gfp作为报道基因在研究wt1基因调控元件中的应用(1)

GFPGFP 作为报道基因在研究作为报道基因在研究 WT1WT1 基因调控基因调控 元件中的应用元件中的应用(1)(1) 作者：胡绍燕 陈子兴，赵晔，傅铮铮，何军，岑建 农，谷敏 【摘要】 本研究调查 EGFP 基因作为报道基因在研 究 WT1 基因调控功能中应用的可行性。利用基因重组技术 分别将 WT1 基因启动子和增强子的功能片段构建到质粒 pEGFP1 载体中，转化感受态菌细胞，筛选了阳性转化菌 落，通过限制性酶切鉴定重组质粒插入片段正确的菌落， 抽提重组质粒 DNA；同时将重组质粒转染 K562 细胞，通过 荧光显微镜检测重组质粒的功能。结果表明：通过基因重 组技术分别构建了含有 WT1 基因启动子的载体（pEWP）和 含有 WT1 基因启动子和增强子的载体（pEWPE、pEWPA 和 pEWPD） 。转染 48 小时后，pEWP、pEWPE、pEWPA 和 pEWPD 的 K562 细胞在荧光显微镜下能够显示荧光，而转染了空载 体 pEGFP1 的 K562 细胞未出现荧光。结论：EGFP 基因作 为报道基因可以用于 WT1 基因调控功能的研究，为进一步 开展基因治疗创造了条件。 【关键词】EGFP；WT1 基因；启动子；增强子；K562 细胞 ApplicationofEGFPasReporterGeneinStudyofWT1Regulati onElements AbstractInordertoinvestigatethefeasibilityofusingEG FPasareportergeneinWT1transcriptionalregulationstud y.WT1promoterandenhancerwereligatedintothevectorpEG FP1byrecombinantDNAtechniqueandconfirmedbyrestric tionenzymesdigestion.Theresultantconstructsweretran sfectedintoK562celllinebyDMRIECreagentandthefunct ionoftheseWT1geneelementswasdetectedbyusingafluores centmicroscopeaftertransfectionfor48hours.Theresult sindicatedthattherecombinantvectors,pEWPcontainingW T1promoter,andpEWPE,pEWPAandpEWPDharboringbothWT1en hancerandpromoter,hadbeensuccessfullyconstructed.Fl uorescencewasobservedinK562cellstransfectedbypEWP,p EWPE,pEWPAandpEWPD,whilenofluorescencecouldbedetect edincellstransfectedbypEGFP1.ItisconcludedthatEGF PgeneasareportergenecanbeappliedtotheWT1transcripti onalregulationstudy,whichprovidesthebasisforgenethe rapy. KeywordsEGFP;Wilmstumorgene;promoter;enhancer;K56 2cell WT1 基因是一个参与转录调控的双相调节子，它与各种 造血调控因子相互作用，在白血病发病过程中起重要作用。 近十几年的研究证实，80-90的急性白血病中 WT1 基因 高表达1，2 ，且随着病情的进展表达增高，被认为是一 种“泛白血病”标志3 ，有可能成为白血病基因治疗和 特异性免疫治疗的新靶点。绿色荧光蛋白 （greenfluorescentprotein，GFP）基因及其载体是近年 来研究活细胞中基因表达和蛋白定位的新型报道基因，已 成功表达于多种原核生物和真核生物4 。 本研究将 WT1 基因启动子、增强子片段连接到携带突 变型绿色荧光蛋白报道基因而自身无启动子、增强子的载 体 pEGFP1 中，通过检测瞬时转染后 K562 细胞的荧光强 度以确定重组载体用于研究 WT1 基因转录调控功能的可行 性，进而为研究 WT1 启动子和增强子用于白血病的基因治 疗奠定基础。 材料和方法 主要材料 携带 WT1 启动子和增强子的质粒（-）由美国 FraizerGC 博士惠赠；pEGFP1 载体购自 BectonDickinsonBiosciences 公司。E.coliDH5 为本实 验室保存。琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒为 Qiagen 公司产品； T4DNA 连接酶和限制性核酸内切酶 BamH、Hind、Pst、Sal、Not、Hpa为 MBI 公 司产品，Afl和 Stu为 TaKaRa 宝生物工程（大连）有限 公司产品；小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）为 Promega 公司产 品；Klenow 片段为上海华美生物公司产品；PEG8000 为上 海生工公司产品。蛋白酶 K、DNA 分子量标准 /Hind、100bpDNALadder、100bpDNAplusLadder、pUC1 9/Msp购自 MBI 公司。卡那霉素、Xgal 和 IPTG 为 Sigma 公司产品。脂质体 DMRIEC 为 Invitrogen 公司产品。 荧光显微镜为 LeicaQ550CW 型。 重组载体构建 WT1 基因启动子的构建取 2g（-）进行 Hind/Pst 双酶切，反应产物经%的琼脂糖凝胶电泳，切下 WT1 基因启 动子片段，按琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒按说明书纯化凝 胶中的 DNA 片段。WT1 启动子与经过 Hind/Pst双酶切 的 pUC18 载体连接、测序，证实 WT1 基因启动子序列正确。 再将 WT1 启动子与经过 Hind/Pst双酶切的 pEGFP1 载 体连接。 WT1 基因增强子的构建取 20g（-）进行 BamH酶切， 纯化的 DNA 片段与 pUC18 质粒连接、测序。将切下的 WT1 增强子片段分别插入载体 pEWP 的不同位点（MCS 多克隆位 点，Not位点和 Afl位点） ，通过粘端连接将 WT1 增强子 与经 BamH酶切后的 pEWP 连接，使 WT1 增强子连接到 pEWP 的多克隆位点上，通过平端连接将补平后 WT1 增强子 分别连接到补平且去 5磷酸化的 pEWPAfl位点和 Not 位点上实现。 细菌转化 利用电穿孔技术将上述重组质粒转化到 DH5 感受态 细胞中，取 250l 的电击转化细菌铺于含 30g/ml 卡那 霉素的 LB 培养基的琼脂板上，37倒置培养 16-20 小时。 挑取阳性菌落扩大培养后，提取质粒进行酶切鉴定。 细胞培养与转染 白血病细胞株 K562 细胞于 37、5%CO2、饱和湿度培 养箱中培养。含体积分数 15%胎牛血清（FCS） （杭州四季青 公司）的 RPMI1640（Gibco/BRL）完全培养液进行常规培养。 将 l 的 DMRIEC 脂质体稀释于 100lOPTIMEM 无血清 培养液中，同时取另 1 份 100lOPTIMEMI 无血清培养液 稀释 g 重组质粒，5 分钟后将二者混合，室温放置 45 分 钟以形成 DNA脂质体混合物。用 OPTIMEM 无血清培养液 调整 K562 细胞浓度，使其达到 8106/ml，每孔加入 50l（相当于 4105 细胞） ，再将 DNA脂质体混合物滴 入，5 小时后补充 40l 胎牛血清和 1mlRPMI1640 完全培养 液继续培养。于 48 小时用 LeicaQ550CW 荧光显微镜在 FITC 滤光镜激发下观察细胞的荧光强度。 结果 WT1 基因启动