生物化学第一章 蛋白质121 ppt课件

第一章 蛋白质（ Protein） 主要内容：介绍蛋白质的构件单位氨基酸 的结构、分类、性质及肽的概念，重点讨论 蛋白质的结构、性质以及结构和功能的相互 关系。 第一节 蛋白质的组成、分类及生物学功能 蛋白质主要元素组成：C、H、O、N、S 微量元素：P、Fe、Cu、Zn、Mo、I、Se 等。 蛋白质平均含N量为16,这是凯氏定 氮法测蛋白质含量的理论依据： 蛋白质含量蛋白质含N量6.25 蛋白质的分类 根据分子形状分类： 根据化学组成分类： 蛋白质主要功能： 催化功能； 结构功能； 调节功能； 防御功能； 运动功能； 运输功能； 信息功能； 储藏功能 第二节 蛋白质的基本构件单位氨基酸 一、氨基酸的结构通式 -氨基酸的通式 二、氨基酸的分类 1. 非极性疏水性氨基酸 2. 极性中性氨基酸 3. 酸性氨基酸 4. 碱性氨基酸 （一）氨基酸的分类 * 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下: 非极性R基团氨基酸 不带电荷极性R基团氨基酸 带电荷R基团氨基酸 三、氨基酸的性质 (1)两性解离性质和等电点(PI) 氨基酸的两性解离性质及等电点（pI） pH = pI 净电荷=0 pH pI 净电荷为负 CH R COOH NH3+ CH R COO NH2 CH R COO NH3+ + H+ + OH- + H+ + OH- (pK1)(pK2) 当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负 电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动， 此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点(isoelctric point)。 甘 氨 酸 滴 定 曲 线 甘氨酸盐酸盐（A+）等电点甘氨酸（A）甘氨酸钠（A-） 一氨基一羧基AA的 等电点计算： pI= 2 pK1+pK2 谷氨酸（A）和赖氨酸（B）滴定曲线和等电点计算 B A pK1 pK2 pI pI pK3 pK3 pK2 pK1 加入的OH-mL数加入的OH-mL数 pH pH 一氨基二羧基AA的 等电点计算： pI= 2 pK1+pK2 二氨基一羧基AA的 等电点计算： pI= 2 pK2+pK3 （2）氨基酸光学活性 1、氨基酸的旋光性：除甘氨酸外，所有天然-氨基酸都有不对 称碳原子，因此所有天然氨基酸都具有旋光性。 有的是左旋，有的是右旋。 2、紫外吸收光谱： 参与蛋白质组成的20种氨基酸中色氨酸 (Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的 R基团中含有苯环共轭双键系统，在紫 外光区显示特征的吸收谱带，最大光吸 收（max）分别为280、275、和 257nm。 由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残 基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白 质含量。 蛋白质的最大吸收峰一般为:280nm . Try 、 Tyr 、 Phe 的 紫外 吸收 光谱 摩尔吸收系数 波长 （3）氨基酸的重要化学反应 氨基酸与茚三酮反应 + 3H20 茚三酮(无色) NH3 CO2 RCHO + 还原性茚三酮 紫色化合物 (弱酸) 加热 + 2NH3 + 还原性茚三酮还原性茚三酮 氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应 （Sanger反应） DNFB（dinitrofluorobenzene） DNP-AA(黄色) + + HF 弱碱中 氨基酸 氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应 （Edman反应） PITC（phenylisothiocyanate） + 苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA） 弱硷中 (40) (硝基甲烷 40) H+ 第三节 肽 一、肽及其命名 肽(peptide)是氨基酸的-羧基与另一 个氨基酸的-氨基脱水形成的聚合物。 肽的命名是根据肽中所含氨基酸的数 目来进行的,由两个氨基酸形成的肽称为二 肽,由三个氨基酸形成的肽称三肽,如此类 推。 由多个氨基酸组成的肽称为多肽，多肽一 般形成链状，常称为肽链( peptide chain) 。 二、肽链的结构 肽单位 肽键 多肽链结构示意图 肽单位 肽基的C、O和N原子间的共振相互作用 共振产生的重要结果：限制绕肽键的自由旋转 形成酰胺平面 产生键的平均化 肽键呈反式构型 sp2 sp2 sp2 sp3 共振杂化体 三、重要的天然活性肽 类别：激素、抗菌素、辅助因子 实例：谷胱甘肽(glutathione) 短杆菌肽S 促甲状腺素释放因子（TRH） 谷胱甘肽 谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还 原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。 短杆菌肽S Orn: 鸟氨酸 由下丘脑分泌，其功能是促进腺垂体释放促甲状腺 素(调节糖代谢)。 第四节 蛋白质的分子结构 蛋 白 质 结 构 的 主 要 层 次 一级结构 四级结构 二级结构 三级结构 primary structure secondary structure Tertiary structure quariernary structure 超二级结构 结构域 supersecondary structure Structure doman 一、蛋白质的一级结构 多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置称为蛋白 质的一级结构(primary structure)。 这是蛋白质最基本的结构，它决定蛋白质高级结构和生物 功能。 例：牛胰岛素的一级结构 世界三大DNA序列和蛋白质序列的 查询资料库： GenBank l 全 称为：the National Center for Biotechnology Information at the National Library of Medicine at the National Institutes of Health. govl是指 U.S government的一个分支机构。 EMBL http:/www.cbi.ac.uk/ 它位于英国剑桥 欧洲生物信息研究所（EBI）。 DDBJ http:/www.ddbj.nig.ac.jp the DNA Data Bank of Japan. 由日本国立遗传学研究所 承办。 基本策略： 片段重叠法氨基酸顺序直测法 基本步骤： (1) 蛋白质样品预处理：纯化、测分子量、断开二硫 键、断开非共价键。 蛋白质一级结构测定 胰岛素 -巯基乙醇 碘乙酸 二 硫 键 的 断 裂 （2）分析每一条多肽链的氨基酸组成： 蛋白质水解+氨基酸自动分析仪使用。 (3)鉴定多肽链N末端、C末端氨基酸 残基； 多肽N、C-末端氨基酸的测定 N端 Sanger法（二硝基氟苯反应） DNS法（丹磺酰氯反应） Edman法（苯异硫氰酸脂反应） 氨肽酶法 C端 肼解法 还原法 羧肽酶法 （4）专一性部分裂解多肽链成较小的片段 ；每种样品至少用两种方法裂解，产生两 套以上的片段。 a、胰蛋白酶：水解由Lys or Arg的羧基形 成的肽键。 b、胰凝乳蛋白酶：水解由芳香族氨基酸 （Phe,Trp or Tyr)的羧基形成的肽键。 Leu,Met,His的羧基形成的肽键水解较慢 。 Pro的氨基形成的肽键不被水解。 c、嗜热菌蛋白酶：水解疏水性强的氨基 酸的氨基形成的肽键。（ Leu,Ile,Phe,Trp,Val,Tyr,or Met) Pro or Gly的氨基形成的肽键不被水解。 d、溴化氰：水解由Met 的羧基形成的肽 键。 消化道内几种蛋白酶的专一性 （Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys） （脂肪族） 胰凝乳 蛋白酶 胃蛋白酶弹性蛋白酶 羧肽酶 胰蛋白酶 氨肽酶羧肽酶 （Phe. Trp） （5）肽片段的分离纯化 （6）测定各肽段的氨基酸顺序； 氨基酸序列测定 基本方法： Sanger法 Edman降解法 DNS-Edman测序法 蛋白质顺序仪测序 （7）片段重叠法重建完整多肽链一级结构 ； （8）确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联 桥的位置。 将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序 专一性裂解 末端氨基酸测定 二硫键拆开 纯蛋白质 蛋白质顺序测定 基本方法路线 片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意 所得资料： 氨基末端残基 H 羧基末端残基 S 第一套肽段 第二套肽段 QNS SEQ PS WTQN EQVE VERL RLA APS HQWT HQ 借助重叠肽确定肽段次序： 末端残基 H S 末端肽段 HQWT APS 第一套肽段 HQWT QNS EQVE RLA PS 第二套肽段 HQ WTQN SEQ VERL APS 推断全顺序 HQWTQNSEQ VERLAPS 二、蛋白质的构象和维持构象的作 用力 （一）构型与构象 构型（configuration）：立体异构体中 取代原子或基团在空间的取向； 一个碳原子和四个不同的基团相连时，只 可能有两种不同的空间排列，这两种不同 的空间排列叫做不同的构型。这两种构型 如果没有共价键的破裂是不能互变的。 构象（conformation）：是指取代基团 当单键旋转时可能形成的不同的立体结构 。这种空间位置的改变并不涉及共价键的 破裂。 （二）维持蛋白质构象的作用力 R基团间的相互作用及稳定蛋白质三维构象的作用力 a.盐键 b.氢键 c.疏水键 d.范得华力 e.二硫键 多肽链 三、蛋白质的二级结构 蛋白质的二级结构（secondary structure）指肽链主链不同区段通过自 身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘 旋折叠而形成的局部空间结构，是蛋白质 结构的构象单元。 （一）肽单元 参与肽键的6个原子C1、C 、O、N、H、C2位于同一平面 ，C1和C2在平面上所处的位 置为反式(trans)构型，此同一 平面上的6个原子构成了所谓的 肽单元 (peptide unit) 。 酰胺平面与-碳原子的二面角（ 和 ） 二面角 两相邻酰胺平面之间，能以共同的C为定点而旋转， 绕C-N键旋转的角度称角，绕C-C键旋转的角度称角 。和称作二面角，亦称构象角。 当或旋转使旋转健两侧的主链原子处于顺式构型时， 规定=0，或=0。 从C沿健轴的方向观察，顺时针旋转的和角度为（+ ），逆时针时旋转的为（-）。 完全伸展的多肽主链构象 -碳原子 酰胺平面 =1800，=1800 =00，=00的多肽主链构象 酰胺平面 =00，=00 侧链 非键合原子 接触半径 () 螺旋（helix） () 折叠（-pleated sheet） () 转角（-turn） () 无规则卷曲（nonregular coil） （二）蛋白质二级结构的构象单元 特征：1、 每隔3.6个AA残 基螺旋上升一圈，螺距 0.54nm;相邻两个氨基酸残 基平移距离为0.15nm。 2 、 螺旋体中所有氨基 酸残基R侧链都伸向外侧， 链中的全部C=O 和N-H几 乎都平行于螺旋轴; 3、每个氨基酸残基的 N-H与前面第四个氨基酸残 基的C=O形成氢键，肽链 上所有的肽键都参与氢键的 形成。 螺旋（helix） 形成因素：与组成和排列顺序直接相 关。由于脯氨酸的亚氨基参与形成肽键后 ，氮原子上已没有氢原子，无法充当氢键 供体，致使螺旋中断，产生一个“结节”。 如果肽段内带有相同电荷的残基过于密集，彼 此由于同性电荷的排斥，妨碍链内氢键的形成 。也会导致螺旋中断。 折叠（-pleated sheet ） 特征：两条或多 条伸展的多肽链 侧向集聚，通过 相邻肽链主链上 的N-H与C=O之间 有规则的氢键， 形成锯齿状片层 结构，即折 叠片。 类别： 平行：N端在同一方向。 =-119，=+113 反平行：N端一顺一反交替排列。 =-139，=+135 转角（-turn） 特征：多肽 链中氨基酸 残基n的羰基 上的氧与残 基（n+3）的 氮原上的氢 之间形成氢 键，肽键回 折1800 。形 成10个原子 组成的环。 无 规 则 卷 曲 示 意 图 无规则卷曲 细胞色素C的三级结构 超二级结构 (super-secondary structure) 在蛋白质分子中，特别是球状蛋白质 中，由若干相邻的二级结构单元（即 螺旋、折叠片和转角等）彼此相互 作用组合在一起，形成有规则、在空间 上能辨认的二级结构组合体，充当三级结 构的构件单元，称超二级结构。 超二级结构类型 1 2 3 4 5 5 2 3 4 1 -迂回 回形拓扑结构 -迂回 结构域 (structure domail) 是在二级结构和超二级结构基础上形成并相 对独立的三级结构局部区域，是空间结构上 能辨认的三维实体。 结构域有三种不同而又相互联系的涵义: 1、独立的结构单位 2、独立的功能单位 3、独立的折叠单位。 蚯蚓血红蛋白中四个- 螺旋组成的结构域 两个铁原子 六、 球状蛋白质与三级结构 三级结构（ tertiary structure ）是指球状蛋 白质的多肽键在二级结构的基础上，通过侧链 基团的相互作用进一步卷曲折叠，借助次级键 维系使-螺旋、-折叠、-转角和无规则卷曲 等二级结构相互配置而形成特定的构象。 三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空 间上的重新排布。 -螺旋 特征： 含多种二级结构单元； 有明显的折叠层次； 是紧密的球状或椭球状实体； 分子表面有一空穴(活性部位)； 疏水侧链埋藏在分子内部， 亲水侧链暴露在分子表面。 抹香鲸肌红蛋白（Myoglobin）的三级结构 核糖核酸酶三级结构示意图 N His12 C His119 Lys41 七、蛋白质的四级结构 四级结构(quarternary structure)指由相同或不同的 称作亚基（subunit）的亚单位按照一定排布方式缔合 而成