第八章细胞信号传导与遗传毒物作用机制

p216 第八章细胞信号转导与遗传毒物作用机制 在多细胞生物体内细胞通过相互间的信息交流以调节它们的发育和组合，控制它们 的生长和增殖，协调它们的代谢和功能。细胞接受细胞内外的生理性和非生理性信号而 产生应答和反应，以调节它们的行为和命运。近年来，有关细胞间的通讯和细胞信号转导 通路的研究有长足发展，已知细胞信号转导紊乱和障碍是许多病理状态和疾病的重要发 病机制。越来越多的研究结果证明，细胞信号转导也是许多遗传毒物作用的切入部位。 自遗传毒物接触细胞开始，细胞信号转导通路即被卷入。紫外线可诱发细胞表面受体的 聚簇和内吞，激活 SRC 和应激信号通路。我们的实验室也证明，烷化剂甲基硝基亚硝胍 可诱发细胞表皮生长因子受体和肿瘤坏死因子受体的细胞表面受体的聚簇和内吞，激活 细胞应激信号通路和 cAMP 一蛋白激酶 A 一转录因子 CREB 通路。虽然这些改变在遗传 毒物引起的细胞突变形成的作用目前还不能作出结论，但无疑是非常值得探索的课题；大 部分遗传毒物在体内都需经代谢活化，而这些有关的药物代谢酶的表达受外来化合物的 影响。目前所知，与之有关信号通路与核受体如多环芳烃受体(AhR)和某些孤儿受体 (orphan receptor)有关；经典的认识认为，遗传毒物的作用主要是通过它对细胞 DNA 的攻 击而最终诱发细胞突变。不仅现已知晓 DNA 损伤本身就是激活有关细胞信号转导通路 的信号，而且也知晓突变并不是全部起源于直接的 DNA 损伤。体细胞超突变(somatic hypermutation)就是通过细胞表面免疫球蛋白构成的受体而驱动基因突变的一个最明确 的例子。即使在 DNA 受攻击过的细胞(在细菌也如此)中，突变还可发生在未直接受攻 击的碱基部位，即非定标性突变(nontargeted mutation)。已经证明，它的发生依赖于由 细胞信号转导通路介导的基因表达改变；遗传毒物引发的基因突变构成它的致癌活性的 基础，细胞的恶性转化是癌基因和肿瘤抑制基因突变积累的结果。许多野生型癌基因和 肿瘤抑制基因编码蛋白，实际上就在细胞增殖、分化和运动调控有关的细胞信号转导通路 中起信号蛋白的作用；若把致畸物也包括进来的话，可以说细胞信号转导通路是现代研究 致畸物作用机制的基础。因为已知细胞分化和胚胎发育的进程，是由不同的活性因子在 细胞分化和胚胎发育不同阶段诱导的结果，因此致畸物的作用实质上是干扰了有关的细 胞信号转导通路。由此可见细胞信号转导通路与遗传毒物作用的关系是何等密切。由于 传统的遗传毒理学对此很少涉及，而细胞信号转导通路研究的进展又是如此神速，因此本 章将首先尽可能结合遗传毒物的作用机制对主要的细胞信号转导通路作一概述，使读者 对此有一个基本概念，然后阐述某些遗传毒物作用环节中的细胞信号转导通路的研究现 状。 第一节细胞信号转导概论14 动物细胞间的信息交流细胞通讯(cell signaling)，在紧密接触的细胞间可以直接 通过间隙连接(gap junction)进行信号分子的直接交换或者通过膜结合信号分子进行信号 p217 的传递。在有一定距离间隔的细胞间的通讯，则通过细胞分泌的信号分子完成。非紧密 接触的细胞间通讯都是由靶细胞的特异性蛋白受体与信号发放细胞分泌的细胞外信号分 子相互作用进行，并在靶细胞内诱发一连串级联反应(cascade)最终导致靶细胞的应答反 应。 亲水性信号分子，如大部分激素、局部化学介质和所有已知的神经递质，这些信号分 子都不能直接通过细胞质膜的脂质双层进入信号接受细胞，而作用在后者表面的特异性 受体蛋白并发挥信息传递作用；疏水性信号分子，如甾类激素、甲状腺素等，则可直接通过 质膜的脂质双层进入细胞，而与细胞内特异性受体蛋白发生作用。疏水性的前列腺素则 为例外，它同细胞表面受体结合而触发迅速发生的短效反应。 一、间隙连接细胞间信号传递5,6 间隙连接(gap junction)是间隙连接细胞间信号传递(gap junction intercellular com munication，GJIC)的结构基础，它分布于上皮、 神经元突触、平滑肌、心肌等细胞间。连接处的 邻接两细胞的并列质膜间有 23nm 的间隙，其 间有许多在质膜表面排列成片的跨膜蛋白颗粒 横架，在每一颗粒周围有呈正六角形排列的另 6 个颗粒。跨膜蛋白颗粒是中央为直径约 2nm 的 通道，它由邻近两个细胞各自的称为连接子 (connexon)的间隙连接亚单位组成(图 81)。 连接子由 6 个穿膜的连接蛋白(connexin，CX)分 子围成。在小鼠已克隆了 14 个 Cx 基因。在其 他脊椎动物虽然还未获得小鼠的直向同源基因， 但也已克隆了至少 6 个 Cx 基因。因此，脊椎动 物的 Cx 基因看来已超过了 20 个，而人和小鼠 的有关基因分布在包括 X 染色体在内的至少 4 条染色体上。根据序列相似性，把它们分 为 和 两组。除一些主要在神经元中表达的、在结构上与 和 两组都不相似的以外， 它们的编码区都包含在一个外显子中，在其 5非翻译区中有 l2 个内含子。其编码多肽 有 4 个跨膜区，2 个胞外环，1 个胞内环和胞内的氨基和羧基末端。CX 可与相同类型或 不同类型的 CX 聚合形成同源(homomeric)或异源聚合(heteromeric)连接子。由于细胞 间通道跨越两个细胞膜，邻接的细胞可提供不同类型的连接子，因此可生成各种同型(h0 motypic)、异型(heterotypic)或异源细胞间通道。再加上已知至少有 20 个 CX 编码基因， 这样就可形成在结构上和生理功能上非常不同的细胞间通道。 以往都认为通过间隙连接交流的信号分子是无选择性的，各种小于 1200 Da 的分子 都可通透；但根据电压依赖性、pH 敏感性、磷酸化程度和传导性观察，现知细胞间的通透 作用是有连接子依存性差异的。例如由 CX32 组成的同源连接子对 cAMP 和 cGMP 都可 通透，而由 CX32 和 CX26 组成的异源基因连接子只可通透 cGMP 而无 cAMP 通透性。 间隙连接除在代谢协同作用(metabolic cooperation)、电兴奋传递中起重要作用外，在 图 81 间隙连接模式图(引自 White 等6) p218 细胞发育和分化控制中的作用尤为令人注目。在 8 细胞胚晚期就有连接蛋白 CX43 的表 达和间隙连接形成，在桑椹胚至少已有 5 种连接蛋白表达，它对囊胚进一步分化出滋养层 和内细胞团起关键性影响。Cx26 基因剔除(knockout)小鼠在胚胎第 ll 天就死亡，这是 因为间隙连接在经胎盘的营养物质运输中起重要作用。葡萄糖从母体血液至胎儿血液的 转运，需跨越两紧邻的细胞层，合体滋养层细胞 I 和 Il。母体葡萄糖进入 l 型细胞和从 II 型细胞的释放由质膜上的转运蛋白 GLUTl 促进，但它在两合体滋养层细胞间的弥散则 由 CX26 构成的细胞间通道完成。间隙连接功能紊乱和 Cx 基因突变还与多种疾病及遗 传性疾病的发生有关。例如遗传性非综合征性耳聋与 Cx26 基因突变，人类周围神经病 变和 Cx32 基因突变，白内障与 Cx50 基因突变，间隙连接与雌性不育的形成，间隙连接 与正常心肌传导和心脏发育等有关。间隙连接与肿瘤形成也有关系。许多肿瘤和肿瘤细 胞系的间隙连接减少或发生改变；一些致癌物和促癌物也可引起间隙连接细胞间通讯减 弱。也有人企图用上调细胞间通讯来恢复细胞生长控制。有报告称，维甲酸(视黄酸)可 增强间隙连接细胞间通讯和减少细胞生长和转化。将 Cx cDNA 转染肿瘤细胞使之高表 达，证明有功能的间隙连接可抑制一些转化细胞的生长和成瘤率。转染 Cx43、Cx32、 Cx26 和 Cx40 eDNA 并获得表达的细胞，间隙连接细胞间通讯增强，但只有一些连接蛋 白可在体内或体外，引起与其表达水平相关联的细胞生长的抑制。由化学物诱发恶性转 化的小鼠成纤维细胞、大鼠胶质瘤细胞和人的横纹肌肉瘤与其未转化亲本细胞相比，有 Cx43 表达缺陷，在转染了 Cx43 后生长延缓，成瘤率降低；同样，人肝癌细胞和 HeLa 细 胞与其亲本细胞相比，分别缺乏 CX43，在转染相应的 Cx 基因后细胞生长减慢。由此可 见间隙连接、连接蛋白及其编码基因可能是遗传毒物作用的分子靶。 二、细胞胞内和核受体介导的细胞信号转导 除前列腺素外，疏水性信号分子经简单扩散，通过细胞质膜进入细胞。一旦进入细胞 即同位于胞液和核内的相应受体蛋白发生紧密的可逆性结合，并导致受体蛋白构象变化 和核转位(nuclear translocation)。配体与受体蛋白的结合提高后者对 DNA 的亲和力，而 使之结合至核内特殊应答基因启动子(promoter)的反应元件(responSe element)上，发挥 它对有关基因表达的反式激活作用(transactivation)而诱发细胞的特定应答反应。这类 受体蛋白本身就是配体依存性转录因子(1igand dependent transcription activator)并最终 定位于核内，因此统称为核受体。核受体根据结构又可分为甾体激素受体(steroid recep- tor)和视黄类受体(retinoid receptor)。前者的配体为甾体激素，后者的配体为视黄酸(维 甲酸)、甲状腺素和维生素 D 等。通过分子克隆技术，还找到一些同源基因，它们编码与 已知核受体同源的蛋白，但由于发现受体前其配体不明，因此称为孤儿受体(orphan re- ceptor)。核受体在一些疏水性遗传毒物的作用机制中有重要地位，除了环境中的性激素 样污染物的作用可能与有关受体有关外，有些遗传毒物有相应的受体存在，如多环芳烃类 遗传毒物的芳烃受体、强致畸物视黄酸的视黄酸受体，它们都属于核受体。还知晓与遗传 毒物代谢活化有关的细胞色素 P450 的诱导和一些外来化合物的受体都与核受体有关。 有的孤儿受体被剔除后，还将发生严重的发育异常。因而孤儿受体与遗传毒物作用也有 密切关系。 p219 (一)甾体激素受体1，3 脊椎动物甾体激素，如糖类皮质激素、醛固酮、雌激素、雄激素、孕激素等受体的结构 非常相似。它由约 800 个氨基酸组成，回折 形成至少 3 个功能区(domain)，即由 220 250 个氨基酸组成的相对保守的 C 末端配体 结合区，由 70 个氨基酸组成的高度保守的中 央 DNA 结合区和 50 至 500 个氨基酸组成的 N 末端调节区或称转录激活区。甾体激素受 体在与配体结合前以异型寡聚体形式存在， 它含有一受体蛋白分子和两热激蛋白分子、 (HSP70 和 HSP56 各一个分子)。热激蛋白 与受体蛋白结合的部位也在受体的配体结合 区中。甾体激素受体与配体结合后，发生受 体二聚化而形成同型二聚体，引起受体二聚 化的信号来自配体结合区和 DNA 结合区。 在配体结合区和 DNA 结合区中有“亮氨酸 拉链”(1eueine zipper)。样结构序列，它们负责 受体的二聚化。在配体结合区还有核定位信号 nuclear localization signal)序列，核定位信 号还存在于受体蛋白 DNA 结合区近氨基端的由约 30 个氨基酸组成的区域内。受体蛋 白在未与配体结合前不会发生核转位，也不能与特异的反应元件相结合。但配体结合区 缺失的受体可不需配体作用，而自主地完成核转位并激活有关靶基因。当受体与配体结 合后，激素结合区构象发生改变，热激蛋白自复合体解离，受体蛋白分子开始正确折叠并 形成特定蛋白构象而导致核转位的发生。在 DNA 结合区中最引人注目的结构是由其中 一串半胱氨酸残基形成的两个“锌指”结构，后者是转录因子与相应反应元件的 DNA 序 列，即激素反应元件(homlone response element，HRE)结合的分子基础(图 82)。甾体 激素受体的反应元件由反向重复(inverted repeats)序列组成。如糖类皮质激素受体 (GR)、盐类皮质激素受体(MR)、睾甾酮受体(AR)和孕激素受体(PR)的 HRE 的共有序 列为 GGTACA(N)3TGTTCT，是一种不完全回文重复序列，而雌激素受体(ER)的 HRE 为 AGGTCA(N)3TGACCT，则是完全回文重复序列。在 HRE 结构中的 5一和 3一侧各 构成一个半位点(half site)，其间由 3 个不保守的任何核苷酸(N)间隔。GR、MR、AR、PR 虽都能与同一 HRE 特异结合，但其相应配体的生理功能是明显不同的。决定其功能特 异性的因素可能主要不是受体的 DNA 结合特性，而更可能是由受体在不同细胞中的特 异性表达及其表达水平不同，不同受体调节染色质结构改变的能力不同，不同受体与其他 转录调节因子的相互作用，以及靶细胞中激素种类和浓度不同所决定。 甾体激素受体不仅可以促进靶基因的表达，而且也可抑制某些基因的表达，如糖类皮 质激素可抑制 l 型和 IV 型胶原、前阿黑皮素、催乳素、a 一甲胎蛋白等基因的表达，并通过 抑制某些细胞因子的表达而发挥其免疫抑制作用和抗炎作用。甾体激素受体可能通过以 图 82 甾体激素受体结构及其激活示意图 p220 下三种作用机制抑制基因的表达：受体与靶基因中的负激素反应元件(negative hormone response element，nHRE)结合，受体不与 DNA 直接结合而通过蛋白质一蛋白质相互作用 而抑制其他转录因子(如 AP 一 1、NFJcB)的转录激活作用，或受体与通用辅助因子(如 P300 一 CBP)相互作用使其不能与其他转录因子(如 AP 一 1)进行有效的结合而抑制这些转 录因子的转录激活作用。 上述基因组机制(genomic mechanism)，显然不能解释甾体激素的快速作用，如甾体 激素诱发的电生理效应、生长因子及肽激素的释放，以及对细胞增殖和凋亡的作用等 t非 基因组作用” 。通过类固醇类同物结合试验、标记类固醇一牛血清白蛋白复合物结合试 验、共价亲和性标记法、免疫组织化学和各种受体纯化试验等方法对膜受体作鉴定。目前 认为类固醇的膜结合活性可能由核受体相同的或其翻版的膜蛋白，以及其他可与其相互 作用的无关膜蛋白如一种 ATP 酶、钙三醇(calcitri01)受体等实现。许多由肽激素启动 的信号机制也被甾体激素膜作用所激活，包括丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)、JUN 一氨 基末端激酶(JNKs)。还发现肽激素通过其膜受体的信号通路与甾体激素间的“串话， ， (cross talk)。是否由于甾体激素对肽激素受体的直接作用，还有待阐明7。 (二)视黄类受体家族8，9 这类受体包括甲状腺素、视黄酸(RA)及维生素 D 受体、蜕皮素(ecdysone)受体等，皆 有类似于甾体激素受体的结构。视黄酸受体(RAN)的生理性配体为全反式 RA、9 一顺式 RA、及其代谢产物 4 一氧一 RA、3，4 一二脱氢 RA 和 4 一氧一视黄醇。其编码基因的克隆 和鉴定及其初级序列的比较分析显示，它与甾体激素受体有类似结构。已分离到 3 种不 同的 RAR 亚型，RAio、RAR 和 RAR，它们在哺乳类、鸟类和两栖类中都有存在。每一 个基因含有两个启动子从而可生成不同 N 末端和不同剪接变体(splice variant)的同工型 受体。不同 RAR 在发育和成体中以特殊图式表达。另一种视黄酸受体称为视黄类 X 受 体(retinoid X receptor，RXR)代表第二类视黄酸反应性转录因子，它与 9 一顺一视黄酸有 高亲和性，其他活性配体有植烷酸(phytanic acid)和 methoprene。RXR 可促进视黄酸受 体和甲状腺素受体(TR)与 DNA 的结合。也已鉴定了 3 种不同的 RXR(RXR、)。 RXR 可与 RAR、TR、维生素 D 受体(VDR)和孤儿受体形成异型二聚体，从而扩展视黄酸 的潜在生理功能(图 83)。视黄类受体识别 DNA 结合基序，其反应元件的共有序列为 AGGTCA。它可组成直接重复(direct repeat，头对尾重复)、反向重复(inverted repeat,头 对头重复)和反卷重复(everted repeat，尾对尾重复)结构，而在其半位点之间有不同数目 的非特异性核苷酸组成的间隔存在，它决定反应元件与何种受体特异结合。这种非特异 性核苷酸数为 l、2(5)、3,4 时分别可与 RXR 和 PPAR(r 过：氧化物酶体增殖子激活受体)、 RAR、VDR(维生素 D 受体)和 TR(甲状腺素受体)特异结合。视黄酸受体同型二聚体或 异型二聚体的特定组合赋予识别特殊类型的反应元件。根据二聚体中每一个受体蛋白是 否都结合有特异性配体，RXR 和 RAR 可以激活或抑制转录作用。RARRXR 异型二聚 体结合在一定位核小体染色质的表面而有助于阻遏性染色质结构的装配。转录作用的共 阻遏物(cor 印 ressor)有核受体共阻遏物，nuclear receptor corePressor，NcoR)、视黄类和甲 状腺素受体沉默介体(silencing mediator for retinoid and thyroid rec 印 tors，SMRT)，以及结 p221 图 83 核受体的共同结构、功能域及其分类(引自 0lefsk87) 合蛋白如 SIN3 和组蛋白去乙酰酶(histone decetylase，HDAC 一 1)等。配体结合导致受体 二聚体的构象改变而引起与共阻遏物的解离和与共激活物(coactivator)的结合，从而导致 局部染色质结构的酶性解体。视黄类受体的共激活物包括转录中介因子 1(transcription al intermediary factor l，TIFl)、TIF2、甾体受体共激活N-子(steroid receptor coactivator 一 1， SRC 一 1)、CBPcAMP 反应元件结合蛋白(CREB)的结合蛋白 cAMP response element binding protein(CREB)一 binding protein及其同源蛋白 P300 和 SUGTRIPl 等。P300、 CBP 和 P300CBP 结合因子(P300 一 CBPassociated factor，PCAF)使组蛋白乙酰化。核受 体最强的共激活物为 SRC 一 1 和 TIF2。一个 SRCTIF2 辅助因子，视黄类受体激活因子 (activator of retinoid receptor,ACTR)gCBP 和 P-CAF 募集在一起而形成一三聚激活作 用复合体。但它们与细胞的转录机器如何耦联还不清楚。 视黄类受体在肿瘤发生与视黄酸致畸作用中的作用将在下文介绍。 (三)孤儿受体1,10,11 指的是在结构上与核受体超家族成员非常相似，但其配体不明的受体蛋白，在人类已 知有 40 个由不同基因编码的孤儿受体。孤儿受体的克隆开拓了反向内分泌学 reverse endocrinology)的新领域，即先发现受体然后再寻找未知的激素。研究较深入的孤儿受体 家族有过氧化物酶体增殖因子激活受体(peroxisome proliferatoractivatedreceptors， PPARs)、肝 X 受体(1iver X receptors，LXRs)、孕甾烷 X 受体(pregnane X receptor，PXR)、 组成型雄甾烷受体(constitutive androstance receptor，CAR)、法尼醇 X 体(farnesoid X receptor，FXR)、鸡卵白蛋白上游启动子转录因子(chicken ovalbumin upstream promoter transcription factors，COUPTFs)、肝细胞核因子 4(hepatocyte nuclear factor 4，HNF4)等。 孤儿受体的配体除了内源性物质外，不少药物和毒物等外源性化合物也可成为其配体，从 而与它们的生物学和毒理学作用有关。有的孤儿受体还在胚胎发育、细胞分化过程中起 首要作用。 p222 1过氧化物酶体增殖子激活受体(PPAR)家族 PPAR 家族由 3 个相关的基因产物 PPARa、PPAR7 和 PPARp()组成。受体名称的 来由是因为 PPARa 可被在啮齿类动物中引起过氧化物酶体数目和体积增大的化学物质 所激活。这三种受体的组织分布有很大区别，PPARa 在肝、肾、心和肌肉中表达最丰富， PPART 在脂肪细胞、大肠和单核细胞系列细胞中表达最高，而 PPARp()则几乎所有组织 中都有表达。它们与 RXR 形成异型二聚体。降低高甘油三酯水平的药物 fib，ate 是 PPARa 的配体，抗糖尿病药 triazolidinediones(TZDs)则是 PPAR7 的配体，PPAR 的天然 配体，则是生理浓度的各种不同链长和饱和度的脂肪酸，和一些多不饱和脂肪酸的环加氧 酶和脂加氧酶代谢产物。通过 PPAR 调节一系列影响脂蛋白和脂肪酸代谢的基因的转 录。在单核细胞和巨噬细胞 PPARa 和 PPAR7 激活后，抑制炎性细胞因子及其下游炎性 标记物的表达，这些受体的激活在有些细胞中还有调节细胞分化和细胞生长的作用。 2肝 x 受体(LXR)家族 LXR 家族也有多个成员。LXRa 在肝脏中有高丰度表达，它与 RXR 结合成一异型二 聚体而可结合至负责将胆固醇转化为亲水性胆汁酸的胆固醇 7a 一羟化酶编码基因 cyP7A 的启动子中的反应元件上。生理浓度的两个胆固醇氧甾类(oxysteroid)代谢衍生 物 24(S)，25 一环氧胆固醇和 24(S)一羟基胆固醇可与之结合，因此 LXRa 是调节过多的 食饵性胆固醇分解代谢的氧甾类受体。LXRfl 在许多组织中都有表达而且也可为氧甾类 所结合，但它的生理功能不明。 3孕甾烷 X 受体(PXR) 在肝脏和小肠中有选择性表达，它与 RXR 结合成一异型二聚体而结合于细胞色素 P450 3A4 9NIN(CYP3A4)启动子的反应元件上。天然存在的甾体类中最强力的激活物 为 C21 类固醇(孕甾烷)如孕酮的代谢物 5p 一孕烷一 3，20 一二酮，但皮质类固醇和雌激素 也可激活 PXR。许多被广泛应用的药物如抗生素、抗霉菌素、糖类皮质类固醇和抑制素 (statin)类 一羟一 一甲基戊二酸单酰辅酶 A(hydroxy 一 一 methylglutaryl-COA，HMG CC)A)抑制剂等外源性化合物也可激活 PXR。通过对 CYP3A4 基因转录的激活而调节这 些化合物的代谢和灭活，因此 PXP 为外源化合物传感器和类固醇内稳的调节器。 4组成性雄甾烷受体(CAR) CAR 在肝内有丰富的表达，最近证明它是编码类固醇羟化酶的基因 CYP28 的转录 调节因子，因此它在类固醇内稳调节中起作用如同 PXR 那样。CAR 在没有外源性配体 添加时有很强的转录活性，但后者可被睾酮代谢物 3a，5a 雄烯醇和 3a，5a 雄烷醇所阻断。 这种配体介导的受体失活作用，在其他孤儿受体中也常存在。FXR 同 RXR 形成可与 DNA 结合的 FXRRXR 异型二聚体。 5法尼醇 x 受体(FXR) 它虽不能直接与法尼醇(farnesol)结合，但法尼醇和它的代谢产物可激活 FXR-RXR 的 p223 转录激活作用。FXR 还可被合成的视黄酸衍生物 TTNPB 和超生理浓度的全反式视黄酸所 激活。但最近发现 FXR 是生理浓度胆汁酸的受体，鹅脱氧胆酸(CDCA)是最强的激活物。 CDCA 调节参与胆汁酸内稳的许多基因的表达，包括 CYP7A 基因表达的抑制和肠胆汁酸结 合蛋白(ileal bile acid binding protein)编码基因 IBABP 表达的增强。FXF 在胆汁酸循环的组 织，肝、肠和肾中有丰盛的表达，因此它被认为是核胆汁酸受体。 6鸡卵白蛋白上游启动子转录因子(COUPTF)12 COUPTF 与鸡卵白蛋白上游启动子 COUP 元件结合的转录因子的编码基因已在人体 细胞中克隆了两个，分别称为 HCOUP-TFl 和 HCOUP-TFIl。它们的 DNA 结合功能域和臆 测的配体结合区的同源性分别达 98和 96。是进化上十分保守的基因。在胚胎发育过 程中，它们的表达有时空局限性。COUP-TF 定位在发育中的中枢和外围神经系统，以及其 他发育中的器官和组织中。COUPTFI 在小鼠胚胎于 85d 在移行前和移行神经嵴细胞 (premigratory and migratory neural crest cell)中表达，但并无 COUPTFIl；在胚胎 l35d 于随后 发育为大脑皮质的组织中有 COUPTFl 的表达，而 COUPTFIl 则局限于尾侧。在间脑神经 管节 neuromere)中的表达呈节段性分布：COUP-TFl 和 II 在发育为腹侧丘脑和下丘脑的 Dl 区呈高表达而在发育为顶盖前区(pretectal region)的 D6 和 D4 区呈低水平表达，而在发育为 背侧丘脑的 D2 区只有 COUPTFl 表达。在中脑和脊髓等其他神经元区也有 COUP-TFl 和 11 的差异性表达。COUP 一 TF 还在发育过程需要间充质一上皮相互作用的器官的问充质中 表达。COUPTFII 在扩展的静脉窦和延伸的脐静脉和以后在共同心房中表达。在妊娠中 期 COUP-TFII 在额鼻突、感觉器官、呼吸、消化和泌尿等内脏器官中表达，而 COUP-TFI 在 鼻中隔、触须毛囊和舌中表达。发育过程中 COUP 一 TF 的表达图式提示它们对神经元发育 和器官形成是必需的，COUPTFI 在神经元组织中普遍的高水平表达和在内脏的低水平表 达，而 COUPTFIl 则正相反说明它们的生理功能是不同的。在基因剔除小鼠，COUP-TFI 基因缺如鼠，在出生后 8-36h 内由于不能进食而死于饥饿和脱水，只有约 1-2小鼠可 活 3-4 周；而 COUP-TFIl 基因缺如为胚胎致死性的，死于血管和心脏发育缺陷。在基因剔 除小鼠中证明 COUP-TFl 基因对于外围神经系统发育中神经嵴细胞的存活和轴突引导 ax onal guidance)，对中枢神经系统发育中板下神经元(subplate neuron)的分化、轴突引导和皮层 IV 层神经元的存活是必需的，而 COUP-TFIl 基因编码产物则作为转录因子调节血管生成 素 1(angiopoietin l，ANGl)，一种间充质细胞中的促血管形成因子的表达，介导间充质细胞 诱导内皮细胞反应的细胞通讯。 7肝细胞核因子 4(HNF4) 它只在肝脏、肠道和肾脏中表达，并与几种肝细胞特异性基因的反应元件特异地结 合，而提示它与这些器官的组织特异性基因表达有重要作用。在 HNF4 比基因突变小鼠， 突变体胚胎的原肠胚形成和中胚层形成较之正常胚胎晚 24h，并出现严重障碍。约在受 精后 65d 出现外胚层细胞的广泛死亡，并于 85d 后发生胚胎死亡。其关键可能是由于 内脏内胚层的发育障碍。HNF4 在内脏内胚层呈特异性表达，HNF4 缺陷使内脏内胚层 不能表达一些对外胚层细胞存活所必需的因子，从而导致外胚层细胞的广泛死亡及其形 成发生缺陷。 p224 三、细胞表面受体介导的细胞信号转导 水溶性信号分子和某些脂溶性信号分子(如前列腺素)与靶细胞表面的特殊受体蛋白 结合而施予对靶细胞的影响。与各种特异配体相对应的细胞表面受体在质膜上或呈弥漫 性分布或局限于一特殊区域。其数目每细胞自 500 至 100000 个不等。细胞表面受体蛋 白占质膜总蛋白的比例小于 01。同核受体的细胞内受体不同，它本身并不直接调节 基因表达，它仅将细胞外信号分子提供的信号传过质膜。但它又不是简单地把细胞外信 号分子转运至细胞内，而是导致细胞内新的信号分子的激活。细胞信号转导(signal transduction)的原意就是指这种通过膜受体触发的细胞内级联反应而将细胞外信号传递 至胞浆或核内而对它们施加影响，并产生应答反应的过程。但目前这个名词的应用已被 泛化了。由于与特异性受体结合的相应抗体也能诱发正常配体所诱发的反应，因此细胞 外信号分子(配体)与相应细胞表面受体蛋白作用后的直接影响是引起后者的构象变化， 从而触发一系列后继的级联反应。 根据其运行机制，细胞表面受体可分为通道连锁(channel linked)、G 蛋白连锁(G protein linked)和酶促性(catalytic)表面受体。通道连锁的受体就是递质门控离子通道 (transmitter gated ion channel)，在许多电兴奋细胞间快速突触信号传递中起作用；G 蛋白 连锁受体在激活后通过第三者，即 GTP 结合蛋白(简称 G 蛋白)，触发一系列事态发展以 改变一个或多个细胞内信使的浓度。后者转而再作用于其他细胞内靶蛋白；酶促性受体 与配体结合后，直接激活受体本身的或与之密切结合的激酶活性。 (一)离子通道耦联膜受体介导的细胞信号转导1 离子通道耦联膜受体(ion channel linked membrane receptor)按结构可分为三类，第一类 以烟碱型乙酰胆碱受体(nAchR)为代表，包括 一氨基丁酸受体(GABAAR)、甘氨酸受体 (GlyR)和 5 一羟色胺受体(5 一 HT3R)。nAchR 分布于中枢神经系统 和神经肌接头，为兴奋性传导受体，GABAAR 和 GlyR 是中枢神经系 统抑制性传导受体(图 84)。这型受体均由 5 个亚单位组成的异型 多聚体。每个亚单位 N 末端有 1724 个氨基酸组成的信号肽，N 末 端和 C 末端均在胞膜外。每亚单位有 4 个由 20、30 个氨基酸残基组 成的 a 一螺旋跨膜区段(M1M4)，跨膜区之间由长短不一的亲水性 片段分隔。各跨膜螺旋区段两端的荷电氨基酸残基组成离子远近的 口，并成为离子选择性过滤器。 负电荷的氨基酸残基构成而在 GABAAR、GlyR 则由带正电侧链氨基 酸构成，从而分别对 Na+、K+阳离子和阴离子(C1 一)有选择作用。当 配体与受体的配体结合部位作用后，受体构象发生改变，导致离子孔 道的开放，而诱发靶细胞离子的内流并形成电兴奋(nAChR)或抑制(GABAAR)。第二类为谷 氨酸受体，它是中枢神经系统主要的兴奋性传导受体。根据药理学又可分为 N 一甲基一 D 一天冬氨酸(NmethybD-aspartate，NMDA)受体和非 NMDA 受体的红藻氨酸(kainate acid， 图 84 烟碱型乙酰 胆碱受体模式图 P225 KA)受体和使君子酸( 一 aminocyclopentane-l，3 一 dicarboxylate，AMPA)受体。这类受体也是由 多个亚单位构成的多聚蛋白复合体，其亚单位的分子量为 nAchR 的两倍以上，但这类受体 的二级结构尚不清楚。NMDA 受体对阳离子 Ca2+有高通透性，参与许多复杂的生理和病理 机制，如学习和记忆、突触的可塑性、缺血缺氧导致的兴奋性毒性作用、癫痫的形成以及神经 退行性变等。非 NMDA 受体通道仅对 Na+和 K+通透。第三类为 ATP 和 ADP 门控离子通 道受体 P2X，其亚单位只有两个跨膜区，为阳离子非选择性通道。ATP 激活时刻引起 Ca2+和 Na+的内流，对 Ca2+的通透性更大。 （二）G 蛋白耦联膜受体介导的细胞信号转导13 21 G-蛋白耦联受体（G protein-couples receptors，GPCR）迄今已报告了近 2 000 个 GPCR。根据其序列同源性、配体结构和受体功能，它们可分类为 100 个以上亚家族，包 括儿茶酚胺、5-羟色胺、组胺、乙酰胆碱、血管紧张素、神经肽等生物肽和小分子肽的受体 和促黄体激素、促甲状腺激素等分子量较大的激素的受体。有人估计至少有三分之一的 跨膜信号和半数的药物通过此型受体起作用。最近我们实验室证明遗传毒物甲基硝基亚 硝胍可激活由这类受体介导的 cAMP-PKA-CREB 通路的激活。 1G-蛋白耦联受体的结构1315 GPCR 受体都由单一多肽链构成。受体蛋白的 N 末端（7595 氨基酸）在细胞外，C 末端（12359 氨基酸）在细胞内，并反复穿过质膜脂质双层 7 次，每一核心跨膜区段则由 2027 个疏水氨基酸残基组成，其间分别由 5230 氨基酸组成的胞外和胞内环连接。 因此此型受体又称为七次穿越的跨膜受体( seven-pass transmembrane receptor)。G 蛋白 耦联于第、胞内环及（或）C 末端（图 8-5） 。高亲和性配体结合可只限于核心跨膜区 段（如光子、生物胺、核苷、类二十烷酸和脂质性的溶血磷脂酸和磷酸鞘氨醇基团等）或与 核心区段和胞外环结合（40 氨基酸的肽）或与胞外环近 N 末端区段结合（90 氨基酸 的多肽）或只同 N 末端区段结合（30kDa 的糖蛋白） 。配体与受体相互作用可有氢键、 离子配对和疏水性接触等形式。 表 8-1 G 蛋白的 亚单位 亚家族 成员 毒素敏感性 分布 效应器 信使 霍乱毒素 广泛AC，Ca2+通道 CAMP, Ca2+ G olf 霍乱毒素 嗅上皮 AC CAMP il 百日咳毒素 局限 一 AC CAMP i2， i3 百日咳毒 素 广泛 K+通道 电压 ao 百日咳毒素 神经元富集组织 -Ca2+通道 Ca2+ t1，t 2 百日咳毒素 视网膜 千cGMP-PDE gust 味蕾 ? Gii。 z 局限 ? cGMP q, 11 广泛 PLC lP3 ,DAG 14 局限 PLC IP3,DAG Gq11 15,16 造血细胞 十PLC 12 广泛 Na+ /H+交换 Gt2/13 13 百日咳毒 素 广泛 Ca2+流 lP3 ,DAG AC，腺苷酸环化酶；cGMP-PDE，cGMP 依存性磷酸二酯酶；PLC，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶；DAG 二酰基甘 油。 P226 2异型三聚体 GTP 结合蛋白1618 GPCR 受体胞内环耦联的 G 蛋白全称异型三聚体 GTP 结合蛋白(heterotrimeric GTP binding protein)，为由 、 和 三个多肽亚单位构成的异三聚体蛋白。 和 7 亚单位形成 紧密二聚体而 亚单位与 二聚体呈疏松结合。已知所有 a 亚单位(4050kDa)皆同 源，有些 G 蛋白有相同的或非常相似的|3(35kDa)及 7(81Da)亚单位。已克隆了 20 个 a 亚单位，6 个 亚单位和 12 个 7 亚单位基因产物，主要 G 蛋白可分为 Gs、Gio、Gq 和 G12一 G134 个亚家族(表 81)。与 GDP 结合的异型三聚体状态的 G 蛋白为非活性状态，由受 体酶促性鸟核苷酸交换引起 GTP 结合至 a 亚单位时被激活。GTP 结合使 GGTP 与 G解离，并由 GGTP 和游离的 GB，各自激活其下游效应器。G 亚单位将 GTP 水解为 GDP 后 G 一蛋白失活。在 GTP 结合的活性型 GGTP 亚单位形成一新的作用面，它与其 效应器结合的亲和性要比其 GDP 结合状态的高 20100 倍(图 85)。不同的 GGTP 通过这个作用面与其效应器以高度特异性方式相互作用。GsGTP 和 GiGTP 激活或 抑制腺苷酸环化酶、GtGTP 激活 cGMP 依存性磷酸二酯酶、Gq。GTP 激活磷脂酶 C 。近来还发现了一些新的 G 靶蛋白，如 Ga 一相互作用蛋白(Gainteracting protein， GAIP)、RGS 蛋白家族的 GTP 酶激活蛋白，核结合蛋白(nucleobindin)和一个新的 LGN 蛋白等。它们的生理功能有的还不明确。 游离的 G，也是一系列眼花缭乱的蛋白的激活物。G对某些经典第二信使生成的 图 85 GPCR 结构(上)及其介导的信号转导(下)示意图(引自卢建等1和 Heldin 等3) p227 酶，如磷脂酶 CH2 和 B3、腺苷酸环化酶(刺激已激活的腺苷酸环化酶、而抑制腺苷 酸环化酶一工)的活性施加影响；它能募集 一肾上腺素能受体激酶至细胞膜而在那里使 激活了的 一肾上腺素能受体磷酸化；G还是 G 蛋白反应性 K+、Ca2+和 Na+通道如在 心脏和脑中存在的 G 蛋白激活内向整流 K+通道(G protein activated inward rectifier K+ channel，GIRK)的直接激活物。G对一些突触前 Ca2+通道有重要调节作用，可直接与 Ca2+通道的 al 亚单位细胞内工环和 C 末端直接接触而抑制之；它还可直接激活磷脂 酰肌醇 3 一激酶的一个同工酶G反应性磷脂酰肌醇 3 一激酶(G-responsive phos phatidylinositol 3 一 kinase，Pll07)和一些蛋白激酶如 Rafl 蛋白激酶、Bruton 和 Tsk 酪氨 酸蛋白激酶等。G还是 MAP 激酶通路的激活物，可与 Rh0 和 Rac 小 G 蛋白结合。这些 作用构成有关信号转导通路间“串话”的基础。 3激活态 G蛋白的主要效应器(靶酶)1,1618 激活态 G蛋白的主要效应器有： (1)磷脂酶 磷脂酶(phosphatidase or phosphoslipase)有磷脂酶 A2(PLA2)、磷脂 酶 C(PLC)和磷脂酶 D(PLD)，它们又有不同类型如 PLC 有 、 和 三型。受 G 蛋白调 节的磷脂酶有 PLA2 和 PLCt3。PLCt3 有四种同工酶 PLC14，它们既受 Gq 蛋白的 亚 单位调节又受 G。蛋白和其他 G 蛋白的 G 时复合物调节。至少有数十种膜受体如凝血嚅 烷 A2、缓激肽、血管紧张素、组胺、加压素、乙酰胆碱、促甲状腺素、l 肾上腺素受体激动 剂受体等在激活后导致多磷酸肌醇(polyphosphoinositide)的迅速转换。其关键在于 PLC 的激活。后者酶促磷脂酰肌醇一 4，5 一二磷酸(PIP2)的磷酸二酯键的裂解而生成二酰基 甘油(DAG)及 1，4，5 一三磷酸肌醇(IP3)。此反应在受体激活后一秒钟内即发生。至此 信息转导途径遂分为以下两条支路(图 86)。第一，小分子水溶性分子 IP3 作用于细胞 内钙分隔区间内质网一肌浆网胞浆面上的 IP。受体引起有关膜上控门钙通道开放，使胞 浆内 Ca2+浓度提高，并中介一系列应答反应。由于 IP3 迅速由一特异磷酸酶去磷酸化而 形成 IP， ，同时进入胞液的 Ca2+迅速被泵出，因此 Ca2+反应一般是很短暂的。第二，DAG 图 86 GPCR(图中标为 2)经 PLC 一 的细胞信号转导通路(引自 Heldin 等3) 类似经 PLC 一 7 的通路由受体酪氨酸激酶(RTK)介导(图中标为 l) P228 通过 DAG 脂酶及一酰基甘油脂酶的相继作用而自 DAG 释出合成前列腺素和有关脂质 信号分子的前体物质花生四烯酸(AA)。更重要的是 DAG 可激活特异性蛋白激酶，Ca2+、 磷脂依赖性的蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)。DAG 与质膜胞浆侧的磷脂酰丝氨酸 一起与 PKC 结合从而提高 PKC 对 Ca2+的亲和性，使 PKC 在通常低胞液 Ca2+浓度条件 下被激活。但在不少细胞中，PKC 的激活是 DAG 和由 IPs 诱发的钙动员协同作用的结 果。由于 DAG 可被磷酸化而生成磷脂酸酯(phosphatidate)或被裂解为花生四烯酸，因而 PKC 的激活也是很短暂的，通常仅持续数秒钟。PKC 属丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，已知 PKC 有 12 种同工酶，分为经典_型(classical，cPKC)、新型(novel，nPKC)、非典型型(atypi cal，aPKC)和 PKC，它们的分布有组织特异性。PKC 的激活可引起它的靶蛋白(包括一 些转录激活因子)的磷酸化，可能作为 PKC 的靶蛋白甚多，其中包括受体蛋白、酶和内源 性蛋白等。在无细胞体系中，PKC 可使纽带蛋白、微管蛋白、40S 核糖体亚单位 S6 蛋白、 肌球蛋白轻链、与蛋白合成有关的始动因子一 2(initiation factor 2)等发生磷酸化。它可 酶促质膜 Na+一 H+交换蛋白的磷酸化而使之外流，导致细胞内的碱化。PKC 的激活可 引起丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)级联反应，核内转录 因子(MYC、FOS、JUN)的磷酸化。可见 PKC 参与细胞增殖和分化调节。佛波酯类促癌 物可替代生理性 PKC 激活物 DAG 引起 PKC 的转位和持续激活，是这类促癌物作用的一 个重要机制。 (2)腺苷酸环化酶 很多激素和局部化学介质通过激活或抑制腺苷酸环化酶 (adenyl cyclase，AC)控制细胞内 cAMP 浓度而起作用。受体与 AC 在细胞中是相互分离 的。由去垢剂溶解质膜分离而得的肾上腺素受体并无 AC 活性，但将它移植至本身并无 肾上腺素受体的细胞质膜中，它可与接受细胞的 AC 分子相互作用而在肾上腺素存在下 发生活性改变。AC 也是一多成员家族，已证实至少有 9 种同工酶(AC-工ACIX)。它 是一膜结合酶，催化 cAMP 的生成。AC 活性受控于 G 蛋白，Gs对之有激活作用而 Gi则 抑制其活性。Gi 蛋白的 G复合体对它也有调节作用。动物细胞中 cAMP 的生物效应又 通过 cAMP 依赖性蛋白激酶 A(cAMP dependent protein kinase，简称 PKA)中介。后者属 丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，由两个调节亚单位和两个酶促亚单位构成。调节亚单位与两个 cAMP 分子结合后引起的构象变化导致酶促亚单位自复合体介离和激活，从而引起其靶 蛋白(如磷酸化酶激酶、糖原合酶、转录因子 CREB 等)的磷酸化而调节后者的生物活性。 PKA 的作用系将 ATP 的末端磷酸基团转移至靶蛋白中精一精一 X 一丝和苏一 X 共有序 列的丝氨酸或苏氨酸残基上。PKA 的生理性底物有上百个，其中包括磷酸化酶激酶、糖 原合酶、激素敏感脂酶、丙酮酸激酶、酪氨酸羟化酶、磷酸酶抑制因子 1、胆固醇酯水化酶、 乙酰 CoA 羧基化酶、磷酸二酯酶、受磷蛋白(phospholamban)、Ca2+通道蛋白以及转录因 子 cAMP 反应元件结合蛋白(CREB)等。因此 PKA 激