重要病原菌与宿主相互作用分子机制的研究.doc

项目名称：重要病原菌与宿主相互作用分子机制的研究首席科学家：起止年限：2012.1-2016.8依托部门：教育部 上海市科委一、关键科学问题及研究内容本项目将紧密围绕细菌性传染病防控和国家安全（生物反恐）等国家重大需求，以重要胞内病原菌土拉杆菌，结核杆菌和鼠疫菌为模型，系统地研究病原菌和宿主之间相互作用的分子机制，拟重点研究解决以下关键科学问题： 1.胞内病原菌侵入宿主细胞的分子调控机制？2.胞内病原菌在宿主细胞内存活的分子调控机制？ 3.胞内病原菌因子如何干扰宿主细胞的关键信号通路？ 主要研究内容 为了解决以上三个关键科学问题，本项目拟以重要胞内病原菌土拉杆菌，结核杆菌和鼠疫菌为研究对象，系统地筛选发现鉴定与病原菌侵入及胞内存活相关的病原菌致病因子和宿主因子，研究病原菌和宿主的功能非编码rna和蛋白质的相互作用，病原蛋白-宿主蛋白之间的相互作用，及泛素及类泛素化蛋白修饰等如何调控病原菌进入宿主细胞并在胞内存活及相关信号通路的分子机制，具体为以下六方面的研究： 1. 发现和研究与病原菌侵入及胞内存活相关的宿主细胞因子及分子调控机制： 1） 研究一些宿主关键免疫分子对病原菌侵入及胞内存活的调控的分子机制； 2） 筛选与病原菌侵入或存活相关的新的宿主细胞因子并研究其功能机制。 2. 发现和研究与病原菌侵入及胞内存活相关的病原菌因子及分子调控机制： 1） 利用转座子技术筛选和研究与病原菌侵入或存活相关的病原菌致病因子； 2）利用过表达病原菌分泌蛋白组筛选与研究与胞内存活相关的致病因子。 3. 研究非编码rna-蛋白相互作用调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制： 1） 大规模发现病原菌和宿主新的非编码rna； 2）构建非编码rna-蛋白相互作用网络； 3）研究非编码rna-蛋白相互作用调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制 4. 研究病原-宿主蛋白相互作用调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制： 1） 筛选和文献挖掘病原菌-宿主相互作用蛋白； 2） 构建和分析病原菌-宿主蛋白相互作用网络； 3） 进行病原和宿主相互作用蛋白的结构免疫学研究； 4） 研究重要的病原菌和宿主相互作用蛋白调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制 5. 研究泛素化或类泛素化蛋白等修饰调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制； 1） 研究一类具有重要免疫调控功能的宿主泛素系统中的关键分子在病原菌侵入及胞内存活过程中的调控作用及其分子机制； 2）探寻与胞内菌在宿主巨噬细胞中的存活相关的新的泛素连接酶，并研究其免疫调控功能和分子机制； 3）发现与宿主泛素及类泛素化系统相关分子相互作用的病原菌蛋白分子，并研究其调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制； 4）研究胞内菌中含pupylation修饰的蛋白酶体底物蛋白分子与宿主的泛素及类泛素系统相关分子间的相互作用及其调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制； 5）泛素及类泛素系统关键分子及其相互作用蛋白的结构免疫学研究 6. 研究胞内病原菌干扰宿主免疫细胞的功能及分子机制： 1） 检测临床结核杆菌感染病人肺巨噬细胞功能的变化及对信号通路的影响； 2） 研究重要差异分子对巨噬细胞功能的影响及调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制； 3）检测临床结核菌感染病人cd4+t细胞功能的分化及对信号通路的影响； 4） 研究重要差异分子对cd4+t细胞功能的影响及通过cd4+t调控病原菌侵入巨噬细胞及胞内存活的分子机制；二、预期目标总体目标 以重要胞内病原菌土拉杆菌，结核杆菌和鼠疫菌为模型，阐明胞内病原菌侵入宿主细胞的分子调控机制；阐明胞内病原菌在宿主细胞内存活的分子调控机制；阐明胞内病原菌因子如何与宿主因子相互作用干扰宿主免疫信号通路的分子机制；发现诊断与治疗病原菌的新靶点，为控制病原菌感染和提高病原菌感染相关疾病的治愈率奠定基础。同时在病原菌-宿主相互作用的研究领域为我国培养一批优秀人才。 五年预期目标1.发现和确定一些新的调控病原菌侵入宿主细胞的分子机制； 2.发现和确定一些新的调控病原菌在宿主细胞内存活的分子机制; 3.发现和确定一些病原菌和宿主相互作用中的新的关键信号转导分子；4.通过培养硕士、博士研究生和博士后，扶植一批在病原菌-宿主相互作用研究领域具有国际竞争力的优秀中青年科学家，造就一支结构合理的具备攻坚能力的国际先进水平研究队伍。 5.以研究论文和独立开发的技术成果（专利）的形式公布项目研究成果，五年内sci论文50篇左右，其中影响因子大于5的学术论文30篇左右，争取在国际高水平刊物（影响因子大于10）上发表论文4-6篇, 在国际顶尖杂志cell, nature或science上发表论文，并申报专利3-5项。三、研究方案学术思路 病原菌的感染性和致病力是病原菌-宿主免疫系统间相互作用的结果。而胞内病原菌侵入宿主细胞，胞内存活及干扰宿主的免疫信号通路的调控机制极其复杂，提示病原细菌必然通过大量与宿主因子的相互作用来干扰免疫细胞的信号通路，从而侵入细胞并抑制宿主细胞吞噬溶酶体途径、炎症小体的形成、自噬、炎症等过程来实现其在胞内存活。本项目针对国家战略需求，瞄准国际科学前沿和本领域中的关键科学问题，通过发挥我们已有研究工作基础以及各课题组研究队伍的技术特点和优势，在基因水平、蛋白质水平、细胞水平和整体水平上，综合应用分子生物学、分子遗传学、细胞生物学、生物化学、结构免疫学、以及系统生物学等多学科交叉手段，以重要胞内病原菌土拉杆菌，结核杆菌和鼠疫菌为研究对象，系统地筛选鉴定与病原菌侵入细胞，胞内存活相关的病原菌致病因子和宿主因子，并在分子水平上研究病原菌和宿主的功能非编码rna和蛋白质的相互作用，病原-宿主之间的蛋白的相互作用，及泛素及类泛素化蛋白修饰等如何调控宿主细胞的免疫信号通路从而影响免疫细胞的功能以调控病原菌进入宿主细胞并在胞内存活，及在感染动物水平和临床感染水平上研究这些病原菌因子与宿主因子的相互作用对病原菌的感染性和致病力的调控作用的分子机制（图一），这些研究将不仅能发现其胞内病原菌与宿主互作中的新的作用机制；而且能为诊断和防治传染性病原菌疾病提供新的药物靶点和重要的理论基础。 技术途径及创新性技术途径 本项目在总体目标的架构下分为六个主要的课题方向（见课题设置），各课题方向的主要技术途径总结如下： 课题一：1）研究分析一些宿主关键免疫分子对胞内病原菌感染的调控的分子机制 利用宿主细胞的一些模式识别受体如tlr2, tlr4, tlr7, tlr9，card9, nod2, nlp3等，及宿主免疫系统中的一些关键受体信号转导分子如shp-1, shp-2, il-17, mkp-5, -arrestin1, -arrestin2等基因敲除小鼠分离巨噬细胞来 图一：重要病原菌与宿主相互作用分子机制的研究示意图 感染土拉杆菌，结核杆菌或鼠疫菌以检测分析其对病原菌侵入及存活信号通路机制的影响；进一步利用基因敲除小鼠感染模型来检测分析其感染病原菌后的存活，细胞因子和免疫细胞亚群数量的变化及功能；选择调控胞内菌致病性的关键受体或分子进一步以细胞转染模型，rna干扰，抗体封闭，westernblot，酵母双杂交等手段来检测这些宿主分子如何调控胞内菌侵入和存活的免疫信号通路机制；2）基因组rnai技术筛选和分析与胞内菌侵入或存活相关的宿主细胞因子 用转入gfp或报告基因质粒的胞内菌如土拉杆菌或鼠疫菌感染经过基因组nai转染的巨噬细胞，然后在30分钟或6小时后通过荧光扫描，报告基因分析或细菌培养和计数分析侵入巨噬细胞中的胞内菌及在巨噬细胞中存活的胞内菌数量；对筛选到的候选基因通过新一轮的rnai和胞内菌感染实验进行确定；选择3-6个巨噬细胞表面细胞受体或关键信号转导分子进行重点研究；通过rnai或基因敲除后研究其胞内菌在侵入和胞内存活的作用机制；用基因敲除小鼠感染模型研究其在土拉杆菌或鼠疫菌感染致病过程的作用机制。 课题二: 1）筛选和分析与土拉杆菌侵入或存活相关的病原菌致病因子 以土拉杆菌为模型，采用转座子插入突变方法，构建该菌的随机突变文库。将土拉杆菌突变株文库中突变株分别感染体外培养巨噬细胞，通过细菌培养和计数筛选出有侵入/存活缺陷突变株； 选择与细菌侵入/存活有关的细菌外膜蛋白和主要表面结构成分进行重点研究，利用大肠杆菌表达和纯化蛋白制备特异性抗体，采用免疫共沉淀分离宿主细胞膜上相应的受体蛋白电泳分析纯化后进行质谱分析；采用rna干扰技术、细胞转染技术及共聚焦显微分析技术确定受体表达对细菌感染的影响。进一步通过基因mrna检测、免疫组化染色等确定受体分子在小鼠组织和细胞中的分布；通过检测受体相关细胞信号传递和细胞反应，阐明细菌源配体在土拉杆菌感染治病过程中的作用机制；选择主要的细菌黏附蛋白，结合生物信息分析和预测，合成或表达不同长短的多肽片段确定配体分子中与受体结合的关键区域。 2）土拉杆菌致病相关基因的筛选与研究 在巨噬细胞感染模型中，采用包括生物信息学、转录组学， 蛋白组学和胞内差异荧光筛选等手段， 在土拉杆菌基因组范围内，高通量地分析菌体分泌蛋白在宿主细胞中的诱导表达。针对在宿主细胞内特异表达的靶蛋白，将对其编码基因采用敲除、互补等遗传分析方法，构建相应的基因工程菌株，并结合质粒转染表达以及microarray等技术，在相关的细胞模型和动物模型中，进一步鉴定和确认靶蛋白与土拉杆菌的胞内生存是否相关；通过细胞转染技术，在宿主细胞模型中表达土拉杆菌致病相关蛋白。利用rt profiler pcr arrays技术，研究病原菌致病相关蛋白对宿主细胞不同信号传导途径的影响，包括细胞因子与炎症反应（cytokine and inflammation）、自体吞噬、ship、nfkb 以及 pi3kakt 信号传导等途径。同时采用 elisa、multiplex facs、elispot以及western blot等手段，验证pcr arrays的分析结果。结合崭新的 反转录病毒介导的蛋白互补方法”与酵母双杂交系统，在基因组范围内，筛选与土拉杆菌重要致病相关蛋白作用的宿主细胞蛋白。 进一步用蛋白质标记、免疫沉淀以及相关蛋白质组学等方法，验证土拉杆菌蛋白与宿主细胞蛋白间的特异结合反应， 并采用rna干扰和抗体干扰等技术，阐明宿主细胞蛋白在土拉杆菌感染中的应答及信号路调控机制；利用荧光标记、免疫组化 以及细胞实时成像（realtime imaging）等技术， 研究土拉杆菌在胞内所分泌蛋白的定向运输和分布定位，从“时空”角度分析土拉杆菌致病蛋白与宿主细胞相关蛋白的相互作用，从而了解在宿主细胞内生存的机制。课题三：1）大规模地发现与结核病相关的病原菌（结核菌）和宿主（小鼠）新的非编码rna以结杆核菌为模型，用结杆核菌标准株h37rv感染小鼠，分别提取宿主不同组织（肺，淋巴，脾，肝）总rna，进行rna-seq测序分析非编码rna的差异表达分析和定量蛋白质组学分析蛋白质的差异表达；从生物体内特异提取非编码rna,并利用纯化的ncrna建立非编码rna的文库；通过高通量、快速的短串rna测序技术对文库进行测序,发现候选的新的非编码rna。经过northern验证和生物信息分析确认该病原和病原感染后病原与宿主差异表达的非编码rna的信息。2）从实验和理论两方面同时研究非编码rna在病原与宿主互作中的分子机制运用系统生物学和生物信息学的方法如：靶分子预测方法等或分子垂钓方法来寻找与这些差异表达的非编码rna分子可能发生相互作用的病原或宿主的蛋白质；在分子水平上研究rna和蛋白质的相互作用；在细胞水平上，用敲除、过量表达和干扰的方法研究非编码rna对相关基因表达的调控功能；在整体动物水平上，构建缺陷或过量表达非编码rna的菌株感染小鼠比较致病性等情况来研究非编码rna的功能。3）构建有非编码rna-蛋白相互作用网络并研究其在结核杆菌感染过程中的调控作用 根据前两步的试验结果，将存在相互作用的非编码rna和蛋白质组成一类新的网络。然后使用传统的或我们建立的复杂网络分析方法提取其数学、物理特征，进而研究其生物学含义。 课题四：1）筛选和文献挖掘病原菌-宿主相互作用蛋白 以鼠疫菌为模型，挑选100-200个鼠疫菌毒力相关蛋白构建诱饵载体，采用高通量酵母双杂交技术平台筛选与鼠疫菌蛋白相互作用的宿主蛋白；对鼠疫菌蛋白与宿主蛋白相互作用进行其它技术的验证，保证数据集的可靠性；同时收集文献中报道的鼠疫菌与宿主蛋白相互作用信息。2）构建和分析病原菌-宿主蛋白相互作用网络 利用获得的蛋白相互作用信息构建鼠疫菌蛋白-宿主蛋白相互作用网络，并对鼠疫菌的相互作用网络进行比较分析，发现病原细菌与宿主相互作用的共性和与不同病原菌特有的临床症状密切相关的特性，从全局的视角分析病原-宿主的蛋白相互作用。3）病原菌和宿主相互作用蛋白的结构免疫学研究 挑选3-6个可能在鼠疫菌侵入及胞内存活过程中发挥重要作用的相互作用蛋白，应用原核（如大肠杆菌bl21）和真核（如酵母rjd941或昆虫细胞等）体系表达并纯化，研究它们之间形成的复合体的晶体结构和功能；4）深入揭示重要的病原和宿主相互作用的对致病机制的调控 挑选3-6个可能在鼠疫菌侵入及胞内存活过程中发挥重要作用的相互作用对进行深入的研究。采用细胞感染试验（包括宿主细胞对细菌的粘附和吞噬实验）、蛋白相互作用的分子生物学手段（包括免疫荧光实验、gst-pull down、定点突变、rnai、基因敲除与互补、功能表型分析、蛋白激酶活性实验等）开展鼠疫菌致病机制及信号通路调控机制的研究，揭示这些相互作用的分子机制及其生物学意义。 课题五: 1）研究cbl-b、itch和nrdp1等这一类具有重要免疫调控功能的宿主泛素系统中的关键分子在胞内菌侵入及胞内存活过程中的调控作用及其分子机制包括：应用酵母双杂交和免疫共沉淀等方法寻找这些泛素修饰酶在病原菌和宿主中的新的相互作用蛋白分子；利用遗传突变、rna干扰和过表达、co-ip、western blot、体外泛素化反应等技术和方法在抑制或过量表达泛素或类泛素酶的情况下，研究底物蛋白分子泛素及类泛素化修饰的水平、互作、定位及降解特性等的改变来确证它们是否为泛素或类泛素酶的底物（包括被降解的底物或功能被调控的底物），或在病原菌感染过程中与泛素和类泛素酶相互作用而调控后者的功能（如我们在前期研究中发现：泛素连接酶nrdp1的一种新的相互作用蛋白nip可促进nrdp1介导的底物泛素化）；应用细胞感染模型（如鼠巨噬细胞j774a.1等）、以及转基因和/或基因敲除小鼠动物感染模型进一步研究这些泛素及类泛素酶在胞内菌侵入及胞内存活过程中的调控作用及其相关的免疫信号通路等分子机制等； 2）探寻与土拉杆菌、结核杆菌、鼠疫杆菌等胞内菌在宿主巨噬细胞中的存活相关的新的泛素连接酶，并研究其免疫调控功能和机制 包括：应用针对泛素连接酶的sirna库等策略筛选与上述胞内菌在宿主巨噬细胞中的存活相关的新的泛素连接酶；以重组蛋白的形式对其进行表达，检测其在细胞外泛素化体系中的泛素连接酶活性，寻找其相互作用蛋白；利用质谱等方法确定蛋白质修饰的类型及位点；利用双向电泳等方法研究蛋白质功能，利用 mald1tof飞行质谱等筛选和分析蛋白质间的相互作用；进一步在细胞感染模型（如鼠巨噬细胞j774a.1等）、以及转基因/或基因敲除小鼠动物感染模型中研究其生物学功能；3）探寻土拉杆菌、结核分枝杆菌、鼠疫杆菌等胞内菌中与宿主泛素及类泛素化系统相关分子相互作用的效应蛋白分子，并研究其免疫调控功能和机制应用生物信息学等方法预测上述胞内菌基因组中与ospf、 chbp和cif等同源或类似的效应蛋白；应用酵母双杂交和免疫共沉淀等方法寻找这些细菌效应蛋白是否可与宿主的泛素及类泛素系统中的分子相互作用；应用遗传突变、rna干扰和过表达，以及western blot等技术研究这些效应蛋白对宿主泛素及类泛素酶功能的调控作用（包括对其进行磷酸化、泛素化或去泛素化等修饰）；并进一步细胞感染模型（如鼠巨噬细胞j774a.1等）、以及转基因和/或基因敲除小鼠动物感染模型中研究其生物学功能等；4）探寻结核分枝杆菌中含pupylation修饰的蛋白酶体底物蛋白分子与宿主的泛素及类泛素系统相关分子间的相互作用及其免疫调控功能应用酵母双杂交和免疫共沉淀等方法探寻结核分枝杆菌中发现的含pupylation修饰的蛋白酶体底物（如fabd，panb，mpa，phoh2，icl，mtra和inol等）是否可与其宿主中的泛素及类泛素系统中的关键分子（如e3s等）相互作用；利用遗传突变、rna干扰和过表达等技术，确证这些结核分枝杆菌中含pupylation修饰的蛋白分子是否为宿主中特定泛素或类泛素酶的底物，还是对宿主中的泛素或类泛素酶的功能进行调控；应用细胞感染模型（如鼠巨噬细胞j774a.1等）等进一步研究这些结核分枝杆菌来源的分子对宿主免疫过程的调控功能；5）泛素及类泛素系统关键分子及其相互作用蛋白的结构免疫学研究应用原核（如大肠杆菌bl21）和真核（如酵母rjd941或昆虫细胞等）体系表达并纯化上述一系列研究中发现的土拉菌、结核分枝杆菌、鼠疫杆菌等胞内菌感染过程中起免疫调控作用的泛素及类泛素系统关键分子，以及它们与宿主和病原菌中的相互作用蛋白形成的复合体的晶体结构和功能。 课题六: 1）检测临床结核病人肺巨噬细胞功能的变化及对信号通路的影响 以结核杆菌为模型，用吞噬试验检测分析临床结核菌感染病人和正常人肺巨噬细胞的吞噬能力的变化；用rt-pcr，酶标法和转录组学检测分析重要细胞因子如tnf，il-6,8,12产生能力的差异；用蛋白组学和磷酸化蛋白组学检测分析肺巨噬细胞中蛋白表达和信号通路蛋白的差异。2）研究重要差异分子对巨噬细胞功能的影响及调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制 挑选3-6个差异蛋白分子，进行rnai干扰巨噬细胞来检测其对巨噬细胞的吞噬能力，细胞因子产生能力，巨噬细胞的凋亡及结核杆菌在巨噬细胞内存活的影响，和关键信号通路的的变化；用酵母双杂或gst-pulldown加质谱分析来研究其相互作用蛋白及作用机制；利用小鼠基因敲除来研究结核菌感染后致病性及细胞功能的差异。3）检测临床结核菌感染病人cd4+ t细胞分化的及对信号通路的影响 用细胞流式检测结核菌感染病人胸膜液和外周血液中的th22、th9、th10、th17细胞和treg细胞相对于正常人的表达变化；以及用rt-pcr和酶标检测影响cd4+t细胞分化和扩增的各种细胞因子如tgf-、il-1、il-4、il-6、il-21以及il-23等；利用体外共培养分析cd4+ t细胞对结核菌侵入巨噬细胞和胞内存活的影响及机制；用蛋白组学和磷酸化蛋白组学 检测分析结核菌感染病人cd4+ t细胞中蛋白表达及信号通路蛋白相对于正常人的变化。4）研究重要差异分子对cd4+ t细胞功能的影响及通过cd4+ t调控病原菌侵入巨噬细胞及胞内存活的分子机制 挑选3-6个差异蛋白分子，进行rnai干扰cd4+ t细胞来检测对t细胞的分化，细胞因子产生能力等的影响及信号通路机制；利用体外共培养分析cd4+ t细胞对结核菌侵入巨噬细胞和胞内存活的影响及信号通路机制；利用小鼠基因敲除来研究结核菌感染后致病性及细胞功能的差异；用酵母双杂或gst-pulldown加质谱分析来研究其相互作用蛋白及作用机制。创新性 （1）关键问题的创新性：以我国人口健康重大需求为导向，瞄准国际科学前沿，凝练研究目标。我们将关键问题集中在发现和鉴定新的病原菌因子和宿主因子，并研究病原菌蛋白和宿主蛋白相互作用网络，非编码rna和蛋白相互作用，泛素及类泛素系统中的关键分子及与其相互作用的蛋白分子在人类重要胞内病原菌包括土拉杆菌、结核杆菌和鼠疫菌等感染过程中的免疫调控作用及分子机制，重点发现和研究新的病原菌因子和宿主因子，新的调控机制，为病原菌传染性疾病防治提供新的治疗靶点和新的理论基础。 （2）研究技术的创新性：本研究主要利用已知基因组序列、遗传背景清楚的重要胞内病原菌为研究对象，选用多种研究模型，包括多种原代细胞和传代细胞系、转基因和基因敲除动物模型，和临床样本，使用基因组rnai筛选，转录组学，蛋白组学，病原菌基因的转座子突变库筛选，病原菌蛋白和宿主蛋白相互作用网络分析，细菌非编码rna及相关蛋白的系统发现技术及功能研究等这些创新的技术手段对于阐明关键病原菌因子和宿主因子在病原菌感染过程中的生物学功能，探索药物靶标，进而预防和治疗病原传染疾病，具有十分重要的现实意义。 （3）研究方法的系统性：综合运用分子生物学、分子遗传学、细胞生物学、生物化学、结构免疫学、生物信息学和系统生物学等多学科交叉手段对关键的病原菌因子和宿主因子及其动态互作的分子机理进行全面系统研究，实现多学科研究的优势互补和有机整合。 （4）研究方案的灵活性：突破国内外将病原菌与宿主相互作用的研究局限于单一蛋白上面，从非编码rna，蛋白，蛋白修饰等多系统地研究功能研究集中于单个蛋白研究的框架，分析泛素化及类泛素化系统中关键蛋白的多种修饰和多种蛋白间的动态相互作用，注重各种修饰的竞争与促进作用，针对不同蛋白相互作用，针对性地采用不同的研究方法。 （5）基础与临床研究相结合：密切围绕我国人口健康的关键问题，充分利用我国的研究团队的研究优势和丰富的临床资源，注重系统集成和分子机理研究，从分子，细胞，动物模型和临床感染等不同层次上对一些关键的病原菌因子和宿主因子的功能和动态互作的分子调控机制进行系统、全面、深入的阐明。同时，寻找和鉴定一些有重要应用前景的药物靶点，提出有效、可行的治疗新策略。 （6）多学科的交叉综合 该项目整合了我国病原菌及免疫学相关研究领域的优势实验室，联合攻关，较好地体现了多学科的交叉综合研究优势。 可行性分析 1.参加项目的各个课题组，近几年来在病原菌和宿主相互作用及信号通路研究方面积累了丰富的经验，研究成果多次在cell, science, nature immunol, cell host & microbe, pnas, immunity, mol. cell, nature structural & molecular biology等国际一流杂志上发表论文（详见“研究队伍”）。如，1）邵峰教授在揭示细菌分泌的效应蛋白如何干扰宿主细胞重要信号转导通路方面已经取得了一系列的重要突破（science, 2007，通信作者; cell host & microbe, 2007，通信作者；mol. cell, 2007通信作者，nature structural & molecular biology, 2008，通信作者，pnas 2009通信作者，science, 2010，通信作者）；2）戈宝学教授在固有免疫信号通路调控方面已经取得了不少进展，（science, 2002， 第一作者，nature immunology, 2008, 通信作者， cell host & microbe, 2009，通信作者，ji, 2010，通信作者)。 2.参加项目的各个课题组已经建立了各种分子、细胞生物学、生物化学和结构免疫学和临床研究等研究平台，以及基因组rnai高通量筛选，非编码rna提取分析，蛋白相互作用的高通量筛选等技术平台，建立了各种细胞培养和动物感染模型，具有丰富的材料资源和完善的技术平台。 3.学术梯队结构合理，各研究组都有各自的研究特点，并在所用模式生物、研究手段和所关注的问题上构成了一个彼此互补、相互关联的研究队伍，为联合研究病原菌和宿主相互作用的分子机制创造了得天独厚的条件。 4.本项目依托军科院微生物所及病原生物与生物安全国家重点实验室，中科院生物物理所及生物大分子国家重点实验室，中科院微生物所及中科院病原微生物与免疫学重点实验室，中科院上海生化所及中科院分子细胞生物学重点实验室，中国农业大学及农业部人畜共患病重点开放实验室，同济大学及上海市结核病（肺）重点实验室，清华大学、北京生命科学研究所、武汉大学、华中科技大学同济医学院和南开大学，在实验所需的公共平台、大型仪器及生物安全实验室等方面都能得到很好的保障，完全可以保证本申请的实验需要。 总之，本项目依靠创新的学术思想、严密的课题设计、优秀的研究团队和良好的科研支撑条件，综合开展病原菌感染防治的基础研究，重点揭示胞内病原菌和宿主免疫系统在非编码rna水平上，蛋白相互作用，蛋白修饰等水平上的相互作用的分子机制以及其对胞内病原菌侵入细胞，胞内存活，及动物感染和临床病人感染的影响。所获得的研究结果将为病原菌感染相关疾病的治疗和药物开发奠定源头创新的基础。此外，本项目的实施也将大大提升我国在病原菌和宿主相互作用研究与开发的自主创新能力。课题设置 课题间关系 病原菌和宿主相互作用是一个非常复杂的调控过程，需要加强对病原菌致病因子如何通过影响宿主免疫系统中的关键分子的研究。不仅要发现新的病原菌致病因子和宿主关键分子，而且要研究它们的相互作用及对胞内病原菌侵入细胞，胞内存活，及动物感染和临床病人感染致病机制的相关性。我们的课题设臵试图整合我国的不同模式的优势学科和优势实验室，发挥各系统的优势，弥补其不足，力争快速取得一批具有源头创新的重大成果，提升我国病原菌和宿主相互作用的研究水平和国际竞争力。 本项目设臵六个有机联系的课题， 六个课题以病原菌和宿主相互作用为主线，研究其分子机制和功能，每个课题各有侧重，充分发挥不同的独特优势，技术上优势互补，取得的结果相互借鉴，课题间相互支持，紧紧围绕关键科学问题，共同做好研究。课题1 ： 病原菌侵入免疫细胞及胞内存活相关的宿主因子的发现及机制研究 研究目标： 本课题五年内预计发现一批与病原菌侵入和胞内存活相关的关键宿主因子并确定其功能机制；发表sci论文1215篇、培养博士生4-5名、申请专利1-2个、建立一支有国际竞争力的研究队伍。 研究内容： 以细胞转染模型，rna干扰，抗体封闭，转基因和基因敲除小鼠等手段来确定宿主细胞的一些模式识别受体如tlr2, tlr4, tlr7, tlr9，nlp3等，及宿主免疫系统中的一些关键受体信号转导分子如shp-1,shp-2,mkp-5, -arrestin1, -arrestin2等在土拉杆菌和鼠疫菌感染过程中的功能和作用机制；利用基因组rnai技术来高通量筛选与土拉杆菌和鼠疫菌侵入或存活相关的宿主细胞因子，重点研究一些新的宿主细胞蛋白分子的定位、转运、修饰、与已知病原菌侵入或存活相关的病原菌致病因子和宿主细胞因子之间的相互作用，利用细胞感染模型研究这些宿主蛋白对胞内病原菌侵入或存活不同步骤的影响及作用机制，在转基因小鼠和基因敲除小鼠感染模型上来阐明这些宿主蛋白分子对病原菌侵入及胞内存活的影响，并通过小鼠基因敲除小鼠感染模型研究这些宿主蛋白分子调控胞内病原菌的致病机制。 经费比例： 15% 承担单位： 同济大学、中国科学院上海生命科学研究院 课题负责人： 戈宝学 学术骨干： 刘小龙、戴亚蕾课题2 ： 侵入免疫细胞及胞内存活相关的病原菌致病因子的发现及机制研究 研究目标： 本课题五年内预计筛选发现一批与土拉菌侵入和胞内存活相关的土拉菌致病因子并确定其功能机制；发表sci论文10-12篇、培养博士生4-5名、硕士生6名申请专利1-2个。 研究内容： 利用土拉杆菌转座子文库筛选影响病原菌侵入和胞内存活的毒力基因；从“时空”角度分析病原菌致病蛋白在宿主细胞内的运输、定位、化学修饰以及对宿主细胞不同信号传导途径及功能的影响；在基因组范围内，筛选与土拉杆菌重要致病相关蛋白存在可能相互作用的宿主细胞蛋白，阐明宿主细胞应答土拉菌感染的分子基础；利用细胞感染模型研究病原菌致病蛋白对病原菌侵入和胞内存活不同过程的影响；通过相应的转基因小鼠和基因敲除小鼠感染模型阐明病原菌致病蛋白对胞内菌感染致病的调控机制。 经费比例： 15% 承担单位： 中国农业大学、南开大学、清华大学 课题负责人： 苏敬良 学术骨干： 金守光、张敬仁课题3 ： 非编码rna-蛋白相互作用调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制研究 研究目标： 本课题五年内预计在结核菌及小鼠中系统地发现总数量不少于一千个新的非编码rna并鉴定出和研究一些在结核菌侵入和胞内存活中起关键调控作用的非编码rna及其靶分子的功能机制；构建出一种由非编码rna和蛋白质共同构成的生物网络网络及分析其特征和生物学含义。发表sci论文10-15篇，培养博士生10名，申请专利1-2个。培养一支在国际国内有竞争力的研究队伍。 研究内容： 系统地发现与结核菌和鼠疫菌感染相关的病原菌（结核菌和鼠疫菌）和宿主（小鼠）新的非编码rna及其基因；基于大量新发现的非编码rna，重点选取结核菌或鼠疫菌入侵前后明显差异表达的非编码rna为研究对象，运用系统生物学和生物信息学的方法寻找与这些差异表达的非编码rna分子可能发生相互作用的病原或宿主的蛋白质；在分子水平上研究rna和蛋白质的相互作用；在细胞水平上，用敲除、过量表达和干扰的方法研究非编码rna对相关基因表达的调控功能；在整体动物水平上，构建缺陷或过量表达非编码rna的菌株感染小鼠比较致病性等情况来研究非编码rna的功能；基于上述结果构建有非编码rna-蛋白相互作用网络并研究在结核菌和鼠疫菌感染过程中的调控机制。 经费比例： 15% 承担单位： 中国科学院水生生物研究所、中国科学院物理研究所 课题负责人： 葛峰 学术骨干： 毕利军课题4 ： 构建和分析病原菌致病力蛋白-宿主蛋白相互作用网络及功能 研究目标： 本课题五年内预计获得一批鼠疫菌与宿主蛋白相互作用对，并构建病原菌-宿主蛋白相互作用网络，确定其中以3-6对鼠疫菌-宿主蛋白调控病原菌侵入和胞内存活等方面的分子机制，发表510篇sci论文，培养36名博士和612名以上硕士，申请专利1-2个。 研究内容： 根据目前对于鼠疫菌致病机制和与宿主相互作用的现有认识，挑选100-200个可能参与病原与宿主相互作用的蛋白为诱饵。采用高通量酵母双杂交技术平台筛选病原蛋白与人蛋白之间的相互作用；对相互作用对进行其它技术的验证，保证数据集的可靠性；同时收集文献中报道的鼠疫菌与宿主相互作用信息。利用获得的蛋白相互作用信息构建病原-宿主蛋白相互作用网络。并对鼠疫菌的相互作用网络进行比较分析，发现病原细菌与宿主相互作用的共性和与不同病原菌特有的临床症状密切相关的特性，从全局的视角分析病原-宿主的蛋白相互作用。针对鼠疫菌的致病特性，挑选3-6个可能在细菌致病过程中发挥重要作用的相互作用对进行深入的研究。采用细胞感染试验（包括宿主细胞对细菌的粘附和吞噬实验）、蛋白相互作用的分子生物学手段（包括免疫荧光实验、gst-pull down、定点突变、rnai、基因敲除与互补、功能表型分析、蛋白激酶活性实验等）开展鼠疫菌致病机制的研究，揭示这些相互作用的分子机制及其生物学意义。 经费比例： 14% 承担单位： 中国人民解放军军事医学科学院、武汉大学 课题负责人： 杜宗敏 学术骨干： 吴旻课题5 ： 泛素化或类泛素化等蛋白修饰调控病原菌侵入及胞内存活的机制研究 研究目标： 本课题五年内预计发现和确定一批泛素及类泛素化关键修饰酶及其相互作用蛋白（包括底物和调控因子）调控获病原菌侵入和胞内存活等方面的分子机制。发表高水平sci论文（影响因子5以上）5-10篇；并申请专利1-3项；培养优秀青年科研骨干及学术带头人3人以上、研究生（包括硕士和博士生）和博士后10人以上。 研究内容：利用酵母双杂交和免疫共沉淀等方法寻找cbl-b、itch和nrdp1等泛素修饰酶在病原菌和宿主中的新的相互作用蛋白分子；研究底物蛋白分子泛素及类泛素化修饰的水平、互作、定位及降解特性等的改变来确证它们是否为泛素或类泛素酶的底物（包括被降解的底物或功能被调控的底物），或在病原菌感染过程中与泛素和类泛素酶相互作用而调控后者的功能（如我们在前期研究中发现：泛素连接酶nrdp1的一种新的相互作用蛋白nip可促进nrdp1介导的底物泛素化）；应用细胞感染模型（如鼠巨噬细胞j774a.1等）、以及转基因和/或基因敲除小鼠动物感染模型进一步研究这些泛素及类泛素酶在宿主免疫应答及免疫耐受过程中的调控作用及其相关的免疫信号通路等分子机制等； 应用针对泛素连接酶的sirna库等策略筛选与上述胞内菌在宿主巨噬细胞中的存活相关的新的泛素连接酶；以重组蛋白的形式对其进行表达，检测其在细胞外泛素化体系中的泛素连接酶活性，寻找其相互作用蛋白；利用质谱等方法确定蛋白质修饰的类型及位点；利用双向电泳等方法研究蛋白质功能，利用 mald1tof飞行质谱等筛选和分析蛋白质间的相互作用；进一步在细胞感染模型（如鼠巨噬细胞j774a.1等）、以及转基因/或基因敲除小鼠动物感染模型中研究其生物学功能；应用生物信息学等方法预测上述胞内菌基因组中与ospf、 chbp和cif等同源或类似的效应蛋白；应用酵母双杂交和免疫共沉淀等方法寻找这些细菌效应蛋白是否可与宿主的泛素及类泛素系统中的分子相互作用；并研究这些效应蛋白对宿主泛素及类泛素酶功能的调控作用（包括对其进行磷酸化、泛素化或去泛素化等修饰）；并进一步细胞感染模型（如鼠巨噬细胞j774a.1等）、以及转基因和/或基因敲除小鼠动物感染模型中研究其生物学功能等；应用酵母双杂交和免疫共沉淀等方法探寻结核分枝杆菌中发现的含pupylation修饰的蛋白酶体底物（如fabd，panb，mpa，phoh2，icl，mtra和inol等）是否可与其宿主中的泛素及类泛素系统中的关键分子（如e3s等）相互作用；确证这些结核分枝杆菌中含pupylation修饰的蛋白分子是否为宿主中特定泛素或类泛素酶的底物，还是对宿主中的泛素或类泛素酶的功能进行调控；应用细胞感染模型（如鼠巨噬细胞j774a.1等）等进一步研究这些结核分枝杆菌来源的分子对宿主免疫过程的调控功能；应用原核（如大肠杆菌bl21）和真核（如酵母rjd941或昆虫细胞等）体系表达并纯化上述一系列研究中发现的土拉菌、结核分枝杆菌、鼠疫杆菌等胞内菌感染过程中起免疫调控作用的泛素及类泛素系统关键分子，以及它们与宿主和病原菌中的相互作用蛋白形成的复合体的晶体结构和功能。 经费比例： 26% 承担单位： 中国科学院微生物研究所、北京生命科学研究所 课题负责人： 刘翠华 学术骨干： 邵峰、米凯霞课题6 ： 研究胞内病原菌干扰宿主免疫细胞的功能及信号通路机制 研究目标：本课题五年内预计发现一批调控巨噬细胞和t细胞功能的关键蛋白分子并确定其调控获病原菌侵入和胞内存活等方面的分子机制。培养硕/博士生5-10人，发表高水平sci论文（影响因子5以上）10-15篇；并申请专利1-3项。 研究内容：检测分析临床结核杆菌感染病人和正常人肺巨噬细胞的吞噬能力的变化及重要细胞因子如tnf，il-6,8,12产生能力的差异；用蛋白组学和磷酸化蛋白组学检测分析蛋白表达和信号通路的差异；挑选3-6个差异明显的蛋白分子，利用过表达， rnai或基因敲除小鼠研究这些关键蛋白分子在结核杆菌感染后对巨噬细胞功能及病原菌侵入宿主细胞和胞内存活的调控机制；同时用酵母双杂交或gst-pulldown加质谱分析来研究其相互作用蛋白及作用机制；检测结核菌感染病人胸膜液（tpe）及外周血中的th22、th9、th10、th17细胞和treg细胞相对于正常人的表达变化；以及用rt-pcr和酶标检测影响cd4+ t细胞分化和扩增的各种细胞因子如tgf-、il-1、il-4、il-6、il-21以及il-23等；用蛋白组学和磷酸化蛋白组学检测分析结核病人cd4+ t细胞信号通路蛋白相对于正常人的变化；利用rna干扰或基因敲除小鼠来研究这些关键蛋白分子在结核杆菌感染过程中对cd4+ t细胞的分化及功能的影响机制；用酵母双杂或gst-pulldown加质谱分析来研究其相互作用蛋白及作用机制。 经费比例： 15% 承担单位： 华中科技大学、同济大学 课题负责人： 施焕中 学术骨干： 胡忠义、唐神结四、年度计划研究内容预期目标第一年1. 利用细胞感染模型分析和确定一些已知的宿主细胞关键受体及关键信号转导分子等对胞类病原菌侵入及存活信号通路机制的影响; 2. 利用基因组rnai技术筛选和分析与胞内菌侵入或存活相关的宿主细胞因子；3. 构建胞内菌的随机突变文库；4. 分析在结核菌感染的小鼠不同组织中非编码rna的差异表达及蛋白质的差异表达；5. 建立非编码rna的文库；发现候选的新的非编码rna并分析确认该病原和病原感染后病原与宿主差异表达的非编码rna的信息；6. 以鼠疫菌为模型，挑选100-200个鼠疫菌毒力相关蛋白构建诱饵载体，筛选和文献挖掘病原菌-宿主相互作用蛋白；7. 研究cbl-b、itch和nrdp1等这一类具有重要免疫调控功能的宿主泛素系统中的关键分子在胞内菌侵入及胞内存活过程中的调控作用及其分子机制；8. 检测分析临床结核菌感染病人和正常人肺巨噬细胞的吞噬能力的变化；细胞因子产生能力的差异和蛋白表达和信号通路蛋白的差异；1 确定3-5个与胞内菌侵入和存活相关的已知的宿主细胞关键受体及关键信号转导分子；2 筛选出50个左右的与胞内菌侵入或存活相关的新的候选宿主细胞因子；3 建成含4000-5000个突变株的结核菌或土拉菌的转座子文库；4 在结核菌及小鼠中系统地发现总数量不少于一千个新的非编码rna；5 获得一批鼠疫菌与宿主蛋白相互作用对；6 确定一批泛素及类泛素化关键修饰酶及其相互作用蛋白（包括底物和调控因子）；7 发现一批调控巨噬细胞功能的关键蛋白分子第二年1. 进一步利用已知关键受体或信号分子基因敲除小鼠感染模型来检测分析其感染病原菌后的存活，细胞因子和免疫细胞亚群数量的变化及功能；2. 对基因组rnai筛选到的候选基因进行新一轮的筛选确定； 3. 利用突变株文库中突变株分别感染体外培养巨噬细胞，确定出侵入/存活缺陷突变株; 4. 高通量地分析菌体分泌蛋白在宿主细胞中的诱导表达;5. 寻找与这些差异表达的非编码rna分子可能发生相互作用的病原或宿主的蛋白质；6. 利用获得的蛋白相互作用信息构建鼠疫菌蛋白-宿主蛋白相互作用网络，并进行比较分析；7. 探寻与土拉杆菌、结核杆菌、鼠疫杆菌等胞内菌在宿主巨噬细胞中的存活相关的新的泛素连接酶，及与其相互作用的效应蛋白分子并研究其免疫调控功能和机制8. 挑选3-6个差异蛋白分子，研究其对巨噬细胞功能的影响及调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制。1 确定3-5个与胞内菌侵入和存活相关的已知的宿主细胞关键受体及关键信号转导分子对小鼠感染发病的调控机制；2 筛选确定出5-10个左右的与胞内菌侵入或存活相关的新的候选宿主细胞因子；3 筛选确定一批与胞内菌侵入或存活相关的结核菌或土拉菌的突变株；4 确定一批在宿主细胞中的高表达的菌体分泌蛋白；5 发现一批非编码rna分子可能发生相互作用的病原或宿主的蛋白质6 构建成鼠疫菌蛋白-宿主蛋白相互作用网络；7 确定一批新的与胞内菌在宿主巨噬细胞中的存活相关的泛素及类泛素化关键修饰酶及其相互作用蛋白（包括底物和调控因子）；8 确定3-6个关键蛋白分子对巨噬细胞功能的影响及调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制。第三年1. 选择调控胞内菌致病性的关键受体或分子进一步以细胞转染模型，rna干扰，抗体封闭，westernblot，酵母双杂交等手段来研究这些宿主分子如何调控胞内菌侵入和存活的免疫信号通路机制;2. 从第二轮rnai筛选中选择3-6个巨噬细胞表面细胞受体或关键信号转导分子进行重点研究