《灭菌技术》PPT课件.ppt

第三章 灭菌技术 【本章学习的目的和要求】 1.了解培养基灭菌的原理；了解发酵培养液的无 菌检查方法；了解空气除菌的原理。 2.熟悉空气过滤除菌的流程和常见设备无菌。 3.掌握常用的灭菌方法和原理；掌握培养基分批 灭菌和连续灭菌的操作流程；掌握发酵用空气的 质量标准。 Date1 第一节 灭菌 灭菌是指用物理的或化学的方法杀灭或除 掉物料及设备中一切有生命的有机体的技 术或工艺过程。 一、常用灭菌方法的基本原理 （一）化学物质（药剂）灭菌 化学药剂适用于生产车间环境的灭菌，接 种操作前小型器具的灭菌等。 常用的化学药剂介绍如下： Date2 1乙醇 70%-75%乙醇溶液杀菌作用最强 2甲醛 将甲醛溶液（37%）直接加热， 按18ml/m3计算用量 3新洁而灭 0.25%的溶液 4石炭酸3%-5%的水溶液 (二)辐射灭菌 紫外线波长在240-300nm范围内 （三）干热灭菌 一般要求160-170，保温1-2h 。 Date3 灭菌温度（）灭菌时间（min） 17060 160120 150150 140180 121过夜 表4-1 干热灭菌所需温度和时间 Date4 (四)湿热灭菌 一般的湿热灭菌条件为121，30min （五）过滤除菌 二、培养基的灭菌 目前在工业生产中培养基的灭菌通常采用 湿热灭菌法，包括实罐灭菌（实消）、连 续灭菌（连消）两种方法 Date5 灭菌温度（ ） 灭菌时间(min)培养基营养成分破 坏量（%） 10040099.3 1103067 1151550 120427 1300.58 1400.082 1500.011 表4-2 不同灭菌条件下对培养基营养 成分破坏的情况 Date6 （一）微生物的死亡速率与理论灭菌时间 1微生物的热阻 致死温度:杀死微生物的极限温度。 致死时间:在致死温度下，杀死全部微生物 所需要的时间成。 在致死温度以上，温度越高，致死时间越 短。 Date7 热阻:是指微生物在某一特定条件（主要是温度 和加热方式）下的致死时间。 相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间 与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。 表4-3 微生物对湿热的相对抵抗力 微生物名称细细菌芽孢孢霉菌孢孢子病毒大肠肠杆菌 相对对抵抗力31062-101-51 Date8 表4-4 在不同温度下的湿热灭菌杀死芽 孢所需要的时间 温度（）时间时间 （min） 1001200 110180 11530 12115 1256.5 1302.5 1400.9 Date9 2微生物的热死规律对数残留定律 微生物热死是指微生物受热失活直到死亡。微生 物受热死亡主要是由于微生物细胞内酶蛋白受热 凝固变性所致。 在培养基进行湿热灭菌时，微生物受热后，其死 亡细胞的个数变化与化学法反应的浓度变化一样 ，遵循一定的规律，培养基中的微生物受热死亡 的速率与任一瞬间残存的微生物数量成正比，这 就是“对数残留定律”，用下式表示： dN/dt= - kN （4-1） 式中 N培养基中残存活菌数 t 受热时间，min k 反应速率常数(又称比死亡速率常数)，min- 1；与灭菌温度、菌种特性有关 Date10 Nt=N0e-kt 式中N0灭菌开始时原有的菌数，个； Nt 灭菌结束时残留的菌数，个。 根据上述的对数残留方程式，如果要求达到彻底灭菌， 即Nt=0,则所需的灭菌时间t为无限长，这在实际生产中 是不可行的，因此实际设计时，常采用Nt=0.001（即在 1000批次灭菌中只有1批是失败的）。如以残留菌数的对 数与灭菌时间t的实测数在半对数坐标纸上绘图，得出的 残留曲线为一直线其斜率的绝对值为比死亡速率常数k。 Date11 4-5表121下，不同细菌芽孢的k值 细细菌名称K值值/ min-1 枯草芽孢孢杆菌3.8-2.6 硬脂嗜热热芽孢孢杆菌FS15180.77 硬脂嗜热热芽孢孢杆菌FS6172.9 产产气梭状芽孢孢杆菌PA36791.8 Date12 （二）培养基的分批灭菌（实罐灭菌、实消 ） 1培养基预热 灭菌时，培养基需要先加热到80- 90，然后再导入蒸汽升温到120-130进行灭菌 。预热的方法是：先将各排气阀门打开，将蒸汽引 入夹套或蛇管进行预热，待罐温升到80-90，将 排气阀门逐渐关小。 预热的目的：一是防止直接导入蒸汽时由于培养基 与蒸汽的温差过大而产生大量的冷凝水使培养基稀 释，二是防止直接导入蒸汽容易造成泡沫急剧上升 而引起物料外溢。 Date13 2培养基灭菌 当罐温升到80-90时，将蒸汽从进气口、 排料口、取样口直接导入罐内、使罐温上 升到120-130，保温30min。 灭菌时应注意：各路蒸汽进口要畅通，防 止逆流；罐内液体翻动要剧烈，以使罐内 物料达到均一的灭菌温度；排气量不宜过 大，以节约蒸汽用量。 Date14 图4-1 实罐灭菌设备示意图 Date15 3冷却 待灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气 以保持罐压，然后打开夹套或蛇管冷却水 冷却，以避免罐压迅速下降，产生负压而 抽吸外界空气。 注意：在引入无菌空气前，罐内压力必须 低于过滤器压力，否则培养基（或物料） 将倒流入过滤器内。 Date16 （三）培养基的连续灭菌（连消） 培养基配 料 配料 罐 预热 桶 加热 器 维持 罐 冷却 器 发酵 罐 加入灭菌的 培养基 连消泵 Date17 1连续灭菌工艺的特点 （1）在较高的温度和较短的时间内灭菌，营养 成分破坏的少； （2）发酵罐非生产占用时间缩短，容积利用率 提高； （3）热能利用合理，适于实现自动化控制； （4）不适用于粘度大或固形物含量高的培养基 灭菌； （5）增加了一套连续灭菌装置，操作环节增多 ，从而增加了染菌的机率。 Date18 2连续灭菌操作步骤 （1）配料 （2）培养基预热 在预热桶内，一般可先 将培养基预热到70-90。 （3）加热使料液温度在较短的时间（20- 30s）内迅速达到灭菌温度，连续灭菌的温 度一般以126-132为宜，加热采用的蒸汽 压力一般为4.5-8105Pa，加热器有塔式 和喷射式两种。 Date19 （4）保温（维持） 图3 维持罐结构 Date20 （5）降温 （40-45） 图4 喷淋冷却器 Date21 三、空罐灭菌与发酵附属设备及管路的灭菌 （一）空罐灭菌（空消） 空罐灭菌即发酵罐罐体的灭菌。空罐灭菌一般维 持罐压1.5105-2.0105Pa、罐温为125-130 、时间为30-45min。灭菌时要求总蒸汽压力不低 于3.0105-3.5105Pa、使用压力不低于 2.5105-3.0105Pa。 Date22 （二）发酵附属设备的灭菌 发酵附属设备有总（分）空气过滤器、管道、计 量罐、补料罐、消沫系统等。 1.糖水罐的灭菌 一般糖水罐灭菌时罐压为 1105 Pa，保温时间为30min。 2.油（消沫剂）罐的灭菌 油（消沫剂）罐灭 菌时的罐压为1.5105-1.8105 Pa，保温时间 为60min。 3.总（分）空气过滤器的灭菌 维持压力1.74105 Pa，灭菌时间2h。 4.管道的灭菌 管道灭菌时的蒸汽压力不应低于 3.4105Pa，保温时间为1h。 Date23 第二节 空气除菌 一、空气的过滤除菌 （一）空气过滤除菌的原理 1绝对过滤 绝对过滤所用介质的孔隙小于营养细胞和孢子， 能将微生物阻留在介质的一侧，从而获得无菌空 气。如用聚四氟乙烯或者纤维素酯材料做成的微 孔滤膜（孔径在0.22m）。 2深层介质过滤 Date24 图4-5 带微粒空气围绕一圆柱形纤维流动的模型 （引自熊宗贵 发酵工艺原理，2003） 深层介质过滤所用介质( 如棉花、玻璃纤维等)孔 隙大于微生物，例如， 空气中微粒的直径dp一 般为0.5-10m，而作为 过滤介质的棉花纤维直 径dt在16-20m，玻璃 纤维直径dt在5-19m， 同时，纤维之间存在着 较大空隙，（在50m左 右），那么纤维是如何 捕集空气中的微生物粒 子呢？ Date25 主要有以下几种机理： 微粒随气流通过滤层时，过滤层具有一定的厚度 ，滤层纤维所形成的网格阻碍气流前进，迫使气 体在流动过程中产生无数次改变气流速度大小和 方向的绕流运动，这些改变引起微粒对滤层纤维 产生惯性冲击、重力沉降、拦截、布郎扩散、静 电吸附等作用而将微粒滞留在纤维表面。同时因 为滤层是由无数单纤维层组成，所以就增加了捕 获微粒的机会。 Date26 图4-6 除去液滴或颗粒的纤维工作原理 图4-6 除去液滴或颗 粒的纤维工作原理 在上述五种除菌机制 中，截留和静电吸附 作用不受外界影响， 而其他三种机制遇空 气流速直接相关。一 般认为惯性冲击、拦 截、布朗扩散截流的 作用较大，如图4-6所 示。而重力沉降和静 电吸附的作用较小， 但最终的结果是几种 作用的综合效应。 Date27 （二）空气过滤介质 常用的过滤介质有棉花（未脱脂）、颗粒 状活性炭、玻璃纤维、超细玻璃纤维纸、 石棉滤板、烧结材料。 常用的滤膜有：新型绝对过滤介质可 耐蒸汽灭菌的膜材料PVDF（聚偏氟乙烯） 和PTFE（聚四氟乙烯）以及尼龙膜等，增 加了灭菌效果。 Date28 （三）空气过滤器 表4-6几种过滤器的适用条件及性能比较 过 滤 器 类 型 适 用 条 件 及 性 能 传统过滤 棉花、活性炭 可以反复蒸汽灭菌、但介质经灭 菌后过滤 效率降低，拆装劳动 强度大， 环保条件差。活性炭对油雾的吸附效果较好，可作为总过滤 汽用 于去除油雾、灰尘、管垢和铁锈 等。 维尼纶 无需蒸汽灭菌，靠过滤 介质本身的“自净”作用。要求有一定的填充密度 和厚度，管路设计 有一定的要求，介质一旦受潮容易失效。可作为 总过滤 器及微孔滤膜过滤 器的预过滤 。 超细玻璃纤 维纸 可蒸汽灭菌，但重复次数有限，拆装不便，装填要求高，可作为终过滤 器，但不能保证绝对 除菌。 金属烧结 材料 耐高温。可反复蒸汽灭菌，过滤 介质空隙在1030m，过滤 阻力小，可 作为终过滤 器，但无法保证绝对 除菌。 新型过滤 器 硼硅酸纤维 亲水性，无需蒸汽灭菌，95%容尘空间，过滤 精度1u，介质受潮后处理 能力和过滤 效率下降；适合在无油干燥的空压系统中，作为预过 滤器、除尘、管垢及铁锈 等；过滤 介质经 折叠后制成滤芯，过滤 面积大，阻力小，更换方便，容尘空间大、处理量大 聚偏氟乙烯 疏水性，可反复高压蒸汽灭菌，容尘空间为 65%，过滤 精度0.10.01u； 可以作为无菌空气的终端过滤 器；过滤 介质经 折叠后制成滤芯过 滤面积大、阻力小、更换方便 聚四氟乙烯疏水性，可反复高压蒸汽灭菌，容尘空间为 85%，过滤 精度0.01u，可 100%除去微生物；可以作为无菌空气的终端过滤 器，无菌槽、罐 的呼吸过滤 器及发酵罐尾气除菌过滤 器；过滤 介质经 折叠后制成 滤芯过滤 面积大、阻力小、更换方便 Date29 二、发酵用空气的质量标准 生物浓度104个/m3作为空气的污染指标 发酵用无菌空气，就是将自然界的空气经过压缩 、冷却、减湿、过滤等过程，达到以下标准： 1连续提供一定流量的压缩空气。 2空气的压强（表压）为2105-4105Pa，压 强过低不利于克服发酵罐中的下游阻力，压强过 高，则是浪费能源。 3空气在进入过滤器前，相对湿度70%。这是 为了防止空气过滤器过滤介质受潮，影响过滤效 果。 Date30 4进入发酵罐的空气温度可以比培养温度 高10-30。 5压缩空气的洁净度，在设计空气过滤器 时，一般指标取失败概率为10-3，也可以 把100级作为无菌空气的洁净指标。100级 指每立方米空气中，尘埃粒子数最大允许 值0.5m的为3500个/m3，尘埃粒子数最 大允许值5m的为0个/m3；微生物最大 允许值为5个浮游菌，1个沉降菌/m3。 Date31 图4-7 空气净化设备系统流程图 1-粗过滤器；2-压缩机；3-贮罐；4，6-冷却器；5-旋风分离器；7- 丝网除沫器；8-加热器；9-空气过滤器 Date32 一般把这个流程中空气进入空气过滤器以前的部 分称为空气预处理阶段。下面我们将预处理阶段 的设备简单介绍如下： 1采风塔 采风塔应建在工厂的上风口，远离 烟囱。采风塔越高越好，至少10m，设计气流速 度8m/s左右 2粗过滤器 过滤介质可采用泡沫塑料（平板 式）或者无纺布（折叠式），设计流速为0.1- 0.5m/s。 3空气压缩机 Date33 4空气贮罐 5冷却器 6汽液分离设备 （1）旋风分离器 旋风分离器是利用离心力沉 降进行汽-液或汽-固沉降分离的设备。主要除去 空气中较大的雾滴（油、水），可以除去空气中 绝大多数的20m以上的液滴。 （2）丝网除沫（分离）器 丝网分离器是利用 惯性拦截的原理来进行汽液分离的设备。主要分 离空气中较小的雾滴（1m以上），去除率约为 98%。 7空气加热设备 Date34 Date35 Date36 1、 高空采风、两次冷却、两次分油水、 适当加热流程 特点特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加：两次冷却、两次分油水、适当加 热。空气第一次冷却到热。空气第一次冷却到30303535，第二级，第二级 冷却至冷却至20202525，经分水后加热到，经分水后加热到3030 3535，因为温度升高，相对湿度下降。，因为温度升高，相对湿度下降。 Date37 2 2、冷热空气直接混合式空气除菌流程、冷热空气直接混合式空气除菌流程 特点特点 ：省去一级冷却和分离设备及空气再加：省去一级冷却和分离设备及空气再加 热设备，简化了流程，使冷却水用量也降低了热设备，简化了流程，使冷却水用量也降低了 。压缩空气从贮罐出来分两路，一部分进冷却。压缩空气从贮罐出来分两路，一部分进冷却 器，经分