醇：脱去蛋白质的水化层。 4、温度对蛋白质溶解度的影响 43 1、电泳 三、根据电荷不同的分离方法 在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性 相反的电极移动，这种现象称为电泳。 蛋白质溶液的pH值不等于等电点时，蛋白质颗 粒均带有不同的电荷。 在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动 的速度（v）取决于电场强度(E)、所带的净电荷(q)以 及与介质的摩擦系数(f) 44 界面移动电泳图解 45 46 1）聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 圆盘电泳过程中的3种物理效应： a、 样品的浓度效应 b、 凝胶对被分离分子的筛选效应 c、 一般电泳分离的电荷效应 亦称圆盘凝胶电泳或圆盘电泳 “圆盘(disc)” discontinuity 和 discoid shape 不连续胶 47 2）毛细管电泳 优点：减少了由于热效应产生的许多问题。 3）等电聚焦（属于自由界面电泳） *凝胶等电聚焦：用聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖或葡 聚糖凝胶代替蔗糖溶液进行电泳。固体、量大。 蛋白质混合物在具有pH梯度的介质（浓蔗糖溶 液）中进行。 48 2、聚焦层析 根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物 的柱层析方法。 用特种多缓冲液滴洗填充在柱中的特种多缓 冲交换剂，即可建立pH梯度。 49 3、离子交换层析 利用离子交换树脂 作为柱层析支持物 ，将带有不同电荷 的蛋白质进行分离 的方法。 50 1）纤维素离子交换剂 交换容量大于树脂、洗脱条件温和、品种较多。 2）交联葡聚糖离子交换剂 即可根据分子的净电荷数量又可根据分子的大小 进行分离。 51 四、利用选择性吸附的纯化方法 1) 羟磷灰石层析 Ca10(PO4)6(OH)2 2) *最重要的用途是将单链和双链DNA分开。 3) *从含RNA和蛋白质的细胞提取液中选择性除去DNA 。 吸附层析（薄层、柱）： 利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附 能力和解吸性质不同而达到分离的目的。 吸附过程涉及范德华作用和氢键等非离子吸引力。 典型的吸附剂：硅胶、氧化铝和活性炭等。 52 2) 疏水作用层析 利用蛋白质表面存在的疏水区域的强度、大小不同， 而被吸附到连接有疏水基团的层析介质上。 疏水基团：正丁基-Sepharose、正辛基-Sepharose、 苯基-Sepharose - 连接到琼脂糖上。 离子强度增大（硫酸铵的存在）可增强吸附能力，因 此常在2mol/L或3mol/LNaCl溶解样品，洗脱时可通过 降低盐浓度、增加乙二醇浓度进行梯度洗脱。 53 这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不 同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基 具有不同的识别和结合能力。 五、利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 54 常用的配基：抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶 的底物和抑制剂等。 层析柱载体：琼脂糖凝胶等。 凝集素亲和层析、免疫亲和层析、金属螯合层析 、染料配体层析和共价层析。 55 56 六、高效液相层析和快速蛋白质液相层析 快速蛋白质液相层析(FPLC) 专用于蛋白质分离。没有自己的特有原理。 反相HPLC： 与其他层析的最大区别是固定相基本上是惰性的 ，固定相与被分离物只可能有疏水作用。 HPLC是离子交换、分子排阻、吸附和分配等层 析技术的发展新阶段。 更高的效率、更高的分辨率和更快的过柱速度。 57 蛋白质含量的测定与 纯度鉴定 58 一、蛋白质含量的测定 1) 凯氏定氮法：灵敏度较低 2) 双缩脲法：样品量0.2-1.7mg/L 3) Folin-Lowry法： 在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸 上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其与双羧 脲法结合起来，蛋白质形成两种颜色的混合物呈 绿色，在650nm具有特定的吸收。灵敏度较高 25g-250g/ml。 BCA法 1、蛋白质总量的测量 59 4) 考马斯亮蓝法（Bradford法） 考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料，在酸性条 件下，可与蛋白质上的正电荷结合，形成蓝色化合物 ，在595nm具有特定吸收，反应简便、快速、